Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Перенакопления Ileectomy индуцированной желчи в кишечнике мыши

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55728

⸱

21 августа 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Case Cardiovascular Research Institute, Case Western Reserve University, 2Harrington Heart and Vascular Institute, University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Institute for Transformative Molecular Medicine, Case Western Reserve University School of Medicine, University Hospitals Cleveland Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Тонкой кишки зависимых желчные кислоты реабсорбции и обратной связи торможение синтеза печени желчных кислот имеет важное значение для системного гомеостаза и здравоохранения. В этом исследовании мы описываем модель мыши для подвздошной резекции для оценки ileectomy индуцированной желчь мальабсорбции, перенакопления и токсичности в кишечнике мыши.

Аннотация

Кишечные резекции является общий терапевтический подход для человека заболеваний, как ожирение, воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона и рака толстой кишки, что часто приводит к тяжелой короткого кишечника синдром как неблагоприятные последствия, включая диарею желчных кислот, обезвоживание, помехи электролита и всасывания питательных веществ. Здесь мы представляем модель мышиных ИЛЕАЛ резекции, называют ileectomy, оценить ткани коммуникации и поддержания системных гомеостаза. После ИЛЕАЛ резекции циркулирующей крови лишена постоянно фактор роста фибробластов подвздошной кишки конкретных эндокринных гормонов 15 (FGF15), который выпускает его эндокринными ингибиция синтеза желчных кислот в печени. В сочетании с ростом производства и отменено реабсорбции после удаления подвздошной кишки желчных кислот мышей, которые перенес операцию страдают от перенакопления соли желчи в кишечнике и связанных понос, заболеваемости и смертности. Роман использование модели хирургии, введенной в этом исследовании может обеспечить механистическим и функциональных понимание ИЛЕАЛ контроль системных метаболических регулирования в физиологии и патологии.

Введение

В современных биомедицинских исследований генетически модифицированных животных модели широко используются подбирать понимание заболеваний человека. В частности для изучения молекулярных регулирования, а также индуцированной биологические эффекты были использованы ткани или клетки конкретные выгоды и потери функции генов. Несмотря на успехи в манипулировании целевых генов в естественных условияхявляются сохраняющиеся ограничения. Первый, многие клетки или ткани конкретные изъятия будет влиять на несколько органов. Например эпителиальные гена удаления устранит выражение в эпителия нескольких тканей. Кроме того даже если исключить ограничивается конкретной ткани, пространственного управления редко осуществимо. Например в ткани как кишечник, разных сегментов выполнения весьма конкретных функций, которые нельзя манипулировать с точностью в естественных условиях. В таких ситуациях резекции тканей ген содержащих считается более эффективным изучение подход для определения механистическим и функциональной значимости ткани коммуникации.

Ileectomy является главным образом используется в больных Крона и воспалительных заболеваниях, сопровождающихся дистальной части подвздошной кишки 1,2,3. Подвздошной кишки обычно производит несколько гормонов, хранения энергии как фактор роста фибробластов 15/19 (FGF15/19), пептид YY (PYY) и глюкагон как пептид 1/2 (GLP1/2); Эти гормоны играют важную роль местных и эндокринной многих биологических функций4,5,6. Среди этих гормонов была обнаружена FGF15 как надежный эндокринной ингибитор синтеза желчных кислот в печени. После реабсорбируется в подвздошной enterocytes, желчных кислот активировать ядерных рецепторов farnesoid X рецептор (FXR) для стимулирования Fgf15 выражение, которое впоследствии приводит к обратной связи торможение синтеза печени желчных кислот 7. В недавнем исследовании, мы ввели мыши ileectomy модель для изучения ИЛЕАЛ kruppel подобный фактор 15 (KLF15) -Fgf15 сигнализации оси, который регулирует производство суточного желчных кислот в печени 8. Самое главное мы ввели новые семьи, kruppel как факторы, особенно KLF15, в биологии желчных кислот. На основе функциональных исследований, включая ileectomy хирургии, мы определили что upregulates KLF15 синтез желчных кислот через косвенные механизм не печени. Наконец подвздошной KLF15 также идентифицируется как первый эндогенного негативный регулятор Fgf15.

Кишечные сегментов, спуская от проксимальнее дистальной регионы отвечают за поглощение различных питательных веществ. Подвздошной кишки является основной сегмент ответственных за желчные кислоты и витамин B12 (B12V) поглощения 9. Более ранние исследования работают мыши модель резекции проксимального отдела кишки для изучения синдром укороченной тонкой кишки; для поддержания оптимального послеоперационный выживание ставки 10были предложены различные длины резекции, диеты и типы швов. Кроме того более недавний обзор указывает, что что ИЛЕАЛ резекции обычно приводит к более тяжелой болезни, чем другие желудочно-кишечные резекции сегмента (GI) благодаря снижению адаптационного потенциала остальных тракта 11. Эта тема приобрела интенсивные интересы групп фундаментальных и клинических исследований, тогда как понимание восстановления и эффективные терапевтические подходы по-прежнему ограничены.

Желчные кислоты понос является результатом диспропорции в желчные кислоты гомеостаза в энтерогепатической циркуляции 12,13. Это может быть следствием ИЛЕАЛ резекции, желудочно-кишечные заболевания или результат идиопатическая желчные кислоты мальабсорбции. Более чем 80% пациентов были найдены представить с понос после прохождения ИЛЕАЛ резекции 14. Ileectomy имеет потенциал, чтобы быть важным хирургии модель для расследования случаев диареи желчных кислот. В этом исследовании серия ИЛЕАЛ резекций предоставляют градиента оценки FGF15 дефицит, а также кишечной соли желчных мальабсорбции, перенакопления и токсичных ущерба.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

животных протокол был рассмотрен и одобрен институциональный уход животных и использования Комитетом на случай Western Reserve University School of Medicine и был проведен в соответствии с руководством национальных институтов здравоохранения (НИЗ) для Уход и использование лабораторных животных (8-е издание, 2011). Мышей были умерщвлены методами, совместимый с американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) руководящие принципы для эвтаназии животных (издание 2013). Мужчина, 8-16 неделя старый мышей C57Bl/6J, были использованы в настоящем Протоколе. Мышей были размещены в среде темно/свет цикла 12 ч.

1. Предварительная Оперативная подготовка

  1. передачи мышей к чистой клетке 24 часа до процедуры. Разрешить животных свободный доступ к воде. Заменить Чоу пищи мягкой пищи (гель добавка) 4-6 ч до операции, чтобы уменьшить содержимое тонкой кишки для хирургии.
  2. Стерилизации всех хирургических инструментов и подготовить одноразовые стерильные хирургические материалы. Чистота области операции и анестезии носовой конус с 70% этанол.
  3. Настройка микроскопом рассечение, изофлюрановая обезболивающий спрей, инструментов и контролем температуры животных хирургические столик для поддержания температуры тела. Организовать инструменты, швы и шприцы в месте для свободного доступа во время операции.
  4. Настроить источник света для обеспечения достаточно света для области хирургической.
  5. Подготовить стерильного 0,9% физиологического раствора в 5 мл шприц для очистки кишечника и брюшной.

2. Ileectomy и анастомоза

  1. Anesthetize мышей с изофлюрановая (2-3%) в камере мелких животных инкубации. Определить адекватной анестезии, с использованием метода щепотку мыс, в то время как животное находится на изофлюрановая.
  2. Удалить живота волос, применяя продукт удаления волос и удаление волос с помощью хирургического губки при поддержании анестезии. Поместите курсор мыши на контролируемой температурой животных хирургические столик ( рис. 1 A) для поддержания температуры тела на 37 ° C. поддержания анестезии с изофлюрановая (1-2%) через маску. Лечить глаза мыши глазной мазью.
  3. Очистить кожу, используя повидон йода и 70% спирта и охватывают хирургические области живота с хирургические стерильные марлевые ( рис. 1 Б).
  4. Сделать срединной брюшной разрез с помощью хирургического скальпеля после анестезии в силу. Использовать хлопок наконечником аппликатором для защиты кишечника и тянуть мышь брюшной мышцы с ретракторы полностью открывать и разоблачить брюшной полости ( рис. 1 C).
  5. Найти слепой кишки. Начиная от слепой кишки, тщательно перемещать подключенных подвздошной кишки и частью тощей кишки из брюшной полости ( рис. 1 D).
    Примечание: Слепой кишки могут быть легко идентифицированы из-за ее большого размера даже после голодания.
  6. Перевязать верхней ветке превосходной верхней брыжеечной артерии с Шелковый шов 7-0 чтобы загородить крови поставки Илеал сегмент, который должен быть вырезан. Подвздошной цвет меняется от розового до темно-фиолетового после перевязки. (E - F рис. 1).
  7. В зависимости от цели эксперимента, используя ножницы, акцизов и удаление 50% или 90% подвздошной кишки.
    Примечание: Для Шам хирургии, не выполняют лигирование превосходной верхней брыжеечной артерии и не удаляйте подвздошной кишки.
  8. Потолочные люмен эндз ИЛЕАЛ с 0,9% физиологического раствора.
    Примечание: как оставшихся нетронутыми подвздошной кишки продолжает получать нормальное кровоснабжение от превосходной верхней брыжеечной артерии, небольшое количество крови будет промыть во время процесса. Это также означает, что кровоснабжение ИЛЕАЛ концы нормально и обеспечивает не ишемии при процедуре анастомоза ( рис. 1 G).
  9. Найти мезентерии на стороне обеих ИЛЕАЛ заканчивается. Совместите мезентерии и шовные ИЛЕАЛ концы вместе, используя шов ( рис. 1 G - H) 8-0.
  10. Шов контралатеральную сторону подвздошной кишки сохранить подвздошной кишки анастамозные естественным образом ( Рисунок 1 я).
  11. Шов верхняя и нижняя стороны между двумя оригинальные швы тщательно соединения двух ИЛЕАЛ концы вместе ( рис. 1 J).
  12. Подтверждают, что нет никакой утечки из сайта анастомоза после завершения процедуры сшивающие три шага ( рис. 1 G-я). Возвращение слепой кишки и тонкого кишечника в брюшную полость в исходное расположение анатомических. Промойте области хирургии с теплой 0,9% физиологического раствора, тупой иглой. ( рис. 1 K).
  13. Закройте разрез брюшной мышцы слоя шва 6-0. Совместите брюшной Кожный разрез с помощью щипцов и шовные брюшной кожи для содействия оптимального заживление ран ( рис. 1 L).

3. Послеоперационный уход

  1. передачи после операции мышей в отделении интенсивной терапии для восстановления. Дом их в клетке бумаги-постельные принадлежности на контролируемой температурой грелку для продолжения восстановления после операции на ночь. Поставки мышей с мягкой пищи помимо обычных продуктов питания и воды.
  2. Администрировать бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг) с подкожной инъекции каждые 8-12 ч для анальгезии.
    Примечание: Усыпить мышей на CO 2, если серьезно больны.
  3. В конечной точке, пожертвуйте мышей с использованием передозировка изофлюрановая и урожай образцов при необходимости (раздел 4).

4. Оценка Ileectomy индуцированной желчь перенакопления

  1. весят и вскрыть мышей один день после резекции 0% (фиктивный), 50% или 90% подвздошную.
  2. Удаление желудочно-Кишечного тракта и взвесить его. Рассчитать вес GI соотношение веса тела для оценки тяжести соли желчных мальабсорбции и перенакопления.
  3. Перевести GI участки в 15 мл конические трубы и порежьте их на короткие сегменты с помощью ножниц. После резки, центрифуги на 3000 x g для 10 минут передать чистой труба супернатант (GI жидкости содержащие желчных солей).
  4. Измерить общий объем и вес GI жидкости и рассчитать жидкости вес в удельная тракта GI для дальнейшей оценки перенакопления желчи в Желудочно-кишечном тракте.
  5. Определить сумму всего желчь в надосадке пробирного желчные кислоты как описано в ссылка 8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедуры для ileectomy показано на рисунке 1. Первый этап включает в себя подготовку мыши брюшной кожи, делая разрез брюшной и полностью разоблачить кишечника (рис. 1A-C) с помощью ретракторы. Далее, слепой кишки мыши был расположен (рис. 1D); Учитывая, что ее размер и форма делают его легко узнаваемый ориентир. Слепой кишки, подвздошной кишки и частью дистальной то...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для выполнения успешной ileectomy, превосходной верхней брыжеечной артерии должны быть лигируют заранее блокировать приток крови к resecting сегмента. Ишемические сегмент подвздошной станет темно-фиолетовый после перевязки. Необходимо затем полностью резецируется ИЛЕАЛ сегмента. Нормальное кровоснабжение должна обеспечиваться на Нераспределенная заканчивается. Это важно для предотвращения кровотечения и неправильного удаления, который можно легко причиной хирургического сбой ишемического некроза после сшивания. Во время ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование поддерживается Фондом тома Петерсона и низ предоставляют R01-HL119780 (Джайн, MK).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Диссекционный микроскопOlympusSZ61для хирургии 
Регулятор температуры животныхPhysitemp Instruments, Inc.TCAT-2LVДля контроля температуры тела
Изофлуран анестетик вапорайзерVetEquip  911104Для анестезии
Рассекционные щипцы  Fine Science Tools, Inc.11274-20Для хирургии 
Ножницы  Fine Science Tools, Inc.14084-08Для хирургии 
Иглодержатель  Робоз Хирургический Инструмент Ко.RS-7882Для хирургии 
Микро ножи-игольчатое лезвиеFisher Scientific10318-14Для хирургии 
6-0 монофиламентный шовный материалEthicon1698GДля закрытия кожи живота
7-0 шелковый шовEthicon766GДля лигирования
8-0 монофиламентный шовный материалEthicon1714GДля анастомоза
Хирургические губкиDynarex Corp.3333Для хирургии 
Маленькие аппликаторы с ватными наконечниками Fisher Scientific23-400-118Для хирургии 
ИзофлуранPiramal Healthcare Limited66794-013-25Для анестезии
Бупренорфина гидрохлоридReckitt-Benckiser Pharmaceuticals12496-0757-1Для обезболивания
0,9% натрия хлорид для инъекцийB. Braun Medical Inc.0264-7800-10Для мытья/инъекций
раствор для приготовления йода повидонаDynarex Corp.1413Для подготовки кожи
Ветеринарная мазь PuralubeDechra Veterinary Products17033-211-38Для защиты глаз
Лосьон для снятия волосChurch & Дуайт Ко., Инк.Для подготовки кожи
Отделение интенсивной терапииThermoCareFW-1Для послеоперационного восстановления
DietGel recoveryClearH2O72-06-5022Для послеоперационного восстановления
Aurum набор для общей РНК жировой и волокнистой тканиBio-Rad7326830Для выделения РНК
iScript супермикс обратной транскрипции для ОТ-кПЦРBio-Rad1708841Для анализ обратной транскрипции
TaqMan fast advanced master mixApplied Biosystems/Life Technologies4444965Для анализа QPCR
Набор для анализа общей желчной кислотыGenzyme DiagnosticDZ042A-K01Для анализа желчных кислот
C57BL/6J Лаборатория Джексона

Ссылки

  1. McLeod, R. S. Surgery for inflammatory bowel diseases. Dig Dis. 21, 168-179 (2003).
  2. Hancock, L., Windsor, A. C., Mortensen, N. J. Inflammatory bowel disease: the view of the surgeon. Colorectal Dis. 8, 10-14 (2006).
  3. Polle, S. W., Bemelman, W. A. Surgery insight: minimally invasive surgery for IBD. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 4, 324-335 (2007).
  4. Fon Tacer, K., et al. Research resource: Comprehensive expression atlas of the fibroblast growth factor system in adult mouse. Mol Endocrinol. 24, 2050-2064 (2010).
  5. Pournaras, D. J., et al. The role of bile after Roux-en-Y gastric bypass in promoting weight loss and improving glycaemic control. Endocrinology. 153, 3613-3619 (2012).
  6. Spreckley, E., Murphy, K. G. The L-Cell in Nutritional Sensing and the Regulation of Appetite. Front Nutr. 2, 23(2015).
  7. Inagaki, T., et al. Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis. Cell Metab. 2, 217-225 (2005).
  8. Han, S., et al. Circadian control of bile acid synthesis by a KLF15-Fgf15 axis. Nat Commun. 6, 7231(2015).
  9. Christl, S. U., Scheppach, W. Metabolic consequences of total colectomy. Scand J Gastroenterol Suppl. 222, 20-24 (1997).
  10. Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. J Am Coll Surg. 183, 441-449 (1996).
  11. Tappenden, K. A. Pathophysiology of short bowel syndrome: considerations of resected and residual anatomy. J Parenter Enteral Nutr. 38, 14-22 (2014).
  12. Camilleri, M. Bile Acid diarrhea: prevalence, pathogenesis, and therapy. Gut Liver. 9, 332-339 (2015).
  13. Camilleri, M. Advances in understanding of bile acid diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 8, 49-61 (2014).
  14. Mottacki, N., Simren, M., Bajor, A. Review article: bile acid diarrhoea - pathogenesis, diagnosis and management. Aliment Pharmacol Ther. 43, 884-898 (2016).
  15. Rao, A., et al. The organic solute transporter alpha-beta, Ostalpha-Ostbeta, is essential for intestinal bile acid transport and homeostasis. Proc Natl Acad Sci. 105, 3891-3896 (2008).
  16. Hofmann, A. F., Poley, J. R. Cholestyramine treatment of diarrhea associated with ileal resection. N Engl J Med. 281, 397-402 (1969).
  17. Kir, S., et al. FGF19 as a postprandial, insulin-independent activator of hepatic protein and glycogen synthesis. Science. 331, 1621-1624 (2011).
  18. Kuipers, F., Bloks, V. W., Groen, A. K. Beyond intestinal soap--bile acids in metabolic control. Nat Rev Endocrinol. 10, 488-498 (2014).
  19. Buchman, A. L., Scolapio, J., Fryer, J. AGA technical review on short bowel syndrome and intestinal transplantation. Gastroenterology. 124, 1111-1134 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FGF15
Перенакопления Ileectomy индуцированной желчи в кишечнике мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.