Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Summary

Nonlytic системы экспрессии клеток насекомых недостаточно для производства, торговли сотовой / локализации, а также рекомбинантного белка функционального анализа. Здесь мы описываем методы для генерации векторов экспрессии и последующей кратковременной экспрессию белка в коммерчески доступных чешуекрылых клеточных линиях. Совместно локализация Bemisia tabaci аквапоринов с субклеточных флуоресцирующих белков - маркеров также представлены.

Abstract

Гетерологичных системах экспрессии белка используются для получения рекомбинантных белков, интерпретация клеточного оборота / локализации, а также определение биохимической функции белков в суб-организменном уровне. Хотя выражение бакуловирусных системы все чаще используются для производства белка в многочисленных биотехнологическом, фармацевтическом и промышленных применениях, nonlytic систем, которые не связаны с вирусной инфекцией имеют очевидные преимущества, но часто упускаются из вида и недостаточно. Здесь мы опишем способ генерации nonlytic векторов экспрессии и переходную экспрессии рекомбинантного белка. Этот протокол позволяет эффективно клеточной локализации рекомбинантных белков и может быть использован для быстрого перемещения белков различить внутри клетки. Покажет экспрессию четыре рекомбинантных белков в коммерчески доступной линии клеток насекомых, в том числе двух аквапориных белков из насекомых Bemisia tabaci, а такжев субклеточных маркерных белков, специфичных для плазматической мембраны клетки и внутриклеточные лизосомы. Все рекомбинантные белки получали в виде химер с флуоресцентными маркерами белка в их карбоксильных концах, что позволяет для прямого обнаружения рекомбинантных белков. Двойная трансфекция клеток плазмид, несущие конструкции для генов, представляющего интереса и известных субклеточных маркеров позволяет клетки живого изображения и улучшенной проверке локализации клеточного белка.

Introduction

Получение рекомбинантных белков с использованием насекомыми системы экспрессии клеток предлагает многочисленные преимущества для изучения эукариотических белков. А именно, клетки насекомых обладают сходными посттрансляционными модификациями, обработку и сортировки механизмов , как присутствующие в клетках млекопитающих, что является предпочтительным для получения правильно свернутых белков ^{1, 2, 3.} Системы клеток насекомых , как правило , также требуют меньше ресурсов и меньше времени и усилий для поддержания чем клеточных линий млекопитающих ^{4, 5.} Система экспрессии бакуловируса является одним из таких насекомых клеточной системы на основе, которая в настоящее время широко используется во многих областях, в том числе получения рекомбинантных белков для белка характеристик и терапевтических средств, иммуногенной презентации чужеродных пептидов и вирусных белков для производства вакцин, синтеза мульти -protein комплексы, Производство гликозилированных белков и т.д.. ^{1, 2, 4, 6.} Есть, однако, ситуации , в которых бакуловирус выражение не может быть применимо ^{3, 7,} а также использование nonlytic и переходных систем экспрессии насекомых может быть более подходящим. В частности, выражение переходных клеток насекомых дает возможность для быстрого синтеза рекомбинантного белка, требует меньше усилий и техническое обслуживания, не включает в себя вирусный взимаемые лизис клеток, а также предоставляют средства для лучшего изучения клеточной торговли людей во время синтеза белка ^{7, 8, 9, 10.}

Этот протокол описывает быстрое формирование векторов экспрессии, используя два этапа расширения перекрытия ПЦР (ОЕ-ПЦР) 11 и стандартное клонирование ДНК плазмиды в кишечной палочке. Плазмиды используются для двойной трансфекции коммерчески доступные культивируемые клеток насекомых, и для получения репрезентативных белков. Протокол описывает производство и использование двух различных флуоресцентно меченных белков субклеточных маркеров и демонстрирует колокализацию с двумя аквапорин белков из насекомых Bemisia tabaci. Следующий протокол обеспечивает базовую методологию для OE-PCR, насекомых поддержания клеток и трансфекции, и флуоресцентной микроскопии для клеточной локализации белков-мишеней.

Protocol

1. OE-PCR для строительства экспрессирующих плазмид

Примечание: В таблице 1 для всех праймеров , используемых в OE-PCR. Использование ДНК-полимеразы высокой точности рекомендуется для всех усилений. Однако, поскольку эти ферменты часто не оставляют 3' А, необходимо выполнить краткие, не-усилительные инкубации с полимеразой Taq ДНК с „А-хвостом“ продукты ПЦРА перед клонированием их в выражение клеточного насекомых Т.А. вектор. Этот протокол демонстрирует способ для генерации насекомых экспрессии плазмиды , несущая химерных белки, с флуоресцентными белками , слитых в рамке считывания с карбоксильным концом генов , представляющего интереса (в данном случае, к двум Bemisia tabaci аквапорина белков) или субклеточным белкам - маркеров (рис 1).

1. Используйте OE-PCR, который состоит из двух независимых циклов амплификации, для генерации: (1) последовательности , кодирующие гены , представляющие интерес (Б. tabaciаквапорин 1: BtDrip1; Б. tabaci аквапорин 2: BtDrip2_v1) , слитый в рамке с зеленым флуоресцентным белком вариант под названием EGFP , или (2) субклеточных маркеров (дрозофилы пол пептид рецептора: DmSPR; гомо сапиенс фосфолипазы А2: HsPLA2) с кодирующей последовательностью mCherry. Непосредственно лигировании конечных продуктов ОГО-ПЦР в плазмиду ПИБ / V5-His-TA.
   1. Для первого раунда OE-PCR (обозначенный AD и А'-D»на рисунке 1), используют ген-специфический смысловой праймер (показанный жирным шрифтом в таблице 1) и химерного антисмыслового праймера (выделены курсивом в таблице 1) , соответствующих до конечной 15 пар оснований (без стоп-кодона) гену интереса / субклеточных маркеров и 15 п.о. 5'-конца желаемого флуоресцентного белка (EGFP или mCherry), чтобы генерировать продукт с свесом 3' .
      Примечание: В таблице 2 условий ПЦР.
   2. В отдельной пробирке, используют ген-specifIC флуоресцентный белок антисмыслового праймер (показан с подчеркиванием в таблице 1) и химерный смысловой праймером , который содержит 15 пар оснований с 3'-конца гена интереса / субклеточных маркера и 15 пар оснований от 5'-конца желаемого флуоресцентного белок, чтобы генерировать продукт с свесом 5' .
      Примечание: см таблицу 2 для условий ПЦР. Шаблон ПЦР может быть либо последовательностью подтверждено ПЦР-продукт или, более предпочтительно, плазмидной ДНК, несущий желаемую последовательность. Исследование, описанное здесь, использует последовательность апробирована плазмиды.
   3. Отдельные продукты ПЦР с 1% электрофореза в агарозном геле (с использованием стандартных молекулярно-класса агарозы).
   4. Акциз и очистить продукты ожидаемого размера (смотри таблицу 2) с использованием коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК (смотри таблицу материалов для конкретного набора , используемого в данном протоколе).
   5. С помощью гель-очищенных ПЦР-продуктов со стадии 1.1.4 для создания окончательного перекрытия еXtension изделия (обозначается A '' - D '' на фиг.1). Используйте ген-специфический смысловой праймер для интересующего гена / маркеров субклеточных и соответствующего ген-специфического антисмыслового праймера для флуоресцентного белка, чтобы генерировать желаемую химерную последовательность.
      Примечание: см таблицу 2 для условий ПЦР. Это может быть необходимо, чтобы эмпирически определить оптимальные количества первого раунда расширения продуктов перекрытия, чтобы добавить к реакционной смеси с получением конечного, полной длины химерного продукта ПЦР.
   6. Отделить вторые круглые продукты ОГО-ПЦР на 1% электрофорезе в агарозном геле. Акциз и очистки продуктов с использованием коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК.
   7. Инкубировать гель-очистке второго круглых продуктов ОЕ-ПЦР с 1 единицу Taq - ДНК - полимеразы мастер смеси в течение 10 мин при 72 ° C , чтобы генерировать 3' adenylated (т.е. А-хвостатых) продукты , необходимые для клонирования TA.
   8. Лигирования в результате adenylated продуктыв вектор экспрессии ПИБ и использовать стандартные методы молекулярного клонирования для трансформации химически компетентных (теплового шока) или Электрокомпетентные (электропорации) клетки кишечной палочки. Тарелка в течение ночь на среду , содержащей соответствующий маркер выбора (то есть, ампициллин или карбенициллин).
   9. Выполните ПЦР колоний ¹² с использованием вектора-специфического праймера и праймера вставки специфичные для идентификации вставки-позитивные колонии , которые были трансформированы с экспрессирующие плазмиды , несущие вставки в ориентации 5'-3' . Приготовьте ночные культуры колоний, порождающих продуктов ПЦР ожидаемых размеров.
   10. Изолировать плазмидной ДНК с использованием коммерчески доступного набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см Материалы таблицу для конкретного набора , используемого в данном протоколе). Проверка целостности последовательности каждой вставки путем прямого секвенирования ДНК.

2. Поддержание культуры клеток насекомых

Примечание: Для поддержания стерильных условий, проводить все манипуляции клеток, требующих открытие колбы культуры ткани в пределах колпака с ламинарным потоком. Включите ламинарный поток капота УФ бактерицидную лампу, по меньшей мере за 1 ч до клеточных манипуляций. Wear нитриловые перчатки и обеззаразить поверхность скамьи, пипетки, столовые приборы, трубки и колбы с 70% -ным этанолом перед их использованием. Знакомство с основными методами клеточной культуры рекомендуется ^13.

1. Используйте ВСИТЕ клетки (установленная для культивирования клеток линий получены из Trichoplusia щий ткани яичников), которые адаптированы к среде без сыворотки и поддерживать их в качестве клейкой монослойной культуры в среде насекомых без сыворотки при 28 ° С в T25 колбах для культуры ткани.
2. Поддерживать клетки Sf9 (установленную культуру линии клеток , полученную из Spodoptera frugiperda ткани яичников) Аналогично , но с использованием TNM-FH культуры насекомых среднего дополненияред с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
3. Семенной первоначальную культуру от замороженного Sf9 или ВСИ клеток путем удаления из запаса флаконов -80 ° С и дают им возможность оттаивать в водяной бане при 37 ° C. Обеззараживать ампулы с 70% этанолом после оттаивания и поместить их на льде.
4. Добавить 4 мл среды клеток насекомых в новую колбу Т25 и перенос 1 мл талых насекомых клеточной суспензии. Поместите колбу в 28 ° C, не-увлажненном инкубаторе и позволяют клеткам прикрепляться в течение 30-45 мин.
5. Заменить высев среду с 5 мл соответствующей среды и переносят в колбы на 28 ° C, не увлажненный инкубатор. Монитор клеток впадения ежедневно. Пассаж клетка, когда они достигают 90% сплошность.
   Примечание: Полный охват Т25 колбы соответствует ~ 5 × 10 ⁶ клеток.
6. Клеток насекомых проход.
   1. Для того, чтобы прохождение клеток, сначала удалить истощенную среду из колбы, содержащей сливные клеток с использованием стерильной 5 мл серологической пипетки.Наклон колбы таким образом, чтобы среда течет в одном углу, вдали от монослоя клеток. Аккуратно извлеките носитель с помощью пипетки, не нарушая клетки.
   2. Выбивать ВСИ клетки осторожно промывки колбы Т25, содержащую сливающийся монослой с 4 мл среды насекомых без сыворотки с использованием новой, стерильная, 5 мл серологической пипетки. Перемещение наконечник пипетки через колбу и медленно орошает, чтобы удалить клетки слабо прикрепленные к нижней части колбы.
      1. Проверьте наличие адекватного отрыва клеток путем удаления всех средств массовой информации, поворачивая колбу снова, и наблюдая, что дно колбы ясно.
   3. Для клеток Sf9, которые прилипают более плотно, добавить 4 мл свежей среды TNM-FH и использовать сотовый скребок, чтобы сместить прикрепленные клетки. С помощью серологической пипетки 5 мл осторожно перемешать и уменьшить клетки комкова.
   4. С помощью автоматизированного счетчика клеток для оценки количества жизнеспособных клеток насекомых на объем среды. Передача 0,1 мл / клеточной среде смеси до 1,5 млмикрофужная трубка. В отдельных 0,5 мл микроцентрифужной пробирки, добавляют 10 мкла клетки / средней смеси до 10 мкл трипанового синего.
   5. Удаление счетчика клеток в камере слайд из упаковки и добавить 10 мкл клеточной среды / / трипанового синего смеси в каждую сторону от счетной слайда. Вставьте слайд в счетчик клеток и определить плотность клеток и жизнеспособность.
   6. Используя плотность клеток, рассчитать и добавить собственный объем насекомых среды клеток (до 5 мл) к новым, стерильные колбы Т25.
   7. Передача примерно 1-1,5 × 10 ⁶ клеток в колбы Т25 с свежей средой; маркировать колбы с клеточной линией, датой, используемой средой, количеством клеток , добавленным, и номером канала (P _N + 1 поколением, где Р _п является номером прохода для предыдущего поколения клеток); и помещают в колбы в инкубаторе C 28 ° до 72 ч.
      Примечание: Клетки насекомых могут непрерывно распространяться, хотя клетки могут быть менее восприимчивы к трансфекции и / или гетерологичномуэкспрессии белка после 30 пассажей. Рассматривать все отбрасывается клеток / носитель с 10% -ным раствором хлорной извести и автоклав одноразовой пластиковой посуды перед утилизацией.

3. Insect Cell Трансфекция

1. Семенной в T25 колбу с до 1 × 10 ⁶ ВСИ или Sf9 клетки в соответствующей клеточной среде насекомых (бессывороточную среда для насекомых ВСИ и TNM-FH для Sf9) и расти до конфлюэнтности в течение 72 ч при 28 ° С.
2. Удаляют старую среду и сместить клетки с 4 мл среды насекомых свежей сыворотки (см шагов 2.6.2 и 2.6.3, выше).
3. Оценка плотности клеток с использованием автоматического счетчика клеток (смотри стадию 2.6.4, выше).
4. Добавить приблизительно 7 х 10 ⁵ клеток на отдельные 35 мм с прозрачным дном посуды и позволяют клеткам прикрепляться в течение 20-25 мин при температуре 28 ° С.
5. Для каждой трансфекции добавляют 2 мкг плазмидной ДНК (либо из одной плазмиды для одиночной или трансфекции 2 мкг из каждых из этих двух плазмид для делuble трансфекция) в 0,1 мл среды без сыворотки насекомых (без FBS для обоего Sf9 и ВСИТЕ трансфекции) в стерильных 1,5 мл микроцентрифужной пробирки.
6. В отдельной пробирке, смешать 8 мкл реагента для трансфекции с 0,1 мл среды насекомых без сыворотки, а затем передать этот раствор в пробирку, содержащую плазмидную ДНК, представляющий интерес. Слегка вихрь и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин.
7. Развести плазмиды трансфекции смесь из шагов 3,5 и 3,6 с 0,8 мл среды насекомых без сыворотки, так что общий объем равен 1 мл.
8. Аккуратно извлеките носитель из стеклянной посуды, содержащей прикрепленные клетки. Перекрытие прикрепленные клетки с разбавленной плазмиды трансфекции среды.
9. Инкубируйте клетки при 28 ° С в течение 5 ч.
   Примечание: Условия для трансфекции требуют эмпирической оптимизации для максимальной эффективности трансфекции (например, в течение ночи трансфекции , а не 5 ч, количество плазмидной ДНК использовали, химический состав реагента для трансфекцииб и др.).
10. Удаляем трансфекции среды и осторожно промыть клетки с 1 мл среды насекомых без сыворотки, осторожно, чтобы не сместить клетки.
11. Добавьте 2 мл свежей среды клеток насекомых (не содержащую сыворотку среды без насекомых для ВСИ и TNM-FH для Sf9) и инкубируют при 28 ° С в течение 48-72 ч.
    Примечание: Опять же, условия требуют эмпирической оптимизации для максимальной экспрессии гетерологичных белков.

4. конфокальной флуоресцентной микроскопии

1. В 48-72 ч после трансфекции, промыть клетки один раз 1 мл IPL-41 среды насекомых, а затем покрывают 2 мл IPL-41 для работы с изображениями.
   Примечание: Эта стадия промывки снижает фоновые автофлуоресценции наблюдаемых со средой клеток насекомых, используемой в обычном обслуживании клеток.
2. Добавьте 4 капли Hoechst окрашивающего реагента живых клеток (смотрите таблицу материалов для конкретного ядерного красителя, используемого в данном протоколе) к среде и инкубируют при 28 ° С в течение 20-25 мин.
   Примечание: Дополнительная писLear пятно может быть замещено, хотя краситель должен иметь профиль флуоресценции уникальный от EGFP и mCherry.
3. Поместите 35 мм блюдо в замкнуты лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (см таблицу материалов для конкретного инструмента, используемого в данном протоколе).
4. Настройка микроскопа для условий наблюдения Хехст, EGFP и mCherry: Хехст возбуждения / эмиссии - 359/461 нм; EGFP возбуждения / эмиссии - 489/510 нм; mCherry возбуждения / эмиссии - 580/610 нм.
5. Выполнить первоначальное сканирование с использованием 10x цели, чтобы подтвердить флуоресцентное выражение, а затем перейти в режим сканирования с помощью цели контраста вода-погружения в 60X фазы.
6. Регулировка мощности лазера (5-7%), чувствительность детектора (47-49%), скорость сканирования, глубина Z-ось, а цифровое масштабирование, чтобы оптимизировать контрастность и разрешение изображения. Изображение клетки при 1.5X цифрового зума, чтобы дать в общей сложности 90x усиления.
   Примечание: Параметры микроскопов требуют эмпирической регулировки для оптимальнойколлекции изображений и могут быть специфическими для инструмента в использовании.
7. Экспорт необработанных данных в виде файлов изображений TIFF и изменять (растениеводство и накладку) для генерации фигуры.

Results

ОЕ-ПЦР

ЫЙ-ПЦР позволяет для синтеза химерных продуктов ДНК, которые, как только вставленного в вектор экспрессии, позволяют для производства рекомбинантных химерных белков, соответствующих какого-либо тест интересующего гена и маркерного флуоресцентного белка. Рисунок 1 представляет собой общую схему для получения векторов экспрессии , содержащих PIB B. tabaci аквапорина кодирующих последовательностей (B...

Discussion

Гетерологичные системы экспрессии белка являются важными инструментами для получения рекомбинантных белков , используемых во многих последующих применениях ^4. Выбор из различных систем экспрессии, доступных в зависимости от конечной цели для интересующего белка. Несколько систем экспрессии клеток насекомых доступны , которые предлагают гибкие альтернативы прокариотических и эукариотических клеток экспрессирующих систем ^{5, 6.} Насекомые сис...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	Высокоточная ДНК-полимераза, используемая для ПЦР-амплификации перекрывающихся продуктов ПЦР
ExTaq DNA Polymerаза	TaKaRa-Clontech	RR001B	ДНК-полимераза, используемая для A-tailing ПЦР-продуктов
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	ДНК-полимераза, используемая для ПЦР
бактериальных колонийBiometra TProfessional Gradient ThermoCycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Содержит компоненты, необходимые для клонирования продуктов ПЦР с удлинением внахлест, в том числе линеаризованный и топоизомеразный I-активированный вектор pIB/V5-His-PPOPO, химически компетентную кишечную палочку One Shot TOP10 и раствор соли.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Роботизированная рабочая станция	Qiagen	9001292
Очиститель Вертикальный чистый скамейка	Labconco	3970401
Tni культивируемая линия клеток насекомых	Аллель Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 культивируемая клетка насекомых Аллель	Biotech	ABP-CEL-10002
Бессывороточная среда для культивирования насекомых Аллель	Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Среда для культивирования насекомых Аллель	Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Среда для насекомых	ThermoFisher	11405081
целлфектин II Реагент для трансфекции	ThermoFisher	10362100
16 см Одноразовые скребки для клеток	Sarstedt	83.1832	Cell скребки с двухпозиционным лезвием
25 см2 (T25) Колбы для тканевых культур с крышками вентиляционного фильтра	Медико-биологические продукты	CT-229331
Переносные пипетки	Fisher	1371120
стерильные, 50 мл биореакционные пробирки	Медико-биологические продукты	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 мл серологические Пипетки	Sarstedt	86.1253.001
0,5 мл 0,5 мл плоские ПЦР-пробирки	Fisher	14230200
полипропилена Биоопасные автоклавные пакеты	Fisher	01828C
35 мм #1,5 Стеклянное дно тарелки	Matsunami Glass	D35-14-1,5-U	диаметр чашки 35 мм, диаметр стекла 14 мм, толщина стекла 1,5 мм, инкубатор без покрытия
, модель 1510E	VWR	35823-961
Счетчик клеток Countess II FL	ThermoFisher	AMQAF1000
Камеру для подсчета клеток Countess Слайды с 0,4% реагентом трипанового синего	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 плазмида ДНК	transOMIC Technologies	TCH1303
Реагент pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605