Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Методы классификации цитоплазматических фокусов в качестве гранул стресса млекопитающих

14.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55656

⸱

12 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Гранулы напряжения (SG) представляют собой неембранные цитоплазматические структуры, которые образуются в клетках, подверженных различным стрессам. SGs содержат мРНК, РНК-связывающие белки, небольшие рибосомальные субъединицы, факторы, связанные с трансляцией, и различные клеточные сигнальные белки. Этот протокол описывает рабочий процесс, который использует несколько экспериментальных подходов для обнаружения, характеристики и количественной оценки добросовестных SG.

Аннотация

Внезапные изменения окружающей среды часто вызываются клетками. Гранулы напряжения (SG), цитоплазматические рибонуклеопротеидные комплексы, которые образуются в клетках, подвергающихся стрессовым условиям, вовлечены в различные аспекты клеточного метаболизма и выживания. SGs модулируют клеточные сигнальные пути, посттранскрипционную экспрессию генов и программы ответа на стресс. Образование этих гранул, содержащих мРНК, непосредственно связано с клеточным переносом. Собрание СГ запускается с помощью запрещенной инициации трансляции, и разборке СГ способствует активация трансляции или ингибированное удлинение трансляции. Эта взаимосвязь дополнительно подчеркивается составом ГС. Основными компонентами SG являются заторможенные трансляционные комплексы трансляции, мРНК и выбранные РНК-связывающие белки (RBPs). Цель сборки SG - сохранить клеточную энергию путем секвестрации трансляционно застопоренной домашней мРНК, позволяющей усиленный перенос стрессоустойчивых белков. В добавленииПо отношению к основным компонентам, таким как блокировки предизайсирования прерванного перевода, SG содержат множество других белков и сигнальных молекул. Дефекты в образовании СГ могут нарушить клеточную адаптацию к стрессу и, таким образом, способствовать клеточной гибели. SG и подобные РНК-содержащие гранулы были связаны с рядом заболеваний человека, включая нейродегенеративные расстройства и рак, что привело к недавнему интересу к классификации и определению подтипов РНК-гранул. Этот протокол описывает анализы для характеристики и количественной оценки SG млекопитающих.

Введение

Клетки используют множество механизмов для ответа на стресс. Некоторые ответы происходят на посттранскрипционном уровне и включают регуляцию трансляции мРНК и / или стабильности 1 , 2 . Блокирование и деградация трансляционного движения мРНК, вызванные стрессом, связаны с образованием специфических неэмбринозных клеточных фокусов, наиболее хорошо охарактеризованными как гранулы напряжения (SGs) 3 . SG являются цитоплазматическими очагами, которые концентрируют нетранслирующие mRNPs в трансляционно-арестованных клетках, реагирующих на стресс ( например, окисление, тепловой шок, голодание от питательных веществ и вирусная инфекция) 4 . Помимо нетранслирующих мРНК, SG содержат факторы инициации трансляции, РНК-связывающие белки и различные сигнальные белки 5 . SG являются биомаркерами ингибированного трансляции белка и измененным метаболизмом РНК и связаны с выживанием и апоптозом клеток, сигнальным путемS, и ядерные процессы 5 .

SG - динамические сущности, и их формирование тесно связано со статусом клеточного перевода 6 . Несмотря на кажущийся солидный внешний вид, большинство белковых компонентов SG быстро перемещаются внутрь и наружу с временем пребывания в секундах. Хотя SGs сохраняются от нескольких минут до нескольких часов, большинство их компонентов находятся в быстром темпе. Торможение инициации трансляции и последующая разборка трансляционных полисом способствуют формированию SG; Таким образом, SGs находятся в равновесии с трансляционными полисомами. Это равновесие полисом / СГ является ключевым для отличия добросовестных СГ от других стрессовых очагов 6 , 7 .

Арест инициации трансляции влечет за собой преобразование трансляционно-компетентных пред-инициационных комплексов, которые содержат мРНК, факторы инициации трансляции (eIF) и 40S рибосомные субъединицы (s О-названные комплексы 48S) в трансляционно-заторможенные комплексы (так называемые комплексы 48S *), которые могут слипаться в SG 4 , 6 . SG стимулируются трансляционным арест на двух разных стадиях перед комплексом комплексов 48S: интерференция с функциями cap-binding eIF4F комплекса ( например, нацеливание на его субъединицу eIF4A) или фосфорилирование α-субъединицы фактора инициации трансляции eIF2, опосредованного одним Или более из четырех киназ eIF2. Наличие остановленных комплексов 48S ( то есть 40S рибосомных субъединиц и выбранных факторов инициации трансляции) является отличительным признаком 8 , 9 ПГ.

SGs были связаны с различными патологическими состояниями, такими как вирусные инфекции, нейродегенерация, аутоиммунитет и рак 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Мутированные формы нескольких компонентов СГ связаны с нейродегенеративными заболеваниями ( например, амиотрофическим латеральным склерозом), в которых нейроны обнаруживают внутриклеточные патологические включения, которые могут играть активную роль в гибели нейронов 13 . Некоторые вирусы захватывают SG-компоненты для ингибирования образования SG и усиления репликации вируса 14 . Недавние исследования также связывают СГ с раком 15 и выживаемостью раковых клеток при химио- и лучевой терапии 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Хотя такие данные вызвали большой интерес в биологии СГ, во многих опубликованных докладах отсутствуют важные средства контроля, позволяющие отличить образование добросовестных СГ от других очагов, вызванных стрессом,

Первоначально SG были описаны как неембранные цитоплазматические фокусы, состоящие из выбранных белков связывания мРНК (RBPs), включая Т-клеточный ntracellular antigen 1 (TIA-1) и Poly-A-связывающий белок (PABP); Факторы инициации трансляции; Полиаденилированная мРНК; И небольшие рибосомные субъединицы 4 , 6 , 21 , 22 . Традиционно их состав определяли с помощью таких методов, как иммунное окрашивание и эктопическая экспрессия флуоресцентно меченных белков 23 , 24 . Из-за их очень динамичной природы иммунолокализация белков SG и / или мРНК остается определяющей методологией для обнаружения ПГ 23 , 24 . На сегодняшний день многие RBPs и другие белки (более 120 различных белков) описаны как компоненты SG 11 . Так как многие SG-локализованные белки изменяют свою локализацию как в зависимости от стресса, так и независимым образом и могут накапливаться в других внутриклеточных компартментах и ​​фокусах, важно выбирать правильные маркеры SG и использовать функциональные критерии, чтобы отличать SG от других типов индуцированных стрессом фокусы. Добросовестные СГ содержат мРНК, факторы инициации трансляции и небольшие рибосомальные субъединицы и находятся в динамическом равновесии с трансляцией.

Этот простой рабочий процесс предназначен для определения того, являются ли стрессовые очаги добросовестными SGs. Этот рабочий процесс включает в себя несколько экспериментальных подходов с использованием клеток U2OS, клеток, обычно используемых для изучения ПГ. Эти клетки идеальны, так как они имеют большую цитоплазму, относительно плоские и сильно прикрепляются к покровным стеклам. Другие типы клеток могут быть использованы для изучения ПГ, но важно знать, что различия в сроках, концентрации лекарств и распространении белков с SG-нуклеацией могут изменить кинетику и составsition. Кроме того, некоторые клетки реагируют на фиксацию параформальдегида путем образования пузырьков на поверхности клеток, что приводит к появлению раздражения, которое вызывает точечную локализацию некоторых маркеров SG; Без тщательного анализа они могут быть классифицированы как SG. Это подчеркивает необходимость оценки всех критериев, необходимых для выявления очагов, вызванных стрессом, как добросовестных ПГ. В качестве стресса для экспериментов в этом протоколе используются Vinorelbine (VRB), терапевтический рак, который стимулирует SG 20 , а также арсенит натрия (SA), надежный и хорошо охарактеризованный индуктор SG.

Канонические SG содержат несколько маркеров SG (как белков, так и мРНК), которые колокализуются в цитоплазматических очагах. Этот протокол использует как иммунофлюоресценцию, так и флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) для обнаружения локализации белковых маркеров и полиаденилированной мРНК 22 соответственно. Короче говоря, косвенная иммунофлуоресценция использует антитела ( т.е.е. Первичные антитела), специфичные для данного белка, чтобы обнаружить его в клетке. Затем вторичные антитела (обычно видоспецифичные), прикрепленные к флуорохромам, распознают первичное антитело и обнаруживают локализацию целевого белка. Флуоресцентная микроскопия используется для обнаружения локализованного сигнала внутри клетки. Использование антител, продуцированных у разных видов и выявление их с помощью окрашенных вторичных антител, позволяет выявлять колокализацию множественных антител, указывая на то, что их белковые мишени находятся в одном и том же месте 23 . Важно выбрать маркеры, которые были проверены, чтобы сокоализировать на добросовестных SGs.

FISH использует меченый зонд, который основал пары с определенной РНК или последовательностью ДНК 25 . Для детектирования мРНК в этом протоколе используется биотинилированный олиго (dT) 40 зонд, который гибридизует (или пары оснований) с полиА-хвостом мРНК ( то есть polyA FISH). Затем биотинилированный зонд детектируют с использованием флуоресцентно конъюгированного стрептавидина, поскольку стрептавидин имеет высокое сродство к биотину. При оценке СГ важно соединить полиА FISH с иммунофлюоресценцией, обнаруживающей маркер СГ, как в добросовестных ИК, два сигнала должны быть колокализованными.

Используя этот протокол, колокализация оценивается несколькими способами. В многоканальном ( например, RGB: красном, зеленом и синем) изображении колокализация изменит цвет перекрывающегося сигнала ( например, красные и зеленые цвета будут казаться желтыми) 23 . Кроме того, коликализация количественно определяется графически с использованием анализа линейного сканирования, где интенсивность каждого из цветов измеряется по заданной строке 8 , 20 . Этот протокол описывает две процедуры анализа линейного сканирования, используя ImageJ 26 . Одна процедура является ручной и проходит весь процесс,Le other использует макрос, или простую программу, которая автоматизирует шаги вручную. Для понимания макропрограммы важно пройти через ручную программу.

SGs формируются в клетках, где трансляция репрессирована; Поэтому клетки с SG должны отображать пониженные уровни глобального перевода по сравнению с необработанными клетками. Экспериментально используют рибопуромицилирование. Пуромицин и эметин добавляют к клеткам в течение короткой продолжительности до фиксации, позволяя пуромицину встраиваться в активно формирующие полипептиды, вызывая окончание 27 , 28 . Лечение эметином необходимо для предотвращения повторного начала 29 . Пуромицин затем может быть обнаружен с использованием антител против пуромицина, что дает моментальный снимок активного перевода. Этот метод используется потому, что он быстрый, не требует предварительного голодания со средой, лишенной определенной аминокислоты (и потенциально преднапрягающей клетки), и раскрываетСубклеточная локализация трансляции белка. Другие методы, в частности с использованием модифицированных аналогов аминокислот, таких как L-азидохомоалин (AHA) метионина, в сочетании с химией 30 «click it it», используются для того, чтобы показать, что клетки, содержащие SGs, демонстрируют значительно более низкую трансляцию, чем соседние клетки 31 . Однако этот метод требует метионинового голодания с последующим импульсным мечением в течение 15-30 мин. Голодание метионином представляет собой дополнительный стресс, в то время как длительное время маркирования ( то есть 15-30 мин) приводит к измерению кумулятивного, а не продолжающегося трансляции, а также позволяет вновь синтезированным белкам перемещаться со своего сайта синтеза в конечный пункт назначения в пределах клетка. Напротив, рибопуромицилирование происходит гораздо быстрее и совместимо с любой средой, такой как безглюкозная среда, используемая для индуцирования SGs посредством голодания в глюкозе.

Канонические СГ находятся в динамическом равновесииС активным переводом полисом. Это можно оценить экспериментально, обработав образцы лекарственными препаратами, которые стабилизируют или дестабилизируют полисомы, тем самым опрокидывая баланс между SG и полисомами 23 . Циклогексимид (или эметин, который ведет себя аналогичным образом) блокирует удлинение, «замораживая» рибосомы на мРНК, таким образом уменьшая пул доступных неполисомных mRNP, способных образовывать SG. Экспериментально это можно использовать двумя способами: добавлением циклогексимида (или эметина) до стресса для предотвращения образования SG или добавлением циклогексимида (или эметина) после образования SG, даже не снимая нагружающего агента, вызывая разборку SG, так как она заторможена Преинитирующие комплексы медленно вводятся в полисомную фракцию. Наоборот, пуромицин вызывает преждевременное прекращение действия и способствует разборке полисом, увеличивая пул инициирующих мРНК, способных к сборке в SG. Экспериментально лечение пуромицином увеличивает количество ПГ или снижает тресколD, при котором они образуются в ответ на градуированный стресс или дозировку лекарственного средства. При оценке влияния пуромицина важно использовать субмаксимальный уровень представляющего интерес лекарственного средства, поскольку пуромицин, как ожидается, будет увеличивать действие препарата и увеличивать процент клеток, отображающих SG, - это не может произойти, если препарат / Стресс вызывает SGs в 100% клеток изначально. Это контрастирует с обработкой циклогексимидом, которая разбирает SGs и работает лучше всего, когда ~ 95% клеток первоначально показывают SGs, так что можно наблюдать и точно количественно измерять максимальное возможное снижение.

Этот протокол обеспечивает основу для изучения SGs в клетках млекопитающих. Методы включают: (1) иммунофлуоресцентное окрашивание и анализ ImageJ для оценки колокализации классических связанных с SG маркеров eIF4G, eIF3b и Ras GTPase-активирующий белок-связывающий белок 1 (G3BP1) в предполагаемых SG; (2) олиго (dT) флуоресценции in situ гибридизации (polyA FISH) для обнаружения полиаденилированной мРНК; (3) обработку циклогексимидом и пуромицином для определения, находятся ли индуцированные стрессом очаги в динамическом равновесии с полисомами; И (4) рибопуромицилирование для оценки трансляционного статуса клеток, содержащих предполагаемые SG. Вместе эти тесты могут определить, могут ли стрессовые очаги классифицироваться как добросовестные ПГ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клеток

  1. Добавить покровные покровные стекла в 12 лунок 24-луночного планшета, как показано на рисунке 1A ; Это можно сделать, используя стерильную пипетку Пастера, прикрепленную к вакууму, чтобы подобрать каждое покровное. Аккуратно нажмите покровное на стороне колодца, чтобы освободить всасывания, позволяя покровное попасть в колодец.
  2. Планшет 1 × 10 5 клеток U-2 OS (U2OS) остеосаркомы на лунку в конечном объеме 500 мкл среды. Переместите плиту стороной в сторону и вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек.
  3. Аккуратно нажмите покровные вниз с чистым кончиком P1000, чтобы гарантировать, что покровное стекло находится на дне колодца и что под покровным стеклом нет пузырьков.

2. Подчеркивание ячеек

  1. На следующий день визуально проверьте пластину, чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены и равномерно сливаются через покровное стекло, так как вариации между saМогут отрицательно влиять на воспроизводимость результатов. Используйте объектив 10X на инвертированном микроскопе тканевой культуры.
  2. Предварительно подогрейте среду до 37 ° C. Избегайте нанесения на ячейки холодных или горячих сред, так как они вызывают холодный шок или тепловой шок, соответственно.
  3. Развести препараты в предварительно нагретых средах. Для каждой концентрации различных лекарств подготовьте 2 лунки, содержащие 500 мкл среды. Подготовьте дополнительные 500 мкл, чтобы учесть потери при пипетировании. Аликвоту 4 пробирки, каждая из которых содержит 1,5 мл.
    1. Для арсенита натрия: в каждую лунку, содержащую 500 мкл, добавьте 1,5 мкл 100 мМ арсенита натрия (конечная концентрация: 100 мкМ) или добавьте 0,75 мкл 100 мМ арсенита натрия (конечная концентрация: 50 мкМ).
    2. Для винорельбина: в каждую лунку, содержащую 500 мкл, добавьте 22,5 мкл 10 мМ винорелбина (конечная концентрация: 150 мкМ) или добавьте 18,75 мкл 10 мМ винорелбина (конечная концентрация: 100 мкМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Арсенит натрия Является хорошо охарактеризованным и обычно используемым индуктором напряжения гранул и поэтому классически используется в качестве положительного контроля.
  4. Извлеките и выбросьте носитель из лунок В1 - 4 и С1 - 4. Добавьте носитель с лекарствами и подождите 60 мин (рис. 1А).
    1. Добавить 500 мкл среды со 100 мкМ арсенита натрия в лунки В1 и В2. Добавить 500 мкл среды с 50 мкМ арсенита натрия в лунки В3 и В4.
    2. Добавить 500 мкл среды с 150 мкМ винорелбина в лунки С1 и С2. Добавить 500 мкл среды с 125 мкМ винорелбина в лунки С3 и С4.
  5. За 30 мин до фиксации лунки в колонке 2 обрабатывают 5 мкл циклогексимида (1 мг / мл массы), а лунки в колонке 4 с 2 мкл пуромицина (1,25 мг / мл массы). Аккуратно встряхните пластину, чтобы она перемешалась, и положите пластину обратно в инкубатор с температурой 37 ° C.

3. Фиксация клеток и иммунофлюоресценция

Nt "> ПРИМЕЧАНИЕ: Перед экспериментом убедитесь, что метанол охлажден до -20 ° C. Сделайте буферы, включая фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), 5% нормальной сыворотки лошадей (NHS) в PBS и 4% параформальдегида (PFA ) В PBS.

  1. Выбросьте носитель и промойте лунки, содержащие покровные стекла, PBS. В зависимости от используемых лекарств может быть важно надлежащим образом отказаться от медикаментов, содержащих наркотики; Обратитесь за инструкциями в местное отделение экологической безопасности. Чтобы мыть эффективно, заполните бутылку с отжимом PBS, отрежьте кончик, чтобы обеспечить мягкий поток, а не жесткий поток, и используйте это, чтобы добавить PBS в каждую лунку после аспирации оригинального PBS.
  2. Зафиксируйте клетки, используя ~ 250 мкл 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Полностью накройте верхнюю часть покровного стекла PFA; 250 мкл должно быть достаточно, но если нет, добавьте еще. Всегда избегайте пипетирования непосредственно на покровные стекла, так как некоторые клетки (или стрессовые обработки клеток) могут изменить прикрепление, а tОн заставляет пипетку вытеснять клетки.
  3. Удалите PFA и утилизируйте правильно. Обратитесь в местное отделение экологической безопасности за информацией о том, как правильно выбрасывать параформальдегид.
  4. Добавить ~ 250 мкл метанола (-20 ° С) и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре при осторожном качании; Это и проницает, и выравнивает клетки.
  5. Удалить и выбросить метанол и заблокировать клетки, применяя ~ 250 мкл 5% NHS в течение 1 часа при RT O / N при 4 ° C. Обратитесь в местное отделение экологической безопасности за информацией о том, как правильно выбрасывать метанол.
  6. Для первичных антител развести антитела в 5% NHS.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Использование нескольких маркеров SG является ключевым для подтверждения того, являются ли наблюдаемые гранулы добросовестными SGs. Количество маркеров SG, которые могут использоваться, зависит от фильтров, доступных в микроскопе. Если доступны стандартные фильтры зеленого, красного и дальнего красного, используйте G3BP1, eIF4G и eIF3b при разведении 1/250.
    1. Для этого эксперимента (12 покровных при 250 мкл каждого общего количества: 3 мл 5% NHS) добавьте 12 мкл каждого из следующих: анти-G3BP1, anti-eIF3b и anti-eIF4G. Инкубируйте первичные антитела, используя осторожное перемешивание в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре или при температуре 4 ° С.
  7. Промывают лунки 3 раза PBS и инкубируют каждую промывку в течение 5 мин.
  8. Для вторичных антител разбавьте все вторичные антитела (разведение 1/250) и краситель Хехст (разведение 1/1000) в 5% NHS.
    1. Для этого эксперимента (12 покровных на 250 мкл каждого - всего: 3 мл 5% NHS) добавьте по 12 мкл каждого из следующего: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit и Cy5-Goat (разведение 1/250 каждого ) И добавляют 3 мкл красителя Хехста.
    2. Инкубируйте покровные стекла с вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Во время этого и следующих шагов защитите образцы от света, закрыв пластину коробочкой или положив фольгу поверх верхней части чашки для культуры ткани.
  9. Вымойте мыТри раза с PBS в течение 5 мин каждый.
  10. Установите покровные стекла на маркированные стеклянные слайды с помощью монтажной среды. Нагревают среду для монтажа в термостате с температурой 37 ° C в течение 10 мин; Это уменьшает вязкость и облегчает пипетирование. С отрезанным наконечником P200 пипеткой поместите 25 мкл монтажной среды на покровное стекло на предметное стекло; 4-8 покровные стекла могут поместиться на одном стеклянном слайде, предполагая, что микроскопа этап позволяет это. Используя тонкие щипцы, перенесите покровное стекло из лунки на предметное стекло, следя за тем, чтобы ячейка была направлена ​​вниз на монтажный материал. Используя чистый наконечник P200, нажмите покровное стекло вниз.
  11. После того, как все покровные были установлены, используйте сложенную лабораторную ткань для очистки излишней монтажной среды, очень сильно надавливая на ткань лабиринта. Используйте выжимную бутылку, содержащую H 2 O, чтобы смыть избыточную среду для установки, а затем повторите процедуру блоттинга со сложенной лабораторной тканью для удаления воды.

4. Флуоресценция In Situ </ Em> Гибридизация (FISH)

  1. Пластину и лечить клетки, используя шаги 1 и 2.1-4 в качестве ориентира; Необходимо только покрыть ячейки в столбце 1, поскольку в следующем эксперименте необходимы только 3 покровных стекла.
  2. Убедитесь, что все буферы подготовлены ( т.е. 4% PFA в PBS, 70% этанола в воде, 2x Saline-Sodium-Citrate (SSC) и 5% NHS), что метанол охлаждается до -20 ° C, и что Печь для гибридизации нагревается до соответствующей температуры.
  3. Выполните шаги 3.1-3.3 для мытья и фиксации клеток.
  4. Пермебилизировать клетки, добавляя метанол -20 ° С в течение 10 мин.
  5. Удалить метанол и инкубировать покровные в 70% этанола. Поместите пластину при 4 ° C на ночь. Запечатайте пластину с помощью парафильма, чтобы предотвратить испарение.
  6. На следующий день удаляют этанол и регидратируют клетки, добавляя 500 мкл 2x SSC. Инкубируйте покровные стекла в течение 5 мин при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
  7. Удалите 2x SSC и добавьте 500Мкл 2X SSC. Инкубируйте в течение 5 мин при осторожном перемешивании.
  8. Поместите часть парафильма на дно гибридизационной печи. Внесите 25 мкл буфера для гибридизации на парафильм для каждого покровного. Удалите покровное стекло из 24-луночного планшета (в этот момент покровные со стороны клетки) и поместите покровное стекло в буфер для гибридизации. Делайте это при температуре 42 ° C или при температуре 65 ° C в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Завершение этой стадии при 65 ° С приведет к денатурации клеточных РНК; Это может улучшить сигнал, если полиА замаскирован взаимодействием с белками.
  9. Развести биотин-олиго (dT) зонд (100 нг / мкл) в гибридизационном буфере до концентрации 2 нг / мкл; Достаточно 25 мкл на покровное стекло.
  10. Для каждого покровного раствора, пипеткой 25 мкл гибридизационного буфера, содержащего Биотин-Олиго (dT), на парафильм. Возьмите покровное с пинцетом и мягко коснитесь края покровного на ткани лаборатории, чтобы удалить избытокГибридизационный буфер. Перенесите покровное стекло в буфер для гибридизации с Биотин-Олиго (dT); Не забудьте сохранить ячейку стороной вниз.
  11. Поместите покровные стекла в коробке для гибридизации, чтобы ограничить испарение. Инкубируйте покровные стекла с Биотин-Олиго (dT) в гибридизационном буфере в течение 60 мин при 42 ° С.
  12. Поместите 2x SSC в печь для гибридизации, чтобы она смогла уравновеситься до 42 ° C.
  13. Добавить ~ 500 мкл нагретого 2x SSC в лунки в 24-луночном планшете и использовать щипцы для переноса покровных яиц в колодец. Инкубируйте в течение 10 мин.
  14. Повторите вышеуказанную стадию промывки дважды при 42 ° С, а затем дважды при комнатной температуре.
  15. Выполните шаги 3.5-3.10, убедившись, что для определения биотина-олиго (dT) вместо одного обычного антитела используют стрептавидиновый флуорохром.

5. Анализ рибопуромицилирования для оценки трансляционного статуса

  1. Пластинчатые клетки U2OS на покровных стеклах, как указано на этапе 1, но только покровное покровное пластиночное для каждого условия (в этом3 покровные стекла: не обработанные, 100 мкМ арсенит натрия и 150 мкМ винорелбин) ( фиг. 1А).
  2. Стресс-клетки, используя протокол на шаге 2, выполнив шаги 2.1-2.4.
  3. За 5 мин до фиксации добавьте 2 мкл пуромицина (запас: 1,25 мг / мл, разведите 2 мкл в 500 мкл, чтобы получить конечную концентрацию пуромицина 5 мкг / мл) и 2,9 мкл эметина (запас: 20 мкг / мл, добавьте 2,9 мкл к тому же раствору, уже содержащему пуромицин) в каждую лунку, содержащую 0,5 мл.
  4. Выполните шаги 3.1-3.10, как указано выше, с использованием антитела против пуромицина (разведение 1/1000) для обнаружения пуромицина. В идеале, используйте два других маркера SG в остальных каналах.
  5. При количественном определении сигнала пуромицина берут все изображения, используя одну и ту же экспозицию. Выберите эту экспозицию, используя самый яркий (безударный) образец и сделав изображение настолько ярким, насколько это возможно, без насыщения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Интенсивность флюоресцентного сигнала против пуромицинаПродолжающийся перевод, как заменители пуромицина для аминокислоты, включает в зарождающийся белок и обеспечивает преждевременное прекращение протеина.

6. Приобретение и анализ изображений

  1. Количественное определение гранул напряжений
    1. Для количественной оценки SG, приобретите 3 - 5 изображений общим количеством> 100 ячеек на образец, используя цель 40X. В качестве альтернативы, приобретайте изображения с использованием других целей, но убедитесь, что на покровное стекло учтено> 100 клеток и что увеличение достаточно велико, чтобы четко визуализировать гранулы. Сделайте это, разделив покровное стекло на пять примерно одинаковых областей и произвольно выбирая поле из каждого региона ( рис. 1В ); Изображения одного и того же поля должны включать все каналы для оценки колокализации маркеров.
    2. После того, как все изображения были получены, объедините каналы. Некоторое программное обеспечение камеры автоматически сделает это, в то время как другие требуют ручного слияния; Это можно сделать с помощьюImageJ, открыв все изображения и выбрав [Image | Цвет | Объединить каналы].
    3. Вручную подсчитайте общее количество клеток, подсчитав количество ядер, используя Hoechst в качестве маркера ядер. Вручную подсчитайте количество ячеек, содержащих более двух единиц на ячейку.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Например, используя объединенное трехканальное изображение, отображающее G3BP1 (зеленый), eIF4G (красный) и Hoechst (синий), подсчитайте ядра (или количество ячеек), используя синий канал. Затем подсчитайте SG-положительные клетки, как те, у которых два или более желтых фокуса на клетку. Гранулы будут желтыми, зелеными от G3BP1, а красные от eIF4G будут желтыми, если они будут колокализованными.
    4. Определите процент ячеек, которые являются положительными SG, объединив данные из 3-5 независимых регионов, а затем вычислите:
      Количество SG положительных / количество ядер) * 100 = процент SG-положительных клеток
  2. Оценка колокализации методом линейного сканирования - ручной метод
    1. открытоImageJ. Скачайте его бесплатно ()
    2. Откройте менеджер ROI: [Analyze | Инструменты | Менеджер ROI ...].
    3. Откройте объединенное изображение в ImageJ: [File | Открыто].
    4. Используя инструмент линии, расположенный на панели инструментов ImageJ, добавьте строку, проходящую через SG, обязательно включив в нее до и после SG. Добавьте эту строку в менеджер ROI, нажав [Добавить] в окне менеджера ROI.
    5. Разделите объединенное изображение на отдельные каналы, чтобы оценить локализацию каждого маркера в грануле: [Image | Цвет | Сплит-канал]; Это разделит объединенное изображение на три черно-белых изображения.
    6. На черно-белом изображении убедитесь, что линия выбрана; Строка будет выбрана, если она отображается на изображении. Если нет, в окне менеджера ROI щелкните по строке на панели; Это выделит синюю линию в окне менеджера ROI и сделает линию видимой на черно-белом изображении. Если линия по-прежнему не отображается, убедитесь, что «показать все» указано chВыбирая в менеджере ROI, а затем нажимайте на линию в изображении.
    7. Проанализируйте интенсивность линии: [Анализ | Профиль участка]; Это вызовет окно «Профильный профиль», который отображает интенсивность сигнала по всей линии.
    8. В окне «Профиль графика» нажмите [Список], чтобы открыть окно, содержащее необработанные данные из графика. Скопируйте все данные в этом окне и вставьте его в файл электронной таблицы. Для этого выберите все данные в окне: [Изменить | Выбрать все]. Скопируйте дату: [Изменить | Копировать]. Откройте файл электронных таблиц и вставьте данные: [Edit | Вставить].
    9. Выполните шаги 6.2.6 - 6.2.8 для каждого канала отдельно. Обязательно следите за оцениваемым каналом.
    10. В электронной таблице создайте линейный график результатов. Выберите столбцы, содержащие данные, нажав [control] и нажав на букву в верхней части каждого столбца. Затем выберите линейный график: [Insert | Линейный график].
    11. Повторите этот анализ для multГранулы напряжения в различных независимых экспериментах.
  3. Оценка колокализации методом линейного сканирования - ImageJ Plugin
    1. Загрузите и установите инструмент профиля RGB с веб-сайта ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); При правильной установке на панели инструментов должен появиться красный, зеленый и синий (RGB) значок.
    2. Откройте изображение ( например, Tiff, JPG) в ImageJ: [File | Открыто].
    3. Нажмите на значок RGB, расположенный на панели инструментов ImageJ.
    4. Нажмите и перетащите, чтобы добавить линию, проходящую через SG, включая соседние области; Во всплывающем окне появится изображение гистограммы.
    5. Сохраните данные в виде изображения: [File | Сохранить как | Tiff]. В качестве альтернативы, экспортируйте и затем график данных в другой графической программе, используя шаг 6.2.8 сверху.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Очаги, вызванные стрессом, необязательно являются SG. SGs классифицируются как цитоплазматические фокусы, которые содержат мРНК, факторы инициации трансляции и РНК-связывающие белки и находятся в равновесии с активным переносом. Вышеприведенный протокол может использоваться в качестве шаблона для характеристики того, вызывает ли данный стресс добросовестных SGs.

SGs colocalize с другими известными маркерами SG, включая как бел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Как свидетельствуют иммуногистологические исследования при множественных заболеваниях, хронический стресс приводит к образованию различных внутриклеточных очагов. Например, большинство нейродегенеративных заболеваний характеризуются внутриклеточными агрегатами нерастворимых белков. Наличие SG-ассоциированных белков в таких агрегатах часто является основанием для заключения, что такие фокусы являются SG. Аналогичный вывод также сделан, когда SG-позитивные цитоплазматические очаги наблюдаются в клетках, обработанных новым...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим членов лабораторий Иванова и Андерсона за их полезные обсуждения и отзывы по этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [GM111700 и CA168872 PA, NS094918 - PI], Национальным научным центром в Польше [предоставить UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 на WS]. WS также признает Министерство науки и высшего образования в Польше (Mobility Plus Program) и Польско-Американскую комиссию Фулбрайта за финансовую поддержку своих исследований в США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
U-2 ОСATCCATCC® HTB-96&торговля;Обычно пишется "U2OS"
Culture at 37 ° C в дозе 5% CO2 в 10% FBS/DMEM
Модифицированная среда Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVСодержит 4,5 г/л глюкозы, пирувата и фенола красного
Дополнен 10% FBS, 10 mM HEPES и пенициллином/стептомицином
Предварительное разведение предварительного препарата (препаратов)
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF2442-500 млИспользуется в качестве добавки к медиа
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630-080Используется для дополнения медиа
пенициллина стрептомицинаSigmaP0781-100mlИспользуется для дополнения медиа
24-луночной пластиныCostar3524
лабораторных салфеток (кимвайпы)KIMTECH SCIENCE34120
Покровное стекло для роста Cover GlassesFisher Scientific12-545-82Автоклавирование перед использованием
Хранить стерильным в вытяжке для культуры тканей
Натрий (мета)арсенит ≥ 90% (SA)SigmaS7400-100GРастворить в воде до концентрации 1 М, затем разбавить до 100 мкм; M в качестве рабочего материала
Vinorelbine (VRB)TSZ CHEMRS055Растворить в воде до 10 мМ
PuromycinSigmaP9620Используется для оценки уровня трансляции (рибопуромицилирования)
-Используется для оценки связи SG с активной трансляцией
Разводить в воде до 10 мг/мл
Гидрат дигидрохлорида ЭметинаSigmaE2375Используется в комбинации с пуромицином для оценки общего уровня трансляции
Используется для оценки связи SG с активной трансляцией
-Разведить в воде до 10 мг/мл
Циклогексимид (CHX)SigmaC4859Используется для оценки SG связи с активной трансляцией
Развести в воде до 10 мг/мл
Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)Lonza / VWR95042-486Промывочный буфер для иммунофлуоресценции
Реагент класса параформальдегида, кристаллический (PFA)SigmaP6148-500GПриготовьте 4% раствор в горячем PBS в вытяжном шкафу, перемешайте до растворения
Аликвоты можно хранить при -20 °°; C в течение нескольких месяцев
Опасно, использовать вентиляцию
Выбрасывать в специальные отходы
Метанол, АСУBDH/VWRBDH1135-4LPПредварительно охладить до -20°С; C перед использованием
Выбросьте в специальные отходы
Нормальная лошадиная сыворотка (NHS)Thermo Fisher Scientific31874Разбавить до 5% PBS
Добавить азид натрия для хранения при 4°°; C
Блокирующий раствор для иммунофлуоресценции
Этанол, чистый, 200 Proof (100%),USP, KOPTECDecon Labs / VWR89125-188Разбавить до 70% водой
Fisherbrand Superfrost Plus Микроскоп СлайдыFisherbrand12-550-15
мышь против антител G3BP1 (TT-Y)Santa Cruzsc-81940Хранить при 4 ° C
1/100 разведение
кролика против антител eIF4G (H-300)Santa Cruzsc-11373Хранить при 4 ° C
1/250 разведение
козы против eIF3η (N-20) антителоSanta Cruzsc-16377eIF3η также известно как eIF3b
Store at 4 ° C
1/250 разведение
мышиного антипуромицина 12D10 антителаMilliporeMABE343хранить при 4 ° C
1/1,000 разведение
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-225-150Восстановиться в воде в зависимости от производителя Затем храните при 4 °deg; C
1/250 разведение
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152Восстановите в воде в соответствии с решением производителя s затем хранить в 4° C
1/2,500 разведение
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch705-175-147Восстановите в воде в соответствии с требованиями производителя s затем хранить в 4° C
1/250 разведение
Hoechst 33258 растворSigma94403-1MLИнкубировать с вторичными антителами
Стоковый раствор 0,5 мг/мл в dH20, беречь от света
-Хранить при 4 ° C
Cy3 СтрептавидинJackson Immunoresearch016-160-084Восстановиться в воде в зависимости от производителя , то хранить при 4° C
1/250 разбавления
олиго-(dT)<суб>40x зонд биотинилированныйIntegrated DNA Technologies (IDT)/Восстановите в воде до 100 нг/мл, аликвоту и храните при -20 °°; C
Развести в буфере для гибридизации 1/50 перед использованием
Коробка для гибридизации по индивидуальному заказу
//Сделайте камеру для увлажнения с любым слайд-боксом для хранения, добавив увлажненную бумагу на дно
- предварительно нагрейте коробку перед использованием
20x буфер SSCThermo fisher AmbionAM9763Разбавьте до 2x SSC с использованием воды, не содержащей РНКазы (обработанной DEPC)
Хранить в RT
Промывочный буфер для FISH
Буфер для гибридизации PerfectHybPlusSigmaH7033-50млБлок и буфер для инкубации зонда для FISH
самодельного монтажного материаладомашнего изготовления/Смесь 5 г " холодорастворимый» поли(виниловый спирт) в 20 мл PBS
Смешать методом ультразвука, с последующим перемешиванием O/N при RT
Добавить 5 мл глицерина и 0,2 мл 20 % азида натрия и перемешать в течение 16 ч при RT
Центрифугирование при 20 000 г в течение 20 мин, выбросить крупные гранулы
вязкой жидкости Aliquot, длительное хранение при -20 °Deg; С, 1 неделя при 4 градусах;
C Парапленка "M"SigmaP7793-1EA
Поли(виниловый спирт)SigmaP-8136-250GРеагент для получения винола
ГлицеринSigmaG5516-100MLРеагент для получения
винола азида натрияFisher ScientificS2002-5GКонсервант для блокирующего раствора и винол
Сделать 20% разбавление в воде

Ссылки

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R. mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease. RNA Biol. 11 (8), (2014).
  4. Kedersha, N., et al. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).
  5. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase? Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  6. Kedersha, N., et al. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).
  7. Bley, N., et al. Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress. Nucleic Acids Res. 43 (4), e26(2015).
  8. Kedersha, N., et al. G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits. J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).
  9. Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics. J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).
  10. Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. Stress granules, P-bodies and cancer. Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).
  11. Aulas, A., Van de Velde,, C, Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS? Front Cell Neurosci. 9, 423(2015).
  12. Ivanov, P., Anderson, P. Post-transcriptional regulatory networks in immunity. Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).
  13. Wolozin, B. Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease. Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).
  14. Lloyd, R. E. Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).
  15. Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
  16. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. , (2015).
  17. Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules. Cancer Cell Int. 10, 12(2010).
  18. Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation. Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).
  19. Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).
  20. Szaflarski, W., et al. Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation. Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).
  21. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
  22. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).
  23. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  24. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).
  25. Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).
  26. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  27. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).
  28. Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells. Methods. 90, 57-64 (2015).
  29. David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells. Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).
  30. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).
  31. Ruggieri, A., et al. Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection. Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).
  32. Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells. Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).
  33. Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).
  34. Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite. Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).
  35. Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. Arsenic binding to proteins. Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).
  36. McDonald, K. K., et al. TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1. Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).
  37. Aulas, A., et al. G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA. J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).
  38. Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells. J Vis Exp. (87), (2014).
  39. Wippich, F., et al. Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling. Cell. 152 (4), 791-805 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

РНК-гранулыметод иммунофлуоресцентного анализафлуоресцентная микроскопияPoly A FISHмаркер G3BP1ингибирование трансляциистресс клеток млекопитающихРНК-связывающие белки
Методы классификации цитоплазматических фокусов в качестве гранул стресса млекопитающих
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.