Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

9.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55703

⸱

9 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Academic Medical Center, University of Amsterdam, Lymphoma and Myeloma Center Amsterdam (LYMMCARE)

В этой статье

Краткое содержание

Здесь показано, как анализ in situ Proximity Ligation Assay (PLA) может использоваться для обнаружения и визуализации прямых белково-белковых взаимодействий между АТМ и р53 в культурах суспензионных клеток, подверженных генотоксическому стрессу.

Аннотация

Ответ на повреждение ДНК организует восстановление повреждений ДНК, которые происходят спонтанно, вызваны генотоксическим стрессом или появляются в контексте запрограммированных разрывов ДНК в лимфоцитах. К числу первых, которые активируются при индукции повреждения ДНК, относятся мутантная киназа Ataxia-Telangiectasia (ATM), ATM- и Rad3-родственная киназа (ATR) и каталитическая субъединица ДНК-зависимой белковой киназы (DNA-PKcs). Центральные регуляторы сети, которые контролируют восстановление ДНК, апоптоз и выживаемость клеток. В рамках подавляющего опухоль пути АТМ и АТР активируют р53 через фосфорилирование, тем самым регулируя транскрипционную активность р53. Повреждение ДНК также приводит к образованию так называемых очагов, индуцированных ионизирующим излучением (IRIF), которые представляют собой комплексы датчика повреждения ДНК и восстанавливающие белки, которые накапливаются в местах повреждения ДНК, которые визуализируются с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако совместная локализация белков в IRIF не обязательно подразумевает dПрямое белково-белковое взаимодействие, поскольку разрешение флуоресцентной микроскопии ограничено.

In situ Proxyimity Ligation Assay (PLA) - это новый метод, который позволяет осуществлять непосредственную визуализацию белково-белковых взаимодействий в клетках и тканях с беспрецедентной специфичностью и чувствительностью. Этот метод основан на пространственной близости специфических антител, связывающихся с представляющими интерес белками. Когда опрошенные белки находятся в пределах ~ 40 нм, реакция амплификации инициируется олигонуклеотидами, которые конъюгированы с антителами, и продукт амплификации визуализируется флуоресцентной мечением, что дает сигнал, который соответствует субклеточному расположению взаимодействующих белков. Используя установленное функциональное взаимодействие между АТМ и р53 в качестве примера, здесь показано, как PLA можно использовать в культурах суспензионных клеток для изучения прямых взаимодействий между белками, которые являются неотъемлемыми частями ответа на повреждение ДНК.

Введение

Ущерб ДНК вызывает высокорегулярную последовательность событий, включающих белково-белковые взаимодействия и посттрансляционные модификации, которые обеспечивают эффективный и быстрый ремонт ДНК, тем самым защищая геномную целостность 1 . Как правило, репарация ДНК изучается в клетках, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения, путем мониторинга образования так называемых ионизирующих излучений фокусов (IRIF) с помощью (конфокальной) флуоресцентной микроскопии. Многие репарации ДНК и ДНК, чувствительные к повреждениям ДНК, образуют IRIF, которые представляют собой белковые комплексы, которые зарождаются на участках хроматина, поддерживающих повреждение ДНК 2 , 3 . Расположение и разрешение IRIF со временем дают важное представление о пространственно-временной организации репарации ДНК и могут указывать на участие различных путей восстановления ДНК. Характер повреждения ДНК и стадии клеточного цикла, в которой достигается повреждение, определяет, какой путь восстановления ДНК активирован. Fo Например, в клетках, активно участвующих в репликации ДНК (S-фаза), гомологичная рекомбинация (HR) является доминирующим способом восстановления ДНК, тогда как в клетках в G1- или G2 / M-фазе клеточного цикла, Преобладает путь восстановления гомологичного концевого соединения (NHEJ). Одним из ранних событий после повреждения ДНК является активация ДНК-чувствительных киназ Ataxia Telangiectasia-Mutated protein (ATM), которая в основном активна в G1- и G2 / M-фазах клеточного цикла и регулирует NHEJ, И Ataxia Telangiectasia и Rad3-родственный белок (ATR), который действует в S-фазе путем активации HR. Оба АТМ и АТР представляют собой плейотропные киназы, которые фосфорилируют многие белки, которые участвуют в репарации ДНК, гибели клеток и выживании 4 . Было показано, что обе киназы фосфорилируют и активируют белок-супрессор опухоли р53 после воздействия генотоксического стресса, указывая, что эти киназы являются предшественниками медиаторов основной оси подавления опухолей"Xref"> 5 , 6 .

Образование и состав IRIF обычно оценивают путем определения совместной локализации различных белков с использованием двухцветного иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопии, однако не все белки, которые являются частью ремонтных белковых комплексов, образуют IRIF, что ограничивает применимость этого подхода. Кроме того, (конфокальная) иммунофлуоресцентная микроскопия ограничивается дифракционными свойствами света, что приводит к довольно плохим пространственным разрешением около 200-300 нм, превышающим размер большинства субклеточных структур, что существенно запрещает прямой опрос белково-белковых взаимодействий при Молекулярный уровень. Таким образом, совместная локализация образцов окраски иммунофлюоресценции, обнаруженная (конфокальной) флуоресцентной микроскопией, необязательно является показательной для прямых белково-белковых взаимодействий. Недавно были разработаны новые технологии с высоким разрешением, такие как трехмерные структуры(3D-SIM) 7 , который был успешно использован для изучения формирования IRIF 53BP1 и BRCA1 на наномасштабных деталях, выявляя характеристики пространственного распределения этих белков, которые не были обнаружены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 8 .

Для обнаружения белково-белковых взаимодействий in vivo можно использовать несколько других методов, таких как совместное иммунопреципитация, методы вытягивания и двухгибридные скрининг-дрожжи. Однако эти методы довольно громоздки, требуют больших количеств клеток или белков или включают избыточную экспрессию белков, которая вводит экспериментальные артефакты. Совсем недавно был разработан новый метод, который позволяет визуализировать и количественно определять белково-белковые взаимодействия in situ ( т.е. в клетках и в тканях), который называется анализом лигирования близости (PLA) 9 , 10 . PrИмариновые антитела, которые распознают два представляющих интерес белка, обнаруживаются вторичными антителами, которые конъюгированы с олигонуклеотидами (так называемые PLA-зонды). Если два разных вторичных антитела достаточно близки из-за взаимодействий между белками, распознаваемыми первичными антителами, конъюгированные олигонуклеотиды гибридизуются и могут быть лигированы с образованием замкнутого кольцевого ДНК-субстрата. Этот круглый субстрат затем амплифицируют путем амплификации окружности качения и визуализируют с комплементарными флуорохромовыми комплементарными олигонуклеотидами. Используя PLA, субклеточная локализация белково-белкового взаимодействия сохраняется, так как флуоресцентно меченый продукт амплификации скользящего круга остается прикрепленным к PLA-зондам. Разрешение этого анализа составляет <50 нм, на основании нахождения, что диаметр антитела составляет приблизительно 7-10 нм 11 . Усиление прокатного круга может иметь место только в случае, если две пары антител (первичный + секонDary) физически взаимодействуют по периметру, который определяется их размером (10 + 10 + 10 + 10 = 40 нм). Шаг усиления сигнала увеличивает чувствительность анализа PLA и позволяет обнаруживать взаимодействия едва выраженных белков. PLA генерирует точечные фокусные сигналы, которые могут быть определены количественно на основе клеток, с помощью которых можно оценивать внутри- и межклеточные изменения в белково-белковых взаимодействиях.

Образование и состав восстановительных комплексов ДНК и IRIFs в основном изучают в клеточных линиях клещей, таких как линия U2OS эпителиальных клеток костной остеосаркомы человека, линия клеток эмбриональной почки человека HEK293 и линия эпителиальных клеток ретинального эпителия RPE-1, Растут и легко трансфицируются. Культуры клеток суспензии, такие как лимфоидные и миелоидные клеточные линии, используются реже, поскольку они менее подвержены трансфекции и обычно не прилипают к покровным, что требует дополнительной / альтернативной ст.Eps для визуализации. Однако разрешение повреждения ДНК очень важно в контексте лимфоидных и миелоидных злокачественных новообразований, так как ответ на повреждение ДНК часто зависит от геномных (драйверов) аберраций в этих опухолях, играя ключевую роль в злокачественной трансформации нормальных лимфоидных и миелоидных ( Предшественник) 12 , 13 , 14 .

Этот протокол описывает, как PLA может использоваться для оценки и количественного определения белково-белковых взаимодействий после индукции повреждения ДНК в культурах суспензионных клеток. Здесь выполняется PLA для определения и визуализации взаимодействий между ATM и p53 при повреждении ДНК в клетках лейкемии человека B-клеток, которые индуцируются для того, чтобы подвергнуться остановке клеточного цикла G1-фазы. Следует отметить, что представленный здесь протокол не ограничивается изучением взаимодействий ATM и p53 в клетках лейкемии, арестованных G1, но также может быть использован для визуализации другого белково-белкового взаимодействияВ различных типах клеток и в культурах суспензионных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Лечение клеток и индукция повреждения ДНК

  1. Культивируют клеточные линии BCR-ABL + B-клеток человека BCR-ABL + BV173 или SUP-B15 в IMDM, дополненные 20% FCS, 50 мкМ β-меркаптоэтанола, 2 мМ L-глутамина, 100 ед. / Мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C в атмосфере 5% CO 2 . Считайте клетки и планшеты при 2 × 10 6 клеток / мл в 6-луночных планшетах в 5 мл / лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно могут использоваться линии подвески различного происхождения.
  2. Чтобы остановить клетки BCR-ABL + B-ALL в G1-фазе клеточного цикла, добавьте 5 мкМ метансульфоната иматиниба (STI571) и инкубируйте в течение ночи.
    1. Необязательно, опустите этот шаг при изучении белково-белковых взаимодействий в течение клеточного цикла или в типах BCR-ABL-отрицательных клеток.
  3. Вызывают повреждение ДНК путем добавления 50 нг / мл неокарзиностатина (NCS) к культуре и инкубируют в течение 2 часов.
    1. С другой стороны,Индуцируют повреждение ДНК путем облучения клеток с использованием радиоактивного источника [ 137 Cs] со скоростью 0,5 Гр / мин в дозе 5 Гр. После облучения клетки восстанавливают в течение 2 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 .
  4. Необязательно, чтобы оценить участие активности киназы АТМ в ответ на повреждение ДНК, добавить 5 мкМ ингибитора киназы АТМ KU55933 до добавления NCS или облучения.
  5. Подготовьте 1x PBS + 10% BSA путем наслаивания 5 г фракции-V BSA поверх 50 мл 1x PBS в стакане или колбе Эрленмейера и дайте сидеть при RT до растворения BSA. Не встряхивайте и не перемешивайте, так как это приведет к вспениванию. Медленно фильтруйте через фильтр 0,22 мкм и держите на льду.
  6. Убирайте клетки и дважды промывайте ледяным 1x PBS. Подсчитайте клетки и ресуспендируют при 2 × 10 6 / мл в 1x PBS + 10% BSA. Держите клетки на льду.

2. Цитоцентрифугирование, фиксация и пермеабилизация

  1. Подготовьте4% раствора параформальдегида в 1х PBS свеже. Добавить 2 г PFA в 50 мл 1x PBS и инкубировать в качающейся водяной бане с температурой 55 ° C до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Фильтруют раствор через фильтр 0,22 мкм и хранят при комнатной температуре до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Необязательно, фиксатор PFA 4% можно хранить замороженным при -20 ° C. После замораживания оттаивайте только один раз для использования. В противном случае решение 4% PFA в PBS можно купить напрямую.
  2. Осторожно отполируйте слайды с микроскопом размером 76 мм x 26 мм с безворсовой тканью и обезжирьте их, помещая в 96% этанол в банку Coplin в течение 5 минут. Позвольте микроскопии сместиться в воздухе на 10 минут.
  3. Собрать микроскопические слайды в цитоскопические / цитологические воронки с площадью 6 мм. Предварительно покрытые слайды путем пипетирования 50 мкл 1x PBS + 10% BSA в каждую воронку и центрифуги в течение 1 мин при 500 об / мин.
  4. Добавьте 100 мкл суспензии клеток (равную 0,2 × 10 6 клеток) в каждую воронку и центрифугируйте в течение 5 мин при 500 об / мин. Для каждой комбинации антител в leТребуются препараты ast 4 (эксперимент с двумя антителами, два контроля с одним антителом, без контроля антител).
  5. Осторожно разоберите воронки и не прикасайтесь к пятнам. Немедленно перейти к фиксации образца.
    1. При желании, разрежьте сушки на воздухе в течение как минимум 30 минут. После сушки на воздухе оберните отдельные листы в алюминиевой фольге и храните при -20 ° C до использования. При использовании замороженных препаратов обязательно протащите слайды, обернутые в бумажное полотенце, чтобы предотвратить открытую конденсацию на слайдах.
  6. Нарисуйте круг (приблизительный диаметр 15-20 мм) вокруг пятна с помощью блока фиксации пера PAP (наконечник 5 мм).
  7. Добавьте 50 мкл 4% раствора фиксации PFA к каждому пятну и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре.
  8. Промывают клетки 3 раза в течение 5 минут с помощью 1x PBS в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  9. Высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса и удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пиЖивотное, не касаясь пятна, или наклоняя слайд. Добавьте 50 мкл 0,25% Triton-X в 1x PBS к каждому пятну и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания.
  10. Промойте слайды 3 раза в течение 5 минут в ~ 50-60 мл 0,05% Tween-20 в TBS (TBS-T) в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Таким образом можно обрабатывать 10 слайдов.

3. Блокировка и первичная интубация антител

  1. Удалите TBS-T и высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса. Удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пипетку, не касаясь пятна, или наклоняя слайд. Коротко встряхните блокирующий раствор и добавьте одну каплю (~ 40 мкл) в каждое пятно. Инкубируйте в течение 1 часа при 37 ° C в предварительно разогретой увлажненной камере.
  2. Подготовьте коктейль с антителами, смешав козьим анти-АТМ с 1: 1000 и кролик-антифосфо-Ser15-p53 при 1: 100 в разбавителе коммерческого антитела, разбавителе вихревых антител перед использованием. Для контрольного экспериментаTs, готовят растворы антител, содержащие только козьим анти-АТМ, и только антитело кролика-антифосфо-Ser15-p53 (контроль с одним антителом).
  3. Удалите блокирующий раствор, но будьте осторожны, чтобы клетки не высушивались до добавления разведений антител. Добавьте 30 мкл каждого разбавителя для коктейлей антител и инкубируйте в увлажненной камере в течение ночи при 4 ° C.
  4. Подготовьте промывочный буфер A и промывочный буфер B на месте, растворяя содержимое одного мешка буфера A и буфера B в конечном объеме 1000 мл воды каждый.
    1. Альтернативно, подготовьте промывочный буфер А, растворяя 8,8 г NaCl, 1,2 г Трис-основания и 0,5 мл Tween-20 в 800 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью HCl и добавьте до конечного объема 1000 мл.
    2. Альтернативно, подготовьте промывочный буфер B, растворяя 5,84 г NaCl, 4,24 трис-основания и 26,0 г Трис-HCl в 500 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,5, используя HCl. Добавить воду до конечного объема 1000 мл.
    3. ФильтрОба решения через фильтр 0,22 мкм.
  5. Промойте слайды 2 раза в течение 5 минут с 1x буфером для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с мягким перемешиванием.

4. Зонды PLA, лигирование и амплификация

  1. Подготовьте PLA-зонды, разбавив анти-козьим PLUS и кроличьим MINUS как 1: 5 в коммерческом разбавителе антител. Удалите 1x бункер для промывки in situ A из слайдов и добавьте 30 мкл пробной смеси PLA к каждому пятну. Инкубируйте 1 час при 37 ° C в предварительно нагретой увлажненной камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Любая комбинация зондов PLUS и MINUS PLA с вторичными антителами может быть использована (антимышина, против кролика, против коз), если применяемые первичные антитела возникают у разных видов, а комбинация PLA-зондов всегда должна быть Содержат зонд PLUS и зонд MINUS.
  2. Вымойте слайды 2 раза в течение 5 минут с ~ 50-60 мл 1x буфера для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  3. Подготовьте раствор лигирования-лигазы на льду, добавив 1 мкл лигазы к 39 мкл раствора лигирования и добавьте 40 мкл раствора лигирования-лигазы к каждому пятну. Инкубируйте 30 минут при 37 ° C в предварительно нагретой увлажненной камере.
  4. Промойте слайды 2 раза в течение 5 минут с помощью ~ 50-60 мл 1x буфера для промывки in situ A в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  5. Подготовьте смесь Amplification-Polymerase на льду путем разбавления исходного раствора Amplification 1: 5 в воде. Затем добавляют 0,5 мкл полимеразы к 39,5 мкл 1х раствора для амплификации для каждого пятна.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Реактивы амплификации чувствительны к свету и должны быть защищены от прямого воздействия света. Усилитель-реагент поставляется в четырех разных цветах (RED: возбуждение 594 нм, излучение 624 нм, FarRED: возбуждение 644 нм, излучение 669 нм, ORANGE: возбуждение 554 нм, излучение 576 нм, ЗЕЛЕНЫЙ: возбуждение 501 нм, излучение 523 нм) Убедитесь, что доступная установка микроскопии имеетПодходящие свойства возбуждения и фильтры для имитации этих цветов.
  6. Отключите 1x буфер для промывки in situ A и добавьте 40 мкл смеси Amplification-Polymerase на одно место. Инкубируйте в течение 100 мин при 37 ° С в предварительно разогретой увлажненной камере.

5. Монтаж и обработка изображений

  1. Подготовьте 0,01x буфер для промывки in situ B, добавив 1 мл 1x промывочного буфера B в 99 мл воды.
  2. Отключите смесь Amplification-Polymerase и промойте слайды 2 раза в течение 10 минут с помощью 1x буфера для промывки in situ B в банке Coplin при комнатной температуре с осторожным перемешиванием.
  3. Вымойте слайды 1 мин в 0,01-кратном буфере для промывки B.
  4. Удалите избыток 0,01x промывочного буфера B и высушите слайды вокруг пятен с помощью ткани без ворса. Удалите столько жидкости с места, сколько возможно, используя пипетку, не касаясь пятна, или наклоняя слайд.
  5. Развернуть DAPI-содержащий монтажный материал 1: 5 в монтажной среде без DAPI, чтобы избежать перенапряжения ядер.
  6. Добавьте 25-30 мкл монтажной среды, содержащей 1: 5 DAPI, к покровному стеклу 24 мм x 24 мм и поднимите крышку с помощью ползуна, слегка надавите на то, чтобы не было захваченных пузырьков воздуха. Запечатайте покровное лаком для ногтей и подождите не менее 15 минут до изображения.
  7. Проанализируйте слайды с использованием (конфокального) флуоресцентного микроскопа.
    1. Подсчитайте количество точечных PLA-сигналов на ячейку по меньшей мере в 4 полученных полях изображения (20x объектив, считая по меньшей мере 20 клеток на состояние или комбинацию антител, на основе расчета мощности с использованием ожидаемого среднего 7 ± 5 сигналов в обработанных клетках, И 2 ± 2 сигнала в необработанных клетках с вероятностью ошибки типа I 0,05 и мощностью 80%, как сообщалось ранее 15 ).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Наилучшее разрешение достигается путем приобретения Z-стека и деконволюции с использованием пакетов программного обеспечения ( например , ImageJ, Leica Acquisition Suite (LAS)). ЗнакДолжно быть легко видно в пределах ядерного периметра, как определено окрашиванием DAPI.
    2. Не считайте сигналы, которые явно появляются за пределами ядер. Как правило, обработка NCS или γ-облучение приводит к приблизительно 5-10 сигналам PLA PHOSO-p53 / ATM на клетку. Элементы управления «одним антителом» могут давать некоторый фоновый сигнал, но это не должно превышать 1-2 PLA-сигналов на 1 из каждых 20 ячеек.
    3. Для публикации и презентаций, захватите изображения, используя цель погружения 40X или 63X. Слайды могут храниться при температуре 4 ° C и должны быть защищены от воздействия света.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Показано, что фосфорилирование р53 в остатке Ser15 зависит от активности киназы АТМ 16 . Чтобы продемонстрировать и подтвердить специфичность метода PLA на цитоспиновых препаратах культур суспензионных клеток, показано, что индукция повреждения ДНК через 2 часа NCS-обработка клеток BCR-ABL + B-ALL, арестованных в G1-фазе клеточного цикла Привели к специфическому взаимодействию между АТМ и фосфо-Ser15-p53, как и ожидалось. Пунктуальные сигналы PLA наблюдались в ядр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом отчете показано, что PLA может использоваться для определения и визуализации специфического взаимодействия между белками в культурах суспензионных клеток. Следует отметить, что описанный здесь протокол не ограничивается изучением комплексов восстановления ДНК, но также применяется для визуализации и количественного определения других белково-белковых взаимодействий в культурах суспензионных клеток. Показано, что киназа АТМ взаимодействует с фосфорилированным р53 в G1-арестованных клетках BCR-ABL + B-ALL при возде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследования в лаборатории Guikema финансируются за счет схемы инновационных исследовательских стимулов из Нидерландской организации по научным исследованиям (грант VIDI 016126355) и KiKA Stichting Kinderen Kankervrij '(проект 252).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточная линия BV173DSMZAC-20BCR-ABL+ B-ALL клеточная
линия SUP-B15 клеточная линияDSMZACC-389BCR-ABL+ B-ALL клеточная линия
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Gibco (Life Technologies)21980-032
Фетальная сыворотка теленкаSigma AldrichF7524лот #: 064M3396
L-глутаминGibco (Life Технологии)25030-024
пенициллин/стрептомицинGibco (Life Technologies)15140-122
иматиниб метансульфонатLC LaboratoriesI-5508Растворить в ДМСО, приготовить 10 мМ стоковый раствор
неокарциностатинаSigma AldrichN9162Мутагенный/тератогенный, обращаться с осторожностью
KU55933SelleckchemS1092Растворить в ДМСО, приготовить 5 мМ стоковый раствор
Starfrost Microscopy SlidesWaldemar KnittelVA11200 003FKB
PAP ручка жидкий блокаторSigma AldrichZ377821-1EA
Cytospin воронкаQ Path Labonord SAS003411324
Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/RabbitSigma AldrichDUO92105Доступно для различных видов/комбинаций, также доступно в FarRED, Orange и Green
goat-anti-ATMBethyl LaboratoriesA300-136APLA-grade; мы успешно использовали лот #A300-136A-1 в наших исследованиях
кролик-антифосфо-Ser15-p53Технология клеточной сигнализации9284Мы успешно использовали лот #9284-4 в наших исследованиях
Vectashield antifading монтажная среда с DAPIVector LabsH-1200
Vectashield антивыцветающая монтажная средаVector LabsH-1000
4% параформальдегид в PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692Также доступен у различных других поставщиков

Ссылки

  1. Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716(2013).
  2. Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2010).
  3. Bekker-Jensen, S., Mailand, N. Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells. DNA Repair. 9 (12), 1219-1228 (2010).
  4. Matsuoka, S., et al. ATM and ATR substrate analysis reveals extensive protein networks responsive to DNA damage. Science. 316 (5828), 1160-1166 (2007).
  5. Barlow, C., Brown, K. D., Deng, C. X., Tagle, D. A., Wynshaw-Boris, A. Atm selectively regulates distinct p53-dependent cell-cycle checkpoint and apoptotic pathways. Nature Genet. 17 (4), 453-456 (1997).
  6. Tibbetts, R. S., et al. A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13 (2), 152-157 (1999).
  7. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction Multicolor Imaging of the Nuclear Periphery with 3D Structured Illumination Microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  8. Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair. J Cell Sci. 125 (Pt 15), 3529-3534 (2012).
  9. Gullberg, M., et al. A sense of closeness: protein detection by proximity ligation. Curr Opin Biotechnol. 14 (1), 82-86 (2003).
  10. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  11. Dong, Y., Shannon, C. Heterogeneous immunosensing using antigen and antibody monolayers on gold surfaces with electrochemical and scanning probe detection. Anal Chem. 72 (11), 2371-2376 (2000).
  12. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  13. Economopoulou, P., Pappa, V., Papageorgiou, S., Dervenoulas, J., Economopoulos, T. Abnormalities of DNA repair mechanisms in common hematological malignancies. Leuk Lymphoma. 52 (4), 567-582 (2011).
  14. Rendleman, J., et al. Genetic variation in DNA repair pathways and risk of non-Hodgkin's lymphoma. PloS One. 9 (7), e101685(2014).
  15. Ochodnicka-Mackovicova, K., et al. The DNA Damage Response Regulates RAG1/2 Expression in Pre-B Cells through ATM-FOXO1 Signaling. J Immunol. , (2016).
  16. Banin, S., et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281 (5383), 1674-1677 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ответ на повреждение ДНКвзаимодействие ATM и p53визуализация белковых комплексовфлуоресцентная микроскопияостановка клеточного циклакоктейли антителподготовка цитоспиновконфокальная визуализация
Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.