Методическая статья

Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов Vibrio cholerae Клинические и экологические изоляты

DOI:

10.3791/55760

⸱

30 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описываются правильные методы обслуживания Vibrio cholerae в дополнение к серии биохимических анализов, которые в совокупности используются для быстрой и надежной дифференциации между клиническим и экологическим V. Биотипы холеры в лабораторных условиях.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Водная грамотрицательная бактерия Vibrio cholerae является этиологическим агентом холеры инфекционных желудочно-кишечных заболеваний. Из-за глобальной распространенности и тяжести этого заболевания, V. Cholerae широко изучается как в окружающей среде, так и в лабораторных условиях, требуя надлежащего обслуживания и методов культивирования. Классический и El Tor - два основных биотипа, которые составляют V. Cholerae O1, каждая из которых демонстрирует уникальные генотипические и фенотипические характеристики, которые обеспечивают надежные механизмы биотипической характеристики и требуют различной вирулентности, вызывающей условия культивирования. Независимо от биотипа причинного штамма для любой данной инфекции или вспышки, стандартное лечение заболевания включает в себя регидратационную терапию, дополненную режимом антибиотиков. Однако классификация биотипов может потребоваться для лабораторных исследований и может иметь более широкие последствия в биомедицинской области.В начале 2000-х годов были идентифицированы клинические изоляты, которые проявляют генотипические и фенотипические признаки как от классических, так и от биотипов El Tor. Недавно идентифицированные гибриды, называемые вариантами El Tor, вызвали идентификацию биотипа клинической и экологической изоляции, чтобы стать более сложными, чем предыдущие традиционные протоколы идентификации одного теста. В дополнение к описанию V. Холеры общего обслуживания и методов культивирования, эта рукопись описывает серию генетических экранов на основе гена ( ctxB и tcpA ) на основе ПЦР и фенотипические анализы (устойчивость к полимиксину B, метаболизм цитрата, протеолитическая активность, гемолитическая активность, подвижность и метаболизм глюкозы через Voges- Proskauer assay), все вместе используемые для характеристики и / или различия между классическими и El Tor биотипами. Вместе эти анализы обеспечивают эффективный систематический подход, который будет использоваться в качестве альтернативы или, кроме того, для дорогостоящих трудоемких экспериментов в характеристикеV. Холеры клинических (и экологических) изолятов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Холера - это заболевание дистального тонкого кишечника, вызванное потреблением загрязненной пищи или воды, содержащей водную грамотрицательную бактерию Vibrio cholerae . Симптомы холеры включают рвоту и неконтролируемую водянистую диарею, что приводит к серьезному обезвоживанию, которое, если его не лечить должным образом, приведет к смерти. V. Холеру можно разделить на более чем 200 серогрупп, основанных на структуре O-антигена липополисахарида клеточной поверхности. Однако только 2 серогруппы O1 и O139 продемонстрировали эпидемический или пандемический потенциал 1 , 2 . Более того, серогруппа O139 была в основном изолирована от Юго-Восточной Азии 3 , 4 , а серогруппа O1 распределена во всем мире. Кроме того, серогруппу O1 можно разделить на 2 основных биотипа: классический и El Tor. Классический биотип отвечал за первые 6 пандемий холерыС 1817 по 1923 год. Продолжающаяся седьмая пандемия является результатом биотипа Эль-Тор, который во всем мире смещает классический биотип в окружающую среду 5 , 6 , 7 . Недавно возникли штаммы, которые содержат отличительные характеристики как классических, так и биотипов El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 и с тех пор назывались вариантами El Tor 13 , 17 . Некоторые варианты El Tor продемонстрировали повышенную способность вирулентности с более быстрым и тяжелым прогрессированием заболевания, чем ранее наблюдалось, подчеркиваяНеобходимость более комплексного подхода к идентификации агентов и профилактике и лечению болезней 8 , 9 , 18 . Хотя идентификация биотипа не сразу диктует лечение, дальнейшие улучшения в развитии вакцины и будущих терапевтических агентах могут выиграть от различия биотипов.

Первая серия протоколов, перечисленных здесь, позволит исследователям правильно поддерживать V. Штаммов холеры в лабораторных условиях. Последовательность и последующий анализ требуют подготовки запасов и роста изолятов, которые не зависят от биотипа. Однако для оптимального индуцирования экспрессии генов вирулентности необходимы независимые биотипические методы культивирования 19 . Кроме того, в этой рукописи изложена подготовка к различным генетическим и биохимическим анализам.

Толерант холеры (КТ) и токсин co-reGulated pilus (TCP) - два основных фактора вирулентности, контролируемых главным регулятором ToxT в обоих биотипах V. Cholerae O1 серогруппа 20 . CT - двудольный токсин, состоящий из пяти CtxB Субъединиц, окружающих одну субъединицу CtxA, и отвечает за быструю потерю электролита, связанную с холерой. TCP является типом IV пилота, закодированным операндом tcp ( tcpABQCRDSTEF ), и участвует в прикреплении и колонизации дистального тонкого кишечника. TcpA является первым геном оперона tcp , который кодирует отдельные субъединицы пилина, необходимые для построения пилюса 8 . Последовательность генов для ctxA полностью сохраняется между классическими и биотипами El Tor, тогда как ctxB и tcpA различаются по двум биотипам, но сохраняются в каждом биотипе 8 . CtxB полностью сохраняется между биотипами, за исключением двух базовых позиций(115 и 203). В биотипе El Tor тимин находится в базовых положениях 115 и 203, тогда как классический биотип содержит цитозин на этих основаниях. TcpA полностью сохраняется в каждом биотипе, но отличается на нескольких основаниях между биотипами. Эти генетические различия служат в качестве первичных идентификационных маркеров биотипа, и после секвенирования продукта амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающего эти сайты, изолятные последовательности можно сравнить с классическим классическим O395 дикого типа (WT) или WT El Tor N16961 для определения фона биотипа CT и TCP, соответственно, в данном изоляте V. cholerae .

Разработаны многочисленные протоколы для описания фенотипических различий между классическими и биотипами El Tor 21 , 22 , 23 . Полимиксин В представляет собой пептидный антибиотик, который ставит под угрозу целостность наружной клеточной мембраны в грамотрицательном бакеТерия и полимиксина В можно визуализировать с помощью анализа резистентности к полимиксину В 21 . Цитрат является основным субстратом цикла Креба, и способность метаболизировать цитрат в качестве единственного источника углерода может быть определена с использованием анализа метаболизма цитрата 22 . HapR кодирует глобальный регулятор и главный регулятор кворума в V cholerae, HapR, который связывается с различными областями промотора и регулирует экспрессию гена и оперона 24 . Некоторые патогенные штаммы V. cholerae имеют естественную мутацию смены кадров в гене hapR , что привело к потере этой зависимой от плотности регуляции экспрессии гена вирулентности 24 , 25 . Измерение активности протеазы, регулируемой HapR, с использованием молочных агаровых сред позволяет исследователю определить, содержит ли конкретный изолят функциональный HapR 23 .Анализы гемолиза для определения способности штамма выделять гемолитические ферменты, которые лизят эритроциты; Степень гемолиза может быть визуализирована на пластинах 23 агара. Подвижность часто ассоциируется с вирулентностью у V. cholerae и может быть проанализирована с использованием пластинчатых агаровых пластин 23 . Анализ Voges-Proskauer проверяет способность штамма ферментировать глюкозу в качестве единственного источника углерода и продуцировать ацетоин побочного продукта 21 . С появлением вариантов El Tor трудно предсказать результаты любого данного фенотипического анализа без обширного генотипического скрининга и до выведения биотипического фона V. Холеры, рекомендуется выполнить эту сборку анализов 23 и сравнить результаты с ссылочными штаммами, как в таблице 2 .

В этой связи мы разработали ряд протоколов, совместно использующих aforemeГенотипических и фенотипических анализов для более полного подхода к характеристике V. Холерные биотипы. Кроме того, мы описали генотипические и фенотипические различия известных V. Cholerae El Tor (MQ1795 и BAA-2163) по сравнению с обычно используемыми ссылочными штаммами биотипов (классический WT классический O395, WT El Tor C6706 и WT El Tor N16961, таблица 1 ). Появление вариантов El Tor показало проблемы надежности ранее использованных протоколов характеризации биотипа одного анализа; Однако эта система идентификации с множественным анализом позволит обеспечить более надежную характеристику клинического и экологического V. Изолятов холеры .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: соображения времени для каждого анализа должны быть сделаны, поскольку отдельные медийные препараты требуют разного времени. Например, твердые агаровые пластины должны быть достаточно охлаждены и сушатся (1-2 дня). Дополнительные соображения времени ( то есть рост культуры колоний и ночной жизни) указаны в каждом протоколе и приведены в таблице 2 .

1. Подготовка СМИ

  1. 1x фосфатный буферный солевой раствор (PBS)
    1. Взвешивают 4,0 г NaCl, 0,1 г KCl, 0,72 г Na 2 HPO 4 и 0,12 г KH 2 PO 4 . Объедините компоненты в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулируйте объем до 500 мл деионизированной водой, отрегулируйте pH до 7.2 с помощью pH-метра и добавьте HCl по каплям к раствору, а автоклав или фильтр стерилизуют с использованием фильтра 0,22 мкм. 1x PBS можно хранить при комнатной температуре на неопределенный срок.
      ОСТОРОЖНО: HCl представляет собой концентрированную кислоту и должна обрабатываться в соответствии сК институциональным, местным, государственным и федеральным нормам. Для получения соответствующих инструкций по обращению обращайтесь к паспорту безопасности, предоставленному изготовителем.
  2. Бульон Лурия-Бертани (LB)
    1. Взвесьте 5,0 г триптона, 2,5 г дрожжевого экстракта и 2,5 г NaCl. Объедините составляющие в 1 л бутылке, отрегулируйте объем до 500 мл деионизированной водой, автоклавом и храните при комнатной температуре в течение 6 месяцев. Для классических условий, вызывающих вирулентность биотипа, отрегулируйте pH до 6,5 с использованием HCl перед автоклавированием.
  3. AKI, содержащий 0,03% (мас. / Об.) NaHCO 3
    1. Для компонента 1 (среда АКИ): взвесьте 7,5 г пептона, 2,0 г дрожжевого экстракта и 2,5 г NaCl. Объедините компоненты в бутылке емкостью 1 л, отрегулируйте объем до 450 мл деионизированной водой и автоклавом. Средство АКИ можно хранить при комнатной температуре в течение 6 месяцев.
    2. Для компонента 2 (NaHCO 3 ): взвесить 1,5 г NaHCO 3 и отрегулировать объемДо 50 мл деионизированной водой в стерильном везикуле. Фильтр стерилизует NaHCO 3 с использованием фильтра 0,22 мкм. NaHCO 3 должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.
    3. Асептически объединить два компонента, создающих коэффициент 1:10, путем фильтрации компонента 2 в компонент 1 перед использованием.
  4. Агарные пластины Luria-Bertani (LB)
    1. Взвесьте 5,0 г триптона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г NaCl и 7,5 г агара. Объединить компоненты в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулировать объем до 500 мл деионизированной водой, автоклавировать и приготовить в стандартных стерильных чашках Петри размером 100 мм х 15 мм. Плакированные носители можно хранить в пластике на срок до 6 месяцев, приподняв крышку до 4 ° C.
  5. Пластины агара LB с полимиксином B
    1. Для компонента 1 (агар LB): взвесить 5,0 г триптона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г NaCl и 7,5 г агара. Объедините составляющие в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулируйте объем до 500 мл wiЙ деионизированной воды и автоклава.
    2. Для компонента 2 (полимиксин В): растворить полимиксин В в деионизированной воде в стерильной 2 мл микроцентрифужной пробирке до концентрации 50 000 МЕ / мкл и стерилизовать фильтр с использованием фильтра 0,22 мкм.
    3. Как только компонент 1 охлаждается на ощупь, но еще не затвердевает, асептически добавьте 500 мкл компонента 2 в компонент 1, создавая конечную концентрацию 50 МЕ / мкл и тщательно перемешайте. Подготовьте стерильные чашки Петри стандартного размера 100 мм х 15 мм путем заливки смешанных агаровых сред в чашки Петри. Плакированные носители можно хранить в пластмассе на срок до 3 месяцев, приподняв крышку до 4 ° C.
  6. Минимальные цитратные агар-пластины
    1. Для компонента 1 (агар с бромтимоловым синим): взвесить 7,5 г агара и 0,02 г бромотимола. Объедините компоненты в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулируйте объем до 450 мл деионизированной водой и автоклавируйте смесь.
    2. Для компонента 2 (10x VBMM): вес 1.0 г MgSO 4 7H 2 O, 10,0 г лимонной кислоты H 2 O, 50,0 г безводного K 2 HPO 4 и 17,5 г NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Объединить компоненты в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулировать объем до 500 мл С деионизированной водой и автоклавом или фильтром стерилизуют с использованием фильтра 0,22 мкм. 10x VBMM можно хранить при комнатной температуре до 6 месяцев.
    3. Добавить 50 мл компонента 2 в компонент 1 и приготовить в стандартных стерильных чашках Петри размером 100 мм х 15 мм путем заливки смешанных агаровых сред в чашки Петри. Плакированные носители можно хранить в пластике на срок до 6 месяцев, приподняв крышку до 4 ° C.
  7. Молочные агаровые плиты
    1. Для компонента 1 (молоко): взвесьте 8,0 г немедленного обезжиренного сухого молока в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулируйте объем до 200 мл деионизированной водой и автоклавом.
    2. Для компонента 2 (агар с инфузией сердца и сердца): весят 3,68 г инфузии головного мозга и 6,0 г агара. Объедините conВ 500 мл колбе Эрленмейера, отрегулируйте объем до 200 мл деионизированной водой и автоклавом.
    3. Комбинируйте эти два компонента, выливая компонент 2 в компонент 1 после автоклавирования и тщательно перемешайте. Приготовьте в стерильных чашках Петри 150 мм х 15 мм. Молочные тарелки можно хранить в течение одной недели, завернутые в пластик, приподнятой стороной вниз при 4 ° C. Приготовить в стерильных чашках Петри 150 мм х 15 мм путем заливки смешанных агаровых сред в чашки Петри.
  8. Агаровые плиты подвижности
    1. Для компонента 1 (агар LB): взвесить 5,0 г триптона, 2,5 г дрожжевого экстракта, 2,5 г NaCl и 2,0 г агара. Объедините компоненты в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, отрегулируйте объем до 500 мл деионизированной водой и автоклавом.
    2. Для компонента 2 (1% (мас. / Об.) Трифенилтетразолийхлорида, ТТК): весить 0,25 г ТТК. Отрегулируйте объем до 25 мл деионизированной водой в стерильном везикуле и стерилизуйте фильтр, используя фильтр 0,22 мкм. Хранить в течение 6 месяцев при комнатной температуреВ фольге, чтобы минимизировать воздействие света.
    3. Добавить 2,5 мл 1% (мас. / Об.) Стерильного ТТК в автоклавированные среды.
    4. Налейте как можно более толстое вещество (≥50 мл / пластину) в большие стерильные чашки Петри 150 мм х 15 мм. Плакированные носители можно хранить в пластике в течение одной недели, со стороны крышки до 4 ° C. Приготовить в стерильных чашках Петри 150 мм х 15 мм путем заливки смешанных агаровых сред в чашки Петри.
  9. Фогес-Проскауэр (ВП)
    1. Для компонента 1 (бульон Methyl Red-Voges-Proskauer, MR-VP): весить 1,7 г среды MR-VP в колбе Эрленмейера емкостью 500 мл, отрегулировать объем до 100 мл деионизированной водой и автоклавом. Стерильный бульон MR-VP можно хранить при комнатной температуре в течение 6 месяцев.
    2. Для компонента 2 (5% (мас. / Об.) Альфа (α) нафтола): взвесьте 1,0 г α-нафтола в стерильном везикуле и отрегулируйте объем до 20 мл с 95% этанолом. Α-нафтол можно хранить при комнатной температуре в течение 1 недели, обернутой в фольгу, чтобы минимизировать светosure.
    3. Для компонента 3 (40% (мас. / Об.) Гидроксида калия: КОН): взвесить 20,0 г КОН в стерильном везикуле, отрегулировать объем до 50 мл стерильной деионизированной водой. КОН можно хранить в течение 6 месяцев при комнатной температуре в пластиковом сосуде.

2. Техническое обслуживание и рост V. Штаммы холеры

  1. Подготовка и использование замороженных культур
    1. Пелле 1,8 мл жидкой ночной культуры в течение 2 мин путем центрифугирования (≥8,600 × г) в стерильной 2-микронной центрифужной пробирке, удаляли надосадочную жидкость и повторно суспендировали осадок клеток в 900 мкл свежего бульона LB путем пипетирования.
    2. Добавьте 900 мкл стерильного 60% (об. / Об.) Глицерина в культуру и перемешайте путем встряхивания.
    3. Перенесите смесь в стерильную 2-млую криогенную трубку и храните ее неограниченно при -80 ° C.
    4. Чтобы использовать, удалите небольшое количество замороженного материала, используя стерильный цикл инокуляции и полоску для отдельных колоний на LB ag. Немедленно возвращайте замороженный остаток до -80 ° C после использования, чтобы предотвратить полное оттаивание культур. Инкубируйте планшеты, закрывая крышку в течение 12-16 часов при 37 ° C.
  2. Рост ночных культур в жидкой среде
    1. Полоса для одиночных колоний (согласно разделу 2.1.4) из замороженного материала на пластины агара LB. Инкубируйте планшеты, закрывая крышку в течение 12-16 часов при 37 ° C.
    2. Инокулируют 4 мл жидкого бульона LB в стерильной 10 мл культуральной трубке с одной колонией, прикасаясь к поверхности одной колонии стерильной аппликационной палочкой и перенося колонию в жидкий бульон.
    3. Инкубируйте с аэрированием в инкубаторе шейкера при 225 об / мин в течение 12-16 часов при 37 ° C.
  3. Кривая роста
    1. Подготовьте ночную культуру в жидком бульоне LB, как указано ранее в протоколе 2.2.
    2. Сделайте разведение в течение ночи 1: 100 путем переноса 250 мкл ночной культуры до 25 мл свежего бульона LB в стерильной колбе Эрленмейера емкостью 250 мл.
    3. Измерьте оптическую плотность жидких культур при 600 нм (OD 600 ) каждый час, начиная со времени инокуляции (T 0 ).
    4. Инкубируйте 1: 100 разведение ночной культуры с аэрацией в шейкерном инкубаторе при 225 об / мин в течение 30 ч при 37 ° С или пока культура не достигнет максимальной плотности.
    5. График OD 600 против времени и использование линейной регрессии для определения приблизительного времени удвоения для каждого штамма.
  4. El Tor Biotype Вирулентность, вызывающая условия
    1. Полоса для одиночных колоний из замороженного материала на пластины агара LB. Инкубируйте пластины сбоку вниз, в течение 12-16 часов при 37 ° C.
    2. Инокулируют 10 мл среды АКИ, содержащей 0,03% (мас. / Об.) NaHCO 3 с одной колонией.
    3. Инкубируйте культуру без аэрации при 37 ° C в течение 3,5 часов.
    4. Удалите 7 мл культуры и инкубируйте оставшиеся 3 мл культуС аэрацией в шейкерном инкубаторе при 225 об / мин в течение дополнительных 4 часов.
  5. Классические биотипические причины, вызывающие вирулентность
    1. Полоса для одиночных колоний из замороженного материала на пластины агара LB. Инкубируйте планшеты, закрывая крышку в течение 12-16 часов при 37 ° C.
    2. Инокулируют 4 мл жидкого бульона LB (pH 6,5) с одной колонией.
    3. Инкубировать с аэрацией в шейкерном инкубаторе при 225 об / мин в течение 12-16 часов при 30 ° C.
  6. Гранулят промывочной камеры в 1x PBS
    1. Пелле 1,8 мл ночной культуры в течение 2 мин путем центрифугирования (≥8,600 × г) в стерильной 2 мл микроцентрифужной пробирке и удаляют супернатант с использованием пипетки. Повторно суспендируйте клеточный осадок в 1,8 мл 1x PBS путем пипетирования.
    2. Повторите процедуру стирки три раза, а затем окончательную ресуспензию в 1,8 мл 1 × PBS.

3. Характеристика V. Холеры Биотипы

  1. пГенетические экраны на основе CR с использованием ctxB и tcpA
    1. Разработайте набор праймеров, которые отжигают примерно 50-70 б.п. вверх и вниз по течению от начальных и конечных сайтов трансляции ctxB и tcpA, соответственно.
    2. Подготовьте ночную культуру в жидком бульоне LB, как указано ранее в протоколе 2.2.
    3. Изолировать хромосомную ДНК с использованием коммерчески доступного набора, предназначенного для грамотрицательных бактерий. Очищенную хромосомную ДНК можно хранить неограниченно при -20 ° C. Изоляция хромосомной ДНК с использованием имеющихся в продаже наборов обычно занимает около 4 часов.
    4. Используйте микро-объемный спектрофотометр, чтобы гарантировать, что образец хромосомной ДНК имеет высокое качество (A 260/280 > 1,8).
    5. Для каждого изолята хромосомной ДНК готовить полимеразную цепную реакцию (реакции) (ПЦР) на льду в стерильной 200 мкл ПЦР-пробирке (-ях) и амплифицировать области ctxB и tcpA с использованием стандартных компонентов ПЦР: Taq- полимераза и buFfer (или эквиваленты), dNTP-решение и праймеры прямого / обратного действия. Используйте стандартные параметры ПЦР (~ 3 ч). Например, используйте следующий протокол:
      1. Начальная денатурация при 95 ° С в течение 120 с.
      2. Денатурируют при 95 ° С в течение 60 с.
      3. Протравные грунтовки при 60 ° C в течение 45 с.
      4. Промойте при 72 ° С в течение 90 с.
      5. Повторите шаги с 3.1.5.2 по 3.1.5.4 для 34 циклов.
      6. Конечное удлинение 72 ° C в течение 600 с.
      7. Бесконечное удерживание при 4 ° C.
    6. Покрасьте 5 мкл соответствующего продукта (ов) ПЦР с использованием стандартного 6х-гель-гель-гель-красителя и загрузите приблизительно 10 мкл 1 кб-лестницы и 10 мкл продукта ПЦР на 1% -ный агарозный гель в 1 х Трис-Борат-ЭДТА (ТЭР) буфер.
    7. Проведите гель-электрофорез при 130 В, пока фронт красителя не достигнет конца, но не выключится, гель (приблизительно 90 мин). Рекомендуется постоянный мониторинг, так как напряжение и время работы могут меняться в зависимости от оборудования.
    8. После проверкиУспешную ПЦР-амплификацию при ожидаемом размере, очистите оставшиеся 45 мкл продукта (ов) ПЦР с использованием коммерчески доступного набора для очистки и концентрирования ДНК.
    9. Последовательность очищала ПЦР-продукт (ы) с использованием тех же праймеров, которые использовались для амплификации ПЦР, и подготавливалась в соответствии с рекомендациями по локальному секвенированию.
    10. Сравните FASTA-формат последовательностей генов от каждого изолята до опубликованной последовательности, доступной на веб-сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), путем поиска следующих номеров доступа в поле поиска.
    11. CtxB: (классическая) область между VC0395_A1059 и VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. TcpA: (классический) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Фенотипические анализы для классификации биотипов через споттинг
    1. Подготовьте ночную культуру в жидком бульоне LB, как указано ранее в протоколе 2.2.
    2. Вымойте гранулы (я) клеток, как указано в протоколе 2.6.
    3. Используйте пипетку дляПятно 1 мкл промытой культуры на соответствующей среде. Для средних вариантов выбора и инкубации см. Таблицу 2.
  3. Анализ подвижности
    1. Подготовьте ночную культуру (ов) в жидком бульоне LB, как указано ранее в протоколе 2.2.
    2. Вымойте гранулы (я) клеток, как указано в протоколе 2.6.
    3. Инокулируйте пластинки агара подвижности, вставив инокулирующий удар в промытую жидкую культуру и «ударите» вертикально в среду. Между каждой инокуляцией стерилизуйте проволочный наконечник, используя горелку Бунзена, и при ножевом агаре убедитесь, что инокулирующий удар не изгибается, так как это может изменить результаты.
    4. Инкубируйте пластины со стороны крышки вверх в течение 14-24 часов при 37 ° C. Через 14 ч наблюдайте подвижность пластин, чтобы предотвратить разрастание культур.
  4. Анализ Voges-Proskauer (VP)
    1. Подготовьте ночную культуру (ов) в жидком бульоне LB, как указано ранее в протоколе 2.2.
    2. Инокулировать 4Мл метил-красного Voges-Proskauer или бульона MR-VP путем пипетирования 10 мкл предварительно приготовленной ночной культуры в 4 мл бульона MR-VP в стерильной пробирке для культивирования и инкубировать с аэрированием в шейкерном инкубаторе при 225 об / мин в течение 12-16 Ч при 37 ° С.
    3. Добавляют 150 мкл 5% (мас. / Об.) Α-нафтола и 50 мкл 40% (мас. / Об.) КОН до 1 мл аликвоты культуры MP-VP в течение ночи в стерильных пробирках для культивирования соответственно.
    4. Коротко встряхните и дайте постоять при комнатной температуре в течение 4 часов, пока не изменится цвет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для правильного обслуживания и использования любого бактериального штамма рекомендуется знать время удвоения напряжения (-ов), которое представляет интерес. Здесь различные темпы роста обычно используемых V. Штаммы холеры были продемонстрированы с помощью кривой роста, а приблизительное время удвоения было рассчитано с использованием линейной регрессии. Варианты WT El Tor N16961 и El Tor MQ1795 продемонстрировали более короткие времена удвоения (~ 1 ч и ~ 1 ч соответств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из более чем 200 идентифицированных V. Холерные серогруппы, только O1 и O139 имеют эпидемический потенциал. Серогруппу O1 можно разделить на два биотипа: классический и El Tor. Однако появились гибридные штаммы, названные вариантами El Tor 13 , 17 , которые обладают биотипом El Tor и содержат классические характеристики 8 , 9 , 10 ,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования, поддержанные New Hampshire-INBRE через премию за институциональное развитие (IDeA), P20GM103506, из Национального института общих медицинских наук NIH.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 kb DNA LadderNew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% глицеринаCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson and Co.214030http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Агар с инфузией мозгаи сердца Becto, Dickinson and Co.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
AgarosePeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Безводный K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
пластины для кровяного агараRemelR01200Хранить при 4 °deg; С;&нбсп; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Борная кислотаFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Бромтимол BlueFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Цирковая кислота &миддот; H2OFisher ScientificS72836-3https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Набор растворов дезоксинуклеотидов (dNTP) NewEngland BiolabsN0446SХранить при -20 ° С;&нбсп; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTAFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
ДНК Clean & Обогатительная фабрика и торговля; -25 НаборZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Краситель нуклеиновых кислотBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Спектрофотометр Genesys 10SUV-VIS ThermoScientific840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Дрожжи/бакт. НаборQiagen158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HClFisher ScientificA144-212Разъедающий;   https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH< sub>2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4· 7H2OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
система горизонтального электрофореза GT Mini-SubCell Bio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP БульонDifco216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaCl Fisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3FisherScientific S233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4· 4H2OFisher ScientificS218-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite спектрофтометрThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Обезжиренное сухое молокоNestle CarnationN/AN/A
PeptoneBecto, Dickinson and Co.211677
http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch чашки Петри (100 мм x 15 мм)НаучныйFB0875712Фишераhttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Чашки Петри (150 мм x 15 мм)Научный FB0875714 Фишераhttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
солью сульфата полимиксина BSigma-AldrichP1004-10MUХранить при 2-4 °deg; C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US
Taq ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0273SStore at -20 ° C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Реакционный буферNew England BiolabsM0273Sхранить при -20 ° С;&нбсп; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Термоамплификатор Bio-Rad C1000 Touch™  Био Рад Лабс1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Трифенилтетразолия хлоридAlfa AesarA10870
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
триптонбекто, Дикинсона и Со.211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
дрожжевой экстрактBecto, Dickinson and Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
&альфа;-наптхолМП Биомедицинские 204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189
https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387(1993).
  5. Barua, D. History of Cholera. Cholera. Barua, D., Greenough III, W. B. , Plenum Publishing Corporation. 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Caister Academic Press. 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. The Mozambique cholera vaccine demonstration project coordination group. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Horizon Scientific Press. 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253(2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BLB

Похожие статьи