Методическая статья

Персонализированные иглы для микроинъекций в мозге, грызунов

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55751

⸱

24 января 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы описываем протокол для микроинъекции в грызунов мозга, которая использует иглы кварца. Эти иглы не производят повреждение обнаружено тканей и обеспечить надежную доставку даже в глубоких регионах. Кроме того они могут быть адаптированы к потребностям исследования, индивидуальный дизайн и может быть повторно использован.

Аннотация

Микроинъекции были использованы для долгое время для доставки наркотиков или токсинов в областях конкретных мозга и, совсем недавно, они были использованы для доставки продукции терапии гена или ячейки. К сожалению, текущие микроинъекции методы используют стали или стекла иглы, которые субоптимальные для нескольких причин: в частности, стальные иглы может вызвать повреждение тканей, и стекла иглы могут согнуть когда глубоко опустил в мозг, пропавших без вести целевого региона. В этой статье мы опишем протокол готовить и использовать кварцевый иглы, которые сочетают в себе целый ряд полезных функций. Эти иглы не производят повреждение обнаружено тканей и, будучи очень жесткая, обеспечить надежную доставку в регионе желаемого мозг, даже при использовании глубокую координат. Кроме того это позволяет персонализировать дизайн иглы, сделав несколько отверстий диаметром желаемого. Несколько отверстий облегчить инъекций большого количества раствора в течение большей площади, тогда как большие отверстия облегчить инъекции клеток. Кроме того эти кварц иглы можно чистить и повторно используются, таким образом, что процедура становится экономически.

Введение

Микроинъекции использовались долгое время для доставки фармакологически активных соединений для модуляции активности нейронов в областях конкретных мозга. Кроме того они были использованы придать токсинов рядом конкретных нейрональных популяций, чтобы имитировать нейродегенеративных события характеристика некоторых заболеваний, например 6-гидрокси допамина в системе допамина Нигростриарный для имитации болезни Паркинсона 1 , 2 или saporin IgG иммунотоксин 192 поражением холинергических системы3. Совсем недавно микроинъекции процедуры использовались для доставки вирусных векторов или клетки трансплантатов для ген или ячейки терапии экспериментального мозга расстройств4,5.

Классический тип иглы, используемые в этих исследованиях сделан из нержавеющей стали. Хотя легко и практично использовать, стальные иглы имеют ряд проблем6: они являются относительно большой и может вызвать повреждение тканей, с утечки blood - brain барьер и активации астроциты; Кроме того они могут производить кернов мозговой ткани, который попадает в иглу, создавая препятствие или даже полностью избежать потока желаемого решения. Совсем недавно стекло иглы, подготовленного специальной из капилляров были введены в использовать7,8. Они не вызывают существенных ткани ущерб ни экзоцитоз активации, но относительно гибким и может согнуть, когда введена в глубинных структур, уменьшение точность локализации (личных наблюдений).

Поэтому существует необходимость сократить столько, сколько возможный ущерб (особенно при выполнении экспериментов, чтобы залечить повреждения) при одновременном повышении точности и воспроизводимости (то есть, убедитесь, что все решения доставляется и обеспечения правильной локализации). Кроме того было бы желательно использовать иглы различных конструкций для обеспечения оптимального распределения раствора вводят в областях головного мозга с различной геометрией. В этой статье мы опишем протокол готовить и использовать кварцевый иглы для микроинъекций в мозге, грызунов. Из-за высокой точкой плавления кварцевые капилляры не может быть вытащил на обычных съемник и таким образом, не использовались в прошлом для создания иглы. Кварц, однако, предлагает некоторые важные преимущества по сравнению стекла, в частности высокая жесткость и разрыв сопротивление9. Из-за их жесткость кварц иглы идеально подходят для инъекции в брюшной части мозга. Из-за их высокой устойчивостью к поломке они могут быть смоделированы включить несколько отверстий, получение образцов, которые могут оказаться наиболее эффективными, даже при нацеливании на мозг регионов со сложной геометрией10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные протоколы были одобрены Университет Феррары этическим Комитетом для экспериментов животных и министерством здравоохранения Италии. Прибытие (животное исследования: отчетности в Vivo эксперименты11) руководящие принципы были соблюдены.

1. Подготовка кварц иглы

  1. Чистить и стерилизовать кварцевые капилляры (см. Таблицу материалы), размещая их на 5 минут в дистиллированной воде, 5 мин в этанол 99% и 5 минут в диэтиловом эфире.
  2. Оставьте капилляров под капот по крайней мере 1 h позволить им высохнуть.
  3. Подготовьте иглы с помощью съемник лазера по параметрам, которые позволяют производство достаточно долго, достаточно тонкой иглой, в зависимости от индивидуальных потребностей.
    Примечание: Мы используем лазерные съемник (см. Таблицу материалы). Используйте программу две линии для буксировки. Первая строка использует высокой мощности, крупнейший сканирования длины (соответствующее значению волокон) и не тяговое усилие. Эта комбинация параметров приводит к таянию наибольшую часть капилляра с низкой скорости расширения, позволяя для формирования длинной иглой с большой внутренней/внешней размер и уменьшить хвостовик. Таким образом игла сохраняет высокую механическую прочность и широкий внутренний диаметр, что позволяет прохождение стволовых клеток или вирусных частиц без засорения. Скорости и задержки по линии этой программы должна остановить расширением капилляров, прежде чем кончик становится слишком мал и длиной, отсутствуют необходимые механические и характеристики формы. Вторая строка потянув программы выполняется автоматически, после того как остынет кварц (5 s). Параметры питания, накаливания и потянув силы являются функциональными отрезать кончик с кратчайшие возможные кончик длиной и крутых хвостовик, избегая разделение двух игл с кончика разрыв. Регулярно, с нашего оборудования мы используем следующее: (а) линия 1 = питание 990, накаливания 5, скорость 130, задержка 110, тянуть 0; (b) линия 2 = мощность 970, накаливания 3, скорость 0, задержка 70, тянуть 0.
  4. Иглы положите в чашку Петри, ранее протирать этанол 70%.
    1. Обложка блюдо пленкой пластиковых парафина.
  5. Вырежьте капилляров на микро диссектор.
    1. На начальном этапе пусть лазер, запустить процесс автокалибровка для проверки мощности и энергии доставлено. Затем установите параметры резки.
      Примечание: Мы используем микро диссектор (см. Таблицу материалы) и следующие параметры: мощность импульсов энергии (63 µJ), лазерный луч диаметром 20% максимальной апертурой лазерного (максимальная диафрагма: 1.0 мкм) и скорость резки 10% от максимальной скорости (максимальной скорость: 30 мкм/s).
    2. Твердо исправить иглы на таблице микроскоп и расположите его кончик в центре экрана компьютера.
    3. В строке меню нажмите на значок карандаша и использовать его для рисования знак для лазерной резки иглы.
      Примечание: Срез должен быть под углом около 45 ° относительно поверхности иглы.
    4. На стороне бар функции выберите флаг, содержащая кнопку «Начать вырезать», чтобы разрешить лазерного сократить ранее отмеченные места.
    5. При необходимости, сократить стороне отверстия, повторив описанные в 1.5.2-3; Существует не нужно изменить положение иглы (рис. 1).
  6. После вырежьте очистки.
    1. Подключите иглы к void насоса через пластиковую трубку.
    2. Включите насос и вручную установить скорость вперед потока с умеренной скоростью (3 мкл/мин).
    3. Аспирационная 99% этанола первой, а затем дистиллированной воды для удаления примесей из-за резки.
    4. Аспирационная 99% этанола снова для облегчения сушки.
      Примечание: Каждый шаг должен продолжаться по крайней мере 3 мин.
  7. Храните иглы в должным образом покрыты Петри до в день операции.
  8. Иглы могут быть повторно использованы; в конце эксперимента чистые с отбеливателем и этанола для удаления решение и возможных остатков ткани. Для более полной очистки, положить иглы в сосуд для хранения микропипеткой с наконечником, указывая вниз, наливайте в ёмкость с дистиллированной водой до тех пор, пока советы покрыты, варите 1,5 мин удалить любые остатки ткани, а затем вымыть с этанолом.

2. процедура

  1. Следуя инструкциям руководства пользователя насоса выберите меню Параметры калибровки насоса согласно диаметр/объем микроинъекции шприц и установить скорость потока в 0,3 мкл/мин.
  2. Заполните шприц 10 мл (оборудован тупой иглой (например, Гамильтон иглы, 30 G) и короткие политетрафторэтилена трубки) с стерильной водой и использовать его для заполнения микроинъекции шприц (после очень осторожно сняв поршень) и инъекции Ассамблея комплект для ручной микроинъекции насоса (СПП).
    Примечание: В комплект ММП используется для надежно монтировать иглы в стереотаксической рамы (рис. 2). В комплект входит: Политетрафторэтилен трубок, luer трубы стяжку, Пипетка держателя и прокладки для пипеток с различных внешних диаметров.
  3. Подключите иглы в комплект ММП.
    1. Флеш больше воды по всей системе через 10-мл шприц и проверьте, является ли вода поступает из иглы.
      Примечание: Не забудьте удалить любой воздушный пузырь внутри системы, повторив шаги наполнения.
  4. Отсоедините шприц 10 мл от шприца микроинъекции нажимая поршень медленно для того, чтобы оставить капля воды в верхней части микроинъекции шприца. Вставьте поршень шприца микроинъекции.
  5. Подключите микроинъекции шприц к насосу и установите скорость потока в 0,3 мкл/мин.
    Примечание: Подождите, пока есть падение утечка от кончика иглы, а затем дайте ему пойти на еще 3 мин.
  6. Задать направление 0.1 мкл/мин и начать процедуры по хирургии. Насос должен быть постоянной во время выполнения операции.
    Примечание: Для экспериментов, в этой статье, мы используем крысах Sprague-Dawley 300 g (3 месяцев). Однако процедура применима для других видов, мышей в частности.
  7. Побудить общей анестезии, с помощью метода одобрен местными правилами.
    Примечание: Мы используем микс внутрибрюшинной инъекции (и.п.) кетамина и 8 мг/кг Ксилазина 85 мг/кг для 20-50 мин анестезии. Важно, что хвост или мыс щепотки используются для обеспечения что животное полностью седативные. Уровень анестезии и основные DGK TI светлый оцениваются, прежде чем операция начинается и контролироваться каждые 10 мин при выполнении операции. Температура тела животного поддерживается постоянной до, во время и после хирургических процедур с использованием воды, рециркуляции грелку. Животные находятся под контролем до тех пор, пока полностью восстановился (например, они являются вертикально и амбулаторного). Кроме того животные получают анальгетиков (трамадол, и.п. 5 – 7 мг/кг) постоперационно каждые 24 ч в течение трех дней.
    1. Бритье головы животного и адекватно подготовиться асептических хирургии Хирургический сайт. Выполните два этапа скраб с решения на основе йода (Бетадин) следуют на 70% спирте. Кроме того, для поддержания асептики, обернуть Хирургический сайт с хирургической Пелерина (в видео было опущено для демонстрационных целей).
  8. Расположите крыса в стереотаксической рамы над водой, рециркуляции электроодеяло. Для обеспечения дополнительной боли, на сайте хирургии применяют 0,5% раствор лидокаина (не превышает 7 мг/кг). Предварительно стерилизовать всех хирургических инструментов с помощью бисера стерилизатор или жидкости холодной дезинфекции, immerging оборудование в низкотемпературном растворе глютаральдегида плюс 7,05% фенола либо 2% (Sporodicin или Cidex) следуют промыть стерильной водой или физиологическим. Лечение должны быть выполнены даже между процедурами. Сделайте продольный разрез над черепа с помощью Стерилизованный скальпель. Будьте нежны, чтобы избежать чрезмерного кровотечения. Откройте волосистой части головы, с помощью плоского шпателем и применять хирургические зажимы на закрылки кожи, чтобы держать ее открытой. Очень аккуратно отсоедините надкостницы подвергать bregma и области черепа, через который будет вводиться иглой.
  9. Установите руку на Стереотаксическая рама (во время поток) и переместите кончик иглы точно поверх bregma, обращая внимание, чтобы не сломать его кончика. Аннотируйте Антеро кзади и Медио боковое координаты bregma и перевести желаемый координаты. Руководствуясь стереомикроскопом, опустите иглу, до тех пор, пока его кончик почти касается черепа, Марк бурение месте после повышения немного стереотаксического руку.
  10. Дрель (сверла кончика Ø: 0,8 мм; дрель скорость: 1000 об/мин) череп на отмеченные места. Необходимо позаботиться не проникают Дура во время бурения процедур. В процессе бурения, капельно стерильного физиологического раствора во избежание повреждения костей и некроза.
  11. Вырежьте небольшой кусок пластика парафин фильма и поместите его на черепе. С помощью пипетки 10 мкл, сделайте капля решение придать на пленке пластиковых парафина. Остановить насос, слегка извлечения толкателя насоса и создать маленький воздушный пузырь в капилляр, осторожно потянув поршень шприца микроинъекции.
  12. Нижняя стереотаксической руку до тех пор, пока кончик иглы достигает падение. Нарисуйте образец (очень медленно) потянув поршень шприца микроинъекции, избегая любого формирования пузыря. Заменить насос толкатель при контакте с поршнем и включите насос потока со скоростью 0,3 мкл/мин ждать до формирования капли (несколько минут) перед переходом к следующему шагу.
    Примечание: В настоящем примере эксперимент, искусственные спинномозговой жидкости (ФАГО) был переплетаются в стриатума (AP: 1,5 мл: ±2.7; DV: -5.0) и спинной гиппокампа (AP: -3,5, мл: ±2.1; DV: -3,5; в мм из Дура) 2 мкл/сайт. Для облегчения сравнения между двух инъекций методы, каждая область мозга был переплетаются с помощью иглы кварца в одном полушарии и 26 G тупым кончиком или иглой 30 G из нержавеющей стали bevel-tip в другой.
  13. Нижний поток до 0.1 мкл/мин, Ник дура с иглой bevel-tip из нержавеющей стали и медленно опускайте стереотаксической руку на dorso вентральной топор, введя в ткани мозга. При достижении нужного положения, идти вниз дополнительные 0,1 мм, остановите насос, поднимите стереотаксической 0,1 мм и начать снова насоса на поток до 0,3 мкл/мин.
    Примечание: Для поддержания медленным потоком при одновременном снижении иглы причина обеспечить положительное давление, что позволяет избежать проникновения мелких фрагментов ткани в иглу сам. Такое мероприятие будет препятствовать кончик, умаление доставки решения. Поскольку скорость потока очень медленно, в то время как снижение иглы и скорость снижения составляет около 10 s/мм, это означает, что количество раствора, которые остаются вдоль трека иглы являются незначительными по сравнению с теми вводят на целевом сайте. Эта предосторожность может избегать при использовании иглы с боковыми отверстиями.
  14. Запустите таймер и подождите необходимое время, в зависимости от желаемого объема придать (например, 6 мин 40 сек если инъекций 2 мкл). Контролировать движение пузыря во время инъекций. В конце концов остановите насос и подождать 5 мин до медленно извлечения иглы. Когда полностью добывается кварцевый иглы, снова запустите насос и проверьте для формирования капли на кончике иглы.
  15. Запечатать отверстие в поверхности черепа с воском кости, удалить кровоостанавливающие зажимы и шовные волосистой части головы, пальто район вокруг раны с антибиотик крем (например, neosporin) и вернуться домой клетка животного.
    Примечание: После эвтаназии протоколом, утвержденным институциональных этического Комитета, для экспериментов, описанных в этой статье, животные были глубоко под наркозом с и.п. инъекции кетамин 43 мг/кг и ксилазина 7 мг/кг и обезглавлен. Мозги были удалены, затем в формалин за 48 ч и парафина, встроенные. Корональные секции (8 мкм) мозги были нарезанный, используя микротом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы сравнили повреждений, вызванных прямым микроинъекции в спинной гиппокампа крысы и Полосатое тело, используя иголку кварц (60 мкм внешний диаметр кончика; один из 20 мкм диаметром стороне отверстие типа C, рис. 1), по сравнению с двумя классический, 26 G тупым концом и 30 G фаски иглы из нержавеющей стали. Для этой цели мы вводили 2 мкл фаго справа и слева спинной гиппокампа и Полосатое тело, с использованием соответственно кварц и стальной иглой и 48 ч пос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метод, описанный в этой статье удовлетворяет потребности, изложенные в Введение для оптимизации микроинъекций, которые выполняются для различных целей12. Иглы, описанные здесь уменьшить урон минимум, практически не поддающихся обнаружению уровня; расходится с иглы стекла (которые подвержены изгиб) кварц иглы являются жесткими и обеспечить надежный хит желаемого мозг региона даже в глубоких координатах. Кроме того отверстие сбоку обеспечивает доставку решения, даже если кончик отве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грант от Европейского сообщества [FP7-человек-2011-IAPP проекта 285827 (EPIXCHANGE)].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Кварцевые капиллярыSutter Instruments, Новато, Калифорния СШАQ100-50-10Без нити
PullerSutterP2000
Банка для хранения микропипетокWorld Precision Instruments (WPI), Сарасота, Флорида, СШАE210
Лазерный микродиссекторLeica Microsystems, Вецлар, ГерманияLMD6500
шприцHamiltonHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Германия19138-U
насосUniventor, Zejtun, MaltaModel 864
Ручной микроинжекционный насосWPIItem#: MMP-KITKit, позволяющий надежно закрепить микропипетки на стереотаксической раме
Precision DrillProxxon28510 MicroMot 50/EПриводной вал на шарикоподшипнике с регулируемой скоростью
Artficial Cerebral Спинальная жидкостьTocris3525
Иглы 26 г Тупой и 30 г СкосHamilton26 Г Тупой: 19138-U
30 Г Скос: 20757
MicrotomeLeica, ГерманияLEICA RM212RT
Микроинфузионный

Ссылки

  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи