Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышцы с короткими осями для желудочковых сердец для электрофизиологических исследований

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55725

⸱

4 июня 2017 г.

 ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University of Cologne, 2Institute for Neurophysiology, University of Cologne

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем подготовку жизнеспособных сегментов желудочков у взрослых мышей и их использование для записи о потенциальных потенциальных возможностях электродов. Эти многоклеточные препараты обеспечивают сохраненную in vivo структуру ткани, что делает их ценной моделью для электрофизиологических и фармакологических исследований in vitro .

Аннотация

Мышечные кардиомиоциты широко используются для исследований физиологии сердца и новых терапевтических стратегий in vitro . Однако многоклеточные препараты диссоциированных кардиомиоцитов не являются репрезентативными для комплексной in vivo структуры кардиомиоцитов, немиоцитов и внеклеточного матрикса, что влияет как на механические, так и на электрофизиологические свойства сердца. Здесь мы описываем методику подготовки жизнеспособных желудочковых срезов взрослых мышечных сердец с сохраненной структурой, подобной ткани in vivo , и демонстрируем их пригодность для электрофизиологических записей. После удаления сердца желудочки отделяются от предсердий, перфузируются бескислотным раствором Ca 2+, содержащим 2,3-бутанионный моноксим, и внедряют в 4% низкоплавкий агарозный блок. Блок размещен на микротоме с вибрирующим лезвием, а кусочки ткани толщиной 150-400 мкм подготовлены, сохраняя частоту вибрацииЧастота лезвия на 60-70 Гц и перемещение лезвия вперед как можно медленнее. Толщина срезов зависит от дальнейшего применения. Ломтики хранятся в ледяном растворе Tyrode с 0,9 мМ Ca 2+ и 2,3-бутандионмоноксимом (BDM) в течение 30 мин. Затем срезы переносят в DMEM на 37 ° C в течение 30 минут для промывки BDM. Ломтики могут использоваться для электрофизиологических исследований с острыми электродами или микроэлектронными массивами, для измерения силы для анализа сократительной функции или для исследования взаимодействия трансформированных стволовых клеток-кардиомиоцитов и ткани хозяина. Для резких записей электродов срез помещают в чашку для культивирования клеток размером 3 см на нагревательной пластине перевернутого микроскопа. Лоскут стимулируется однополярным электродом, а потенциал внутриклеточного действия кардиомиоцитов внутри среза регистрируется острым стеклянным электродом.

Введение

Тонкие срезы ткани часто использовались в фундаментальной науке, так как в 1966 году Ямамот и Маклвейн показали, что электрическая активность срезов мозга поддерживается in vitro 1 . С тех пор электрофизиологические и фармакологические исследования проводились на срезах из мозга 2 , печени 3 , легкого 4 и ткани миокарда 5 , 6 , 7 . Первые записи патч-зажима в желудочковых срезах из сердец новорожденных крыс были описаны в 1990 году 8 , но эта техника в течение некоторого времени зашла в небытие. Спустя более десятилетия наша группа разработала новый метод подготовки мышиных эмбриональных 9 , неонатальных 10 и взрослых 11 срезов сердца. Эти жизнеспособные срезы ткани могут использоваться для острых экспериментов (взрослый срезS можно культивировать в течение нескольких часов) или краткосрочные эксперименты с культурой (зародыши и новорожденные срезы можно культивировать в течение нескольких дней). Ломтики демонстрируют in vivo, как электрофизиологические характеристики, и гомогенный разброс возбуждения, оцениваемый с помощью резкого потенциала действия электрода и записей микроэлектродов. Благодаря своей «двумерной» морфологии они позволяют осуществлять прямой доступ к регистрирующим электродам во все области желудочка, что делает их интересным инструментом для электрофизиологических исследований и создает новые экспериментальные варианты по сравнению с перентованными сердцами Лангендорфа. Реакция лекарственного средства срезов на блокаторы ионных каналов, такие как верапамил (L-тип Ca 2+ -канальный блокатор), лидокаин (блокатор Na + -канала), 4-аминопиридин (неселективный зависимый от напряжения K + -канальный блокатор) и линопирдин (KCNQ K + -канальный блокатор) 9 , 11 соответствует известным эффектам на диссоциированных кардиомиоцитах. Измерения изометрической силы выявили положительную частотную зависимость силы и сильно предложили неповрежденную сократительную функцию 10 . Эти данные показали, что мышиные желудочковые срезы пригодны в качестве модели ткани in vitro для физиологических и фармакологических исследований. Кроме того, желудочковые срезы сердечников-реципиентов в сочетании с резкой записью электродов оказались очень полезным инструментом для характеристики электрической и механической интеграции, а также созревания трансплантированных эмбриональных карциномиоцитов 12 , 13 , 14 и стволовых клеток.

Таким образом, желудочковые срезы представляют собой ценную и хорошо устанавливаемую многоклеточную модель ткани и должны считаться комплементарными диссоциированным кардиомиоцитам и сердечно-перфузионным сердцам ЛангендорфаВ кардиоваскулярных исследованиях, с основным преимуществом обеспечения структуры in vivo как ткани (в отличие от диссоциированных клеток), а также прямого доступа к измерительным технологиям, таким как резкие записи электродов во все области сердца (в отличие от цельных препаратов сердца).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Обработка животных должна соответствовать руководящим принципам местного комитета по охране животных и Директиве ЕС / 63 / ЕС Европейского парламента.

1. Подготовьте решения

  1. Подготовьте раствор Tyrode без Ca 2+ (состав в мМ): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, глюкоза 10, HEPES 5, 2,3-бутандионовый моноксим (BDM) 30. Отрегулируйте pH до 7,4 С NaOH при 4 ° С.
  2. Подготовьте раствор Tyrode с Ca 2+ (композиция в мМ): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, глюкоза 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Отрегулируйте рН до 7,4 с помощью NaOH при 4 ° C.
  3. Подготовьте 4% низкоплавкую агарозу: поставьте 0,6 г низкоплавкой агарозы в 15 мл раствора Tyrode без Ca 2+ . Разогреть смесь в микроволновой печи два раза при 750 Вт в течение 10-15 с до растворения агарозы. Хранить раствор при постоянной температуре 37 &# 176; C и перемешивать непрерывно.
  4. Держите Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) без сыворотки при 37 ° C, барботированной карбоэфиром (5% CO 2 , 95% O 2 ).

2. Подготовьте микротом

  1. Включите микротом.
  2. Заполните внешнюю камеру микротомом льдом.
  3. Заполните внутреннюю камеру микротома ледяным раствором Tyrode без Ca 2+ и непрерывно кислородсодержащим раствором со 100% O 2 .
  4. Поместите стальное лезвие в держатель лезвия микротома.

3. Изоляция сердца мыши

  1. Инъекция 2500 г гепарина подкожно. Подождите 15 мин.
  2. Жертвоприношение животного путем вывиха шейки матки.
  3. Откройте сундук с помощью стернотомии.
  4. Осторожно рассечь перикард, используя маленькие ножницы и щипцы №5.
  5. Вставьте канюлю в восходящую аорту и перфузируйте коронарные артерии на месте с ледяным холодом. Tyrode'sРаствор без Ca 2+ до тех пор, пока оставшаяся кровь не будет удалена.
  6. Аккуратно удалите сердце с помощью щипцов и ножниц и перенесите сердце в холодный лед. Решение Tyrode поехало без Ca 2+ .
  7. Отделите предсердия от желудочков скальпелем или ножницами.

4. Внедрение желудочков в 4% агарозы с низким содержанием расплава

  1. Поместите желудочки с вершиной, направленной вверх в агарозную форму ( рис. 1 ). Поместите штифт в середину формы в камеру левого желудочка.
  2. Заполните форму 4% низкоплавкой агарозой при 37 ° C, пока сердце не полностью закрывается.
  3. Поместите форму на лед для более быстрого отверждения агарозы, предотвращающего плавание ткани.
  4. Удалите агарозный блок, содержащий желудочки из формы, с помощью скальпеля.
  5. Переверните блок вверх дном и заполните желудочковые камеры и зазор на задней стороне блока агарозы, который яС левой штифтом линьки, с 4% низкоплавкой агарозой с использованием шприца с иглой 20 G.
  6. Обрежьте агарозный блок скальпелем для достижения плоского дна блока и вертикального положения сердечной вершины.

5. Нарезка желудочковой ткани

  1. Закрепите блок на держателе образца микротома каплей цианоакрилатного клея. Возьмитесь за верхнюю часть сердца.
  2. Поместите держатель образца во внутреннюю камеру образца микротома, заполненную ледяным тиродом без Ca 2+ . Полностью покрыть агарозный блок раствором Tyrode.
  3. Подготовьте короткие осевые срезы толщиной 150-400 мкм в зависимости от дальнейшего применения (для резких записей электродов 150-200 мкм), поддерживайте частоту вибрации лезвия на 60-70 Гц и перемещайте лезвие вперед как можно медленнее ,
  4. Используйте тонкую кисть, чтобы аккуратно удалить оставшуюся агарозу из ломтиков.
  5. Мягко переливайтеR с пипеткой Пастера в раствор Tyrode с 0,9 мМ Ca 2+, аэрированным со 100% O 2, и хранить их как минимум 30 минут на льду для восстановления после процедуры нарезки.
  6. Затем оставляйте ломтики в течение 30 минут в DMEM при 37 ° C, аэрированные карбогеном, для промывки BDM перед дальнейшим использованием.

6. Подготовка настройки Sharp Electrode

  1. Для предварительного нагрева включите все электрические устройства за 30 минут до начала записи.
  2. Поместите 3 см культуральную чашку на нагревательную пластину, помещенную на инвертированный микроскоп.
  3. Поместите заказной кольцевой электрод ( рисунок 2 ) в тарелку и соедините провода заземления предварительного усилителя и электрода стимуляции.
  4. Подключите гибкие трубки перфузионной системы к тарелке.
  5. Заполните резервуар системы перфузии DMEM, аэрированный карбогеном.
  6. Включите перфузионный насос и установите перфузиюТ до 2-3 мл / мин.
  7. Отрегулируйте температуру DMEM в чашке до 37 ° C, регулируя нагреватель потока и нагревательную плиту.

7. Потенциальные записи действий

  1. Поместите желудочковую часть в заполненную DMEM тарелку.
  2. Проверьте структурную целостность и жизнеспособность (на основе сократительной функции) ткани с помощью инвертированного микроскопа.
  3. Заполните записывающий стеклянный электрод 3 M KCL.
  4. Заполните электродом стимуляции DMEM.
  5. Поместите регистрирующий электрод и электрод стимуляции на держатели электродов.
  6. Поместите стимулирующий электрод аккуратно на срез и включите электрический стимулятор. Начните с частоты стимуляции 1-2 Гц.
  7. Переместите записывающий электрод с помощью микроманипулятора в заданное положение записи.
  8. Медленно опускайте регистрирующий электрод, пока наконечник не коснется ткани.
  9. Нанесите короткий прямоугольный электрический импульс черезРегистрирующий электрод для проникновения в клеточную мембрану.
  10. Тщательно переместите регистрирующий электрод, пока не будет обеспечен стабильный сигнал.
  11. Начать запись потенциалов действия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Инфаркт миокарда приводит к практически необратимой потере кардиомиоцитов. Клеточная заместительная терапия с использованием кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, для экзогенной регенерации сердца является перспективным терапевтическим подходом. Электрическая интеграция и созревание трансплантированных клеток имеют решающее значение для безопасности и эффективности заместительной терапии клеток.

Для оценки интеграции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Желудочковые срезы позволяют проводить электрофизиологические, фармакологические и механические исследования с сохраненной структурой ткани, подобной ткани in vivo , и прямым доступом к измерительной технологии во все области сердца. Свойства потенциала физиологического действия были продемонстрированы в эмбриональных, неонатальных и взрослых срезах 9 , 10 , 11 . Жизнеспособность срезов, за исключением поверхностных сл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего объявлять.

Благодарности

Мы признаем поддержку, оказываемую семинарами и животным учреждением Института нейрофизиологии. Эта работа была поддержана Уолтером и Маргой Болл-Стифтунгом, Кёльном Форчунтом и Немецкой школой для Герцфоршунга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Leica VT 1000sLeica Microsystems, Вецлар, ГерманияМикротом с вибрационным лезвием.
Лезвия из нержавеющей сталиCampden Instruments, Лафборо, Англия7550-1-SS
Пипетки ПастераSigma-Aldrich, Сент-Луиза, СШАZ627992
Тонкая щетка, e. размер 6 (4/32")VWR, International, Radnor, США149-2125
Столсамостоятельно изготовленный
Molt для встраивания желудочков в самодельный шприц агарозы
1 млBecton, Dickinson; Franklin Lakes, США300013
27 г x 3/4 '' ИглыBraun, Мельзунген, Германия4657705
20 г 11/2'' Иглы4657519
маленькими ножницамиWPI, Сарасота, США 501263
Пинцет #5, 0,1 x 0,06 мм наконечникWPI, Сарасота, США500342
Газообразный кислород (медицинский класс O2)Linde, Мюнхен, Германия
Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2)Linde, Мюнхен, Германия
NaClSigma-Aldrich, St. Louise, США7647-14-5
KClSigma-Aldrich, St. Louise, США746436
CaCl2Sigma-Aldrich, St. Louise, США746495
KH2PO4Sigma-Aldrich, St. Louise, СШАNIST200B
HEPESSigma-Aldrich, St. Louise, США51558
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louise, СШАS5761
D(+)-GlucoseSigma-Aldrich, St. Louise, СШАG8270
MgSO4Sigma-Aldrich, Сент-Луиза, СШАM7506
NaOHSigma-Aldrich, Сент-Луиза, СШАS8045
Цианоакрилатный клейHenkel, Dü ссельдорф, Германия
Низкоплавкая агарозаRoth, Карлсруэ, Германия6351,2
Гепарин-натрий-25000 I.E./5 млRatiopharm, Ульм, Германия
Модифицированная орлиная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAXThermoScientific, Waltham, США 10566016
SEC-10LX Amplifiernpi electronic GmbH, Тамм, ГерманияSEC-10LX
EPC 9HEKA Elektronik GmbH, Ламбрехт, Германия
Zeiss Axiovert 200Zeiss, Оберкохен, Германия
Микроманипулятор малого увеличенияNarashige, Токио, ЯпонияNm-3
увеличение, трехосевой микроманипуляторNarashige, Токио, ЯпонияMHW-3
Перистальтический перфузионный насосMulti Channel Systems, Ройтлинген, ГерманияPPS2
2-канальный регулятор температуры Многоканальныесистемы, Ройтлинген, ГерманияTCO02
Квадратный пульс-стимуляторNatus Europe GmbH, Planegg, ГерманияGrass SD9
Стеклянные капиллярыWPI, Сарасота, США1B150F-1
для приготовления Большое

Ссылки

  1. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
  2. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
  3. Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
  4. Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).
  5. Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
  6. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
  7. Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
  8. Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
  9. Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
  10. Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
  11. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
  12. Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
  13. Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
  14. Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
  15. Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
  16. Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
  17. Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
  18. Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
  19. Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мышцы с короткими осями для желудочковых сердец для электрофизиологических исследований
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.