Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

Jeffrey A. Fabrick; J. Joe Hull

doi:10.3791/55756

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Кратковременная экспрессия и клеточная локализация рекомбинантных белков в культивируемых клетках насекомых

10.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55756

⸱

20 апреля 2017 г.

Jeffrey A. Fabrick¹ , J. Joe Hull¹

¹U.S. Arid Land Agricultural Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

В этой статье

Краткое содержание

Nonlytic системы экспрессии клеток насекомых недостаточно для производства, торговли сотовой / локализации, а также рекомбинантного белка функционального анализа. Здесь мы описываем методы для генерации векторов экспрессии и последующей кратковременной экспрессию белка в коммерчески доступных чешуекрылых клеточных линиях. Совместно локализация Bemisia tabaci аквапоринов с субклеточных флуоресцирующих белков - маркеров также представлены.

Аннотация

Гетерологичных системах экспрессии белка используются для получения рекомбинантных белков, интерпретация клеточного оборота / локализации, а также определение биохимической функции белков в суб-организменном уровне. Хотя выражение бакуловирусных системы все чаще используются для производства белка в многочисленных биотехнологическом, фармацевтическом и промышленных применениях, nonlytic систем, которые не связаны с вирусной инфекцией имеют очевидные преимущества, но часто упускаются из вида и недостаточно. Здесь мы опишем способ генерации nonlytic векторов экспрессии и переходную экспрессии рекомбинантного белка. Этот протокол позволяет эффективно клеточной локализации рекомбинантных белков и может быть использован для быстрого перемещения белков различить внутри клетки. Покажет экспрессию четыре рекомбинантных белков в коммерчески доступной линии клеток насекомых, в том числе двух аквапориных белков из насекомых Bemisia tabaci, а такжев субклеточных маркерных белков, специфичных для плазматической мембраны клетки и внутриклеточные лизосомы. Все рекомбинантные белки получали в виде химер с флуоресцентными маркерами белка в их карбоксильных концах, что позволяет для прямого обнаружения рекомбинантных белков. Двойная трансфекция клеток плазмид, несущие конструкции для генов, представляющего интереса и известных субклеточных маркеров позволяет клетки живого изображения и улучшенной проверке локализации клеточного белка.

Введение

Получение рекомбинантных белков с использованием насекомыми системы экспрессии клеток предлагает многочисленные преимущества для изучения эукариотических белков. А именно, клетки насекомых обладают сходными посттрансляционными модификациями, обработку и сортировки механизмов , как присутствующие в клетках млекопитающих, что является предпочтительным для получения правильно свернутых белков ^{^1,} ^{^2,} ^3. Системы клеток насекомых , как правило , также требуют меньше ресурсов и меньше времени и усилий для поддержания чем клеточных линий млекопитающих ^{^4,<....}