Method Article

Методы классификации цитоплазматических фокусов в качестве гранул стресса млекопитающих

DOI:

10.3791/55656

⸱

May 12th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гранулы напряжения (SG) представляют собой неембранные цитоплазматические структуры, которые образуются в клетках, подверженных различным стрессам. SGs содержат мРНК, РНК-связывающие белки, небольшие рибосомальные субъединицы, факторы, связанные с трансляцией, и различные клеточные сигнальные белки. Этот протокол описывает рабочий процесс, который использует несколько экспериментальных подходов для обнаружения, характеристики и количественной оценки добросовестных SG.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внезапные изменения окружающей среды часто вызываются клетками. Гранулы напряжения (SG), цитоплазматические рибонуклеопротеидные комплексы, которые образуются в клетках, подвергающихся стрессовым условиям, вовлечены в различные аспекты клеточного метаболизма и выживания. SGs модулируют клеточные сигнальные пути, посттранскрипционную экспрессию генов и программы ответа на стресс. Образование этих гранул, содержащих мРНК, непосредственно связано с клеточным переносом. Собрание СГ запускается с помощью запрещенной инициации трансляции, и разборке СГ способствует активация трансляции или ингибированное удлинение трансляции. Эта взаимосвязь дополнительно подчеркивается составом ГС. Основными компонентами SG являются заторможенные трансляционные комплексы трансляции, мРНК и выбранные РНК-связывающие белки (RBPs). Цель сборки SG - сохранить клеточную энергию путем секвестрации трансляционно застопоренной домашней мРНК, позволяющей усиленный перенос стрессоустойчивых белков. В добавленииПо отношению к основным компонентам, таким как блокировки предизайсирования прерванного перевода, SG содержат множество других белков и сигнальных молекул. Дефекты в образовании СГ могут нарушить клеточную адаптацию к стрессу и, таким образом, способствовать клеточной гибели. SG и подобные РНК-содержащие гранулы были связаны с рядом заболеваний человека, включая нейродегенеративные расстройства и рак, что привело к недавнему интересу к классификации и определению подтипов РНК-гранул. Этот протокол описывает анализы для характеристики и количественной оценки SG млекопитающих.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки используют множество механизмов для ответа на стресс. Некоторые ответы происходят на посттранскрипционном уровне и включают регуляцию трансляции мРНК и / или стабильности 1 , 2 . Блокирование и деградация трансляционного движения мРНК, вызванные стрессом, связаны с образованием специфических неэмбринозных клеточных фокусов, наиболее хорошо охарактеризованными как гранулы напряжения (SGs) 3 . SG являются цитоплазматическими очагами, которые концентрируют нетранслирующие mRNPs в трансляционно-арестованных клетках, реагирующих на стресс ( например, окисление, тепловой шок,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток

  1. Добавить покровные покровные стекла в 12 лунок 24-луночного планшета, как показано на рисунке 1A ; Это можно сделать, используя стерильную пипетку Пастера, прикрепленную к вакууму, чтобы подобрать каждое покровное. Аккуратно нажмите покровное на стороне колодца, чтобы освободить всасывания, позволяя покровное попасть в колодец.
  2. Планшет 1 × 10 5 клеток U-2 OS (U2OS) остеосаркомы на лунку в конечном объеме 500 мкл среды. Переместите плиту стороной в сторону и вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек.
  3. Аккуратно нажмите покровные вниз с чистым кончиком P100....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очаги, вызванные стрессом, необязательно являются SG. SGs классифицируются как цитоплазматические фокусы, которые содержат мРНК, факторы инициации трансляции и РНК-связывающие белки и находятся в равновесии с активным переносом. Вышеприведенный протокол может использоваться в качестве шаблона для характеристики того, вызывает ли данный стресс добросовестных SGs.

SGs colocalize с другими известными маркерами SG, включая как бел.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как свидетельствуют иммуногистологические исследования при множественных заболеваниях, хронический стресс приводит к образованию различных внутриклеточных очагов. Например, большинство нейродегенеративных заболеваний характеризуются внутриклеточными агрегатами нерастворимых белков. Наличие SG-ассоциированных белков в таких агрегатах часто является основанием для заключения, что такие фокусы являются SG. Аналогичный вывод также сделан, когда SG-позитивные цитоплазматические очаги наблюдаются в клетках, обработанных новым.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов лабораторий Иванова и Андерсона за их полезные обсуждения и отзывы по этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [GM111700 и CA168872 PA, NS094918 - PI], Национальным научным центром в Польше [предоставить UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 на WS]. WS также признает Министерство науки и высшего образования в Польше (Mobility Plus Program) и Польско-Американскую комиссию Фулбрайта за финансовую поддержку своих исследований в США.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
U-2 ОСATCCATCC® HTB-96&торговля;Обычно пишется "U2OS"
Culture at 37 ° C в дозе 5% CO2 в 10% FBS/DMEM
Модифицированная среда Dulbecco Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVСодержит 4,5 г/л глюкозы, пирувата и фенола красного
Дополнен 10% FBS, 10 mM HEPES и пенициллином/стептомицином
Предварительное разведение предварительного препарата (препаратов)
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF2442-500 млИспользуется в качестве добавки к медиа
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630-080Используется для дополнения медиа
пенициллина стрептомицинаSigmaP0781-100mlИспользуется для дополнения медиа
24-луночной пластиныCostar3524
лабораторных салфеток (кимвайпы)KIMTECH SCIENCE34120
Покровное стекло для роста Cover GlassesFisher Scientific12-545-82Автоклавирование перед использованием
Хранить стерильным в вытяжке для культуры тканей
Натрий (мета)арсенит ≥ 90% (SA)SigmaS7400-100GРастворить в воде до концентрации 1 М, затем разбавить до 100 мкм; M в качестве рабочего материала
Vinorelbine (VRB)TSZ CHEMRS055Растворить в воде до 10 мМ
PuromycinSigmaP9620Используется для оценки уровня трансляции (рибопуромицилирования)
-Используется для оценки связи SG с активной трансляцией
Разводить в воде до 10 мг/мл
Гидрат дигидрохлорида ЭметинаSigmaE2375Используется в комбинации с пуромицином для оценки общего уровня трансляции
Используется для оценки связи SG с активной трансляцией
-Разведить в воде до 10 мг/мл
Циклогексимид (CHX)SigmaC4859Используется для оценки SG связи с активной трансляцией
Развести в воде до 10 мг/мл
Фосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS)Lonza / VWR95042-486Промывочный буфер для иммунофлуоресценции
Реагент класса параформальдегида, кристаллический (PFA)SigmaP6148-500GПриготовьте 4% раствор в горячем PBS в вытяжном шкафу, перемешайте до растворения
Аликвоты можно хранить при -20 °°; C в течение нескольких месяцев
Опасно, использовать вентиляцию
Выбрасывать в специальные отходы
Метанол, АСУBDH/VWRBDH1135-4LPПредварительно охладить до -20°С; C перед использованием
Выбросьте в специальные отходы
Нормальная лошадиная сыворотка (NHS)Thermo Fisher Scientific31874Разбавить до 5% PBS
Добавить азид натрия для хранения при 4°°; C
Блокирующий раствор для иммунофлуоресценции
Этанол, чистый, 200 Proof (100%),USP, KOPTECDecon Labs / VWR89125-188Разбавить до 70% водой
Fisherbrand Superfrost Plus Микроскоп СлайдыFisherbrand12-550-15
мышь против антител G3BP1 (TT-Y)Santa Cruzsc-81940Хранить при 4 ° C
1/100 разведение
кролика против антител eIF4G (H-300)Santa Cruzsc-11373Хранить при 4 ° C
1/250 разведение
козы против eIF3η (N-20) антителоSanta Cruzsc-16377eIF3η также известно как eIF3b
Store at 4 ° C
1/250 разведение
мышиного антипуромицина 12D10 антителаMilliporeMABE343хранить при 4 ° C
1/1,000 разведение
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-225-150Восстановиться в воде в зависимости от производителя Затем храните при 4 °deg; C
1/250 разведение
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152Восстановите в воде в соответствии с решением производителя s затем хранить в 4° C
1/2,500 разведение
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch705-175-147Восстановите в воде в соответствии с требованиями производителя s затем хранить в 4° C
1/250 разведение
Hoechst 33258 растворSigma94403-1MLИнкубировать с вторичными антителами
Стоковый раствор 0,5 мг/мл в dH20, беречь от света
-Хранить при 4 ° C
Cy3 СтрептавидинJackson Immunoresearch016-160-084Восстановиться в воде в зависимости от производителя , то хранить при 4° C
1/250 разбавления
олиго-(dT)<суб>40x зонд биотинилированныйIntegrated DNA Technologies (IDT)/Восстановите в воде до 100 нг/мл, аликвоту и храните при -20 °°; C
Развести в буфере для гибридизации 1/50 перед использованием
Коробка для гибридизации по индивидуальному заказу
//Сделайте камеру для увлажнения с любым слайд-боксом для хранения, добавив увлажненную бумагу на дно
- предварительно нагрейте коробку перед использованием
20x буфер SSCThermo fisher AmbionAM9763Разбавьте до 2x SSC с использованием воды, не содержащей РНКазы (обработанной DEPC)
Хранить в RT
Промывочный буфер для FISH
Буфер для гибридизации PerfectHybPlusSigmaH7033-50млБлок и буфер для инкубации зонда для FISH
самодельного монтажного материаладомашнего изготовления/Смесь 5 г " холодорастворимый» поли(виниловый спирт) в 20 мл PBS
Смешать методом ультразвука, с последующим перемешиванием O/N при RT
Добавить 5 мл глицерина и 0,2 мл 20 % азида натрия и перемешать в течение 16 ч при RT
Центрифугирование при 20 000 г в течение 20 мин, выбросить крупные гранулы
вязкой жидкости Aliquot, длительное хранение при -20 °Deg; С, 1 неделя при 4 градусах;
C Парапленка "M"SigmaP7793-1EA
Поли(виниловый спирт)SigmaP-8136-250GРеагент для получения винола
ГлицеринSigmaG5516-100MLРеагент для получения
винола азида натрияFisher ScientificS2002-5GКонсервант для блокирующего раствора и винол
Сделать 20% разбавление в воде

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Yamasaki, S., Anderson, P. Reprogramming mRNA translation during stress. Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).
  3. Buchan, J. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stress GranulesCytoplasmic FociRNA GranulesImmunofluorescence AssayFluorescence MicroscopyPoly A FISHG3BP1 MarkerTranslation InhibitionMammalian Cell StressRNA Binding Proteins

Related Articles