Методическая статья

Создание грызунов модели аневризмы брюшной аорты, блокируя Adventitial Vasa свое перфузии

DOI:

10.3791/55763

⸱

8 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Hamamatsu University School of Medicine, 2Division of Vascular Surgery, Second Department of Surgery, Hamamatsu University School of Medicine, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Kindai University, 4Department of Organ & Tissue Anatomy, Hamamatsu University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полиуретановые катетер вставки в просвете аорты и перевязки швов аорты побудить хронической гипоксии за гипоперфузии свое adventitial Васа. Эта статья описывает модель Роман животных аневризмы брюшной аорты (AAA) с характеристиками, аналогичными AAA в организме человека.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Свое adventitial Васа (VV) обеспечивает кислорода и питательных веществ к стенке аорты. Гипоксия в стенке аорты может вызвать расширенный аневризм брюшной аорты (AAAs). Эта статья знакомит и описывает стандартный протокол, используемый для зенитных орудий через adventitial VV гипоперфузии, созданные с помощью комбинации полиуретановые катетер вставки в просвете аорты и шовные перевязка брюшной аорты infrarenal.

Протокол включает в себя использование самцов крыс, весом 300-400 г, которые предоставляются продовольствие и вода ad libitum. После лапаротомии с брюшной разрез брюшной срединной выполняется Расслоение аорты, который блокирует поток крови из периваскулярной ткани. Выполняется Aortotomy с участием небольшой разрез, прилегающих к почечной артерии ветви, и полиуретановые катетер вводится иглой 18-калибровочного пребывает. После ремонта разрез, жесткой перевязкой аорты над кровотока катетер VV блоков от проксимальном направлении через стенку аорты, не нарушая поток аортальной крови. Этот метод может вызвать AAA с прогрессивной аорты дилатации.

Наибольшую выгоду от этой модели является, что VV гипоперфузии приводит к гипоксии тканей и развития infrarenal AAA, который имеет характеристики морфологических и патологических аналогичны человеческого AAA.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Брюшной аорты состоит из следующих трех слоев: внутренний сосудистой стенки (интима), медиальной слой (СМИ) и внешнее сосудистой стенки (адвентиции), и из них, адвентиции имеет уникальный крови системы, известной как свое Васа (VV). Аорты ткани поставляется с кислородом через adventitial VV перфузии и диффузии кислорода простой поток аортальной крови1. Однако географически, брюшной аорты имеет наименее распределение ВВС, по сравнению с показателем в других частях аорты. 2

Предыдущие исследования сообщили о гипоксии тканей в человека аневризмы брюшной аорты (AAA) стены с толстым внутрипросветная тромб (ILT)3. Кроме того было показано, что adventitial ВВ в аневризмы стены закрыта с атеросклеротического изменения значительно более высокими темпами, что связано с тканевой гипоксии в AAA стены4. Основываясь на этих выводах, Роман грызунов модель AAA был создан, вызывая adventitial VV гипоперфузии5. В этой модели VV гипоперфузии причиной гипоксии тканей и развития infrarenal AAA, который имел морфологических и патологических характеристики аналогичны человеческого AAA6. Яркими примерами являются наличие Ильц и накопление гиперпластические адипоцитов6и потенциально может вызвать разрыв7,8. Эти выводы редко наблюдались в предыдущих моделях грызунов. Таким образом эта модель может способствовать более глубокому пониманию механизма, отвечающего за развитие AAA и разрыв. Мы представляем и описывают стандартный протокол, используемый для зенитных орудий через adventitial VV гипоперфузии, и мы объясним, как побудить гипоксии в стенке аорты с помощью хирургических методов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Уход за животными и эксперименты были проведены в соответствии с руководящими принципами из Хамамацу университета Школа медицины животное уход Комитета в центре для животных ухода.

1. хирургическая процедура создания модели

Примечание: место хирургических инструментов в шарик стерилизатор для 10 s preoperatively. Используйте стерильные перчатки интраоперационно.

  1. Использование самцов крыс, весом 300-400 г. позволяют крысы доступ к продовольствию и воде ad libitum.
  2. Анестезировать крыс с изофлюрановая ингаляции (2.0-3.0 мл/Л). Для подтверждения надлежащего анестезии мыс щепотка.
  3. Бритья волосы на животе с электрической бритвой и кустарников живота с алкоголем и повидон йод раствор.
  4. Место крыса в лежачем положении на операционном столе. Используйте мазь ветеринар на крыс ' глаза для предотвращения сухости под наркозом.
  5. Выполнить лапаротомия с брюшной разрез брюшной срединной линии с помощью ножниц. Для обеспечения четкой операционного поля, пакет содержимого брюшной полости внутри брюшной полости с стерильной марли, с использованием втягивающего устройства рану.
  6. Для отсоединения аорты от периваскулярной ткани, осторожно подобрать и рвать retroperitoneum пинцетом подвергать стенке аорты и отшелушивает infrarenal аорты в забрюшинного пространства от уровня левой почечной Вены к бифуркации от периваскулярной ткани ( рис. 1A).
  7. Ligate, ветвящимся из брюшной аорты с шелковой строкой 5-0 блок крови судов снабжения в точке от аорты не сузить просвета аорты.
  8. Блокировать поток аортальной крови, место сосудистая клипов чуть ниже почечной артерии и чуть выше бифуркации аорты.
    Примечание: Размер клипы должен быть больше диаметра аорты полностью блокировать поток крови. Временную 5-0 шелк строка вязи также достаточно для блокирования потока крови вместо клипы.
  9. Аналогично созданию кровоизлияния точка на поверхности стенки аорты, вырезать передней стенки аорты с помощью микро ножничный 5 мм дистально от аорты клипа, прилегающих к почечной артерии ветви, чтобы вставить катетер полиуретановые.
  10. Вставить катетер из полиуретана (наружный диаметр 0,55 мм, внутренний диаметр 0.37 мм) с использованием 24-калибруйте исполниться неглубоко иглы через разрез, чтобы смыть крови в аорте с водой. Управлять 1 мл шприц, заполненный водой в полиуретановой катетер и смыть оставшийся крови в аорте с водой. После полива, удалите катетер из аорты.
  11. Перед вставкой полиуретановые катетер (наружный диаметр 1,20 мм, внутренний диаметр 0,94 мм) с использованием 18-пребывает иглы, вырезать из полиуретана катетер длиной 10 мм ( рис. 1B).
    1. Вставка вырезать кусок полиуретановые катетера в аорты просвета из разрез, сделанный в шаге 1.9. Полностью поместить катетер 10-мм в просвете аорты и переместите середину катетера для соответствия расположения разрез (т.е., охватывать разрез с катетер).
  12. Ремонт разрез с прерванного швы с помощью строки 8-0 леска ( рис. 1 c).
  13. Перевязать брюшной аорты, используя сочетание шелка строка 5-0 и полиуретановые катетера ( рис. 1 d).
    Примечание: Просвета аорты может поддерживаться пребывает катетер. Перевязать аорты твердо для предотвращения misaligning положении катетера. Хирург ' s узел рекомендуется, потому что он добавляет дополнительный поворот, когда связывание первого броска узел, образуя двойной зашитый узел, и дополнительные очередь обеспечивает более сильное трение и может уменьшить разрыхление.
  14. После перевязки, удалите сосудистый зажим на бифуркации аорты и затем удалить сосудистые клип ниже почечной артерии для восстановления кровотока антеградная. Подтвердить брутто аорты пульсации.
  15. Закройте брюшной разрез в два слоя, брюшины и другие слои, с 4-0 полипропилен швом. Плотно шов надрез для предотвращения разьема орган.
  16. Применение лидокаина на брюшной разрез. Место крысы на грелку, пока сознание возвращается. Не оставляйте крыса без присмотра, до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Не возвращать крысу, которая претерпела операцию в компании других крысы до тех пор, пока он полностью выздоровел.
  17. Следить крыс после операции. Придать болюс стерильного физиологического раствора (1,0-2,0 мл) подкожно, если крыса показывает признаки бедствия или тела потеря веса.
  18. После операции, наблюдать-курс развития расширенного аорты на УЗИ echogram. Мера, максимальный диаметр от внутренней кромки на внешний край брюшной аорты как описано 5.

2. Сбор, фиксация и окрашивания каучуконосный Ван Гизону (го)

  1. двадцать восемь дней после операции, администрировать Пентобарбитал натрия ≥ 100 мг/кг внутрибрюшинно чтобы усыпить крысы.
  2. Разрезать крысу ' s брюшной полости вентрально. Сделайте первоначальный разрез с помощью скальпеля. Урожай аневризмы, ножницами и заготовленной аорты в формалина 10% нейтральн буферизации для 24-48 ч.
    Примечание: Хирург должен быть осторожны, чтобы предотвратить травмы аорты и других органов, когда разоблачение аневризмы. Должны соблюдаться повышенных органов брюшной полости, указывающее формирования AAA. на рисунке 2 показан в естественных условиях и ex vivo изображения; Этот репрезентативной выборки из зенитных орудий не разрушившие.
  3. Окрашивание EVG 9
    1. Приготовления раствора
      1. подготовить Верхоеф ' гематоксилином s, смешивая следующие действия в указанном порядке: алкогольные гематоксилином 20 мл, 10% хлориду 8.0 мл, и Люголя ' s йода 8 мл. Mix решение между каждой операции добавления. Это решение может быть свеже необходимости.
      2. Подготовка Ван Гизону ' s решение путем смешивания фуксин кислоты 1% 1 мл и насыщенных пикриновой кислоты 45 мл. Позволяет стоять на ночь и хорошо перемешайте. Это решение является стабильным в течение 2 недель.
      3. Подготовить отличающей решение (2% хлорида железа), смешивая 10% FeCl 3 10 мл в 40 мл дистиллированной воды. Это решение может быть свеже необходимости.
      4. Подготовка 5% гипо, растворяя тиосульфата натрия 5,0 г в 100 мл дистиллированной воды. Это решение является стабильным на 1 год.
    2. Окрашивания процедура
      Примечание: см. ссылку 9 для деталей.
      1. Кратко, гидрата фиксированной парафиновых срезах заготовленной аорты в дистиллированной воды за 10 мин место аорты в Верхоеф ' гематоксилином s для 25 min. мыть с водой и dip 10 - 30 раз в дифференциации раствор (2% FeCl 3). Прополощите в воде. Место в 5% гипо за 1 мин мыть в воде. Место в Ван Гизону ' s решение для 5 минут
      2. Dehydrate в спирте в следующем порядке: 75%, 90%, 95%, 100% и 100% алкоголя на 30 s каждый. Затем снимите в ксилоле на 5 мин, дважды. Место на coverslip с смолистые монтажа среднего.
        Примечание: эластичных волокон появляются сине-черные черный; ядра: синий блаCK; Коллаген: красный; и другие элементы ткани: желтый.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанных методов оперативного создать модель Роман животных хроническая аневризма аорты гипоксия индуцированной, используя комбинацию из полиуретана катетер вставки и шовные перевязка брюшной аорты infrarenal в крыс. Крысы, описанные в разделе протокол были Усыпленных 28 дней после процедуры. Аорты были собраны и образы для визуализации аневризм формирования. Рисунок 2 показывает развитие веретенообразной AAA. Верхние и нижние концы аорты в ex vivo имеют нормальный диаметр без дилетаций. Диаметров аорты были измерены с помощью трансабдоминального ультразвукового исследования (рис. 3). Диаметр обычно достигает своего максимального размера примерно 14 дней после процедуры; После этого он остается неизменным или незначительно увеличивается. Рисунок 4 показывает гистопатологические изображение аневризмы на максимальный диаметр после EVG пятнать. Изображение ткани на день 28 (аневризма) показал выдающийся деградации эластичных волокон, по сравнению с показателем в день 0.

figure-results-1
Рисунок 1: Хирургические процедуры побудить аневризма брюшной аорты (AAA).
(A) infrarenal аорты расслаивается от окружающих тканей. (B из полиуретана катетер, вырезать длиной 10 мм вставляется через небольшой разрез в аорту. (C разрез отремонтированы с 8-0 леска швом и поток крови восстанавливается. (D) аорты перевязано с Шелковый шов 5-0 над вставить катетер. Шкалы бар = 5 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Послеоперационные результаты представителя.
Макроскопические взгляд на развитие послеоперационных день 28 показаны веретенообразной аневризм брюшной аорты. Повышенной маржи retroperitoneum соответствует внешнему краю аневризмы (ломаных линий; слева). Верхние и нижние концы аорты в ex vivo являются нормальными (справа). Шкалы бар = 3 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Максимальная аорты диаметры измеряют с помощью трансабдоминального ультразвукового исследования.
Аорты диаметр неуклонно росло в этой модели крыса. Аорты диаметры представлены как среднее ± стандартное отклонение (n = 12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Представитель изображения аневризмы ткани с каучуконосный Ван Гизону пятнать.
Гистологическая Оценка с EVG пятнать показаны дегенеративных упругой пластинки в средствах массовой информации и формирование тромба внутрипросветная 28 дней после процедуры (справа). Упругие волокна фрагментации в средствах аорты и разреженные коллагеновых волокон в аорты адвентиции наблюдаются на день 28. День 0 — перед процедурой (слева). Шкалы бар = 500 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В физиологических условиях внутренние слои стенки аорты питаются диффузии из Люминал кровотока, тогда как внешний и среднего слоев питаются VV, которые проникают из адвентиции в медиальной ВВ1. VV приток крови в брюшной стенки аорты может исходить от следующих трех направлениях/областях: (1) в проксимальном направлении через стенки аорты, (2) дистальном направлении через стенки аорты и (3) периваскулярной тканей10. Ранее наши гистологический анализ человеческих тканей выявлены значительные стеноз или окклюзии ВВ в стенке AAA, предполагая, что VV приток крови в брюшной стенки аорты может быть сокращение4. Это чрезвычайно важный момент в этом протоколе, что infrarenal AAA было вызвано сочетанием полиуретановые катетер вставки и шовные перевязка брюшной аорты infrarenal. Тщательно отшелушивает слоя ткани, хирурги должны плавно вставьте полиуретановые катетер в аорту и твердо перевязать причиной хронической гипоксии за гипоперфузии adventitial VV и формирования аневризмы аорты. С помощью этих методов, следовательно уменьшается приток крови в стенке аорты, и местные гипоксических условий индуцируется. Сокращение потока крови и гипоксия индуцированной аневризмы формирования указывает, что VV приток крови в брюшной стенке аорты играет роль в патогенезе формирования AAA.

В частности, модель аневризма аорты должны удовлетворять следующим условиям: 1,5 раза увеличение сосудистой диаметр по сравнению с базовой, дегенерация туника СМИ и воспаление стенок аорты. Самые популярные Животные модели были построены, вызывая воспалительные реакции с использованием веществ, таких как CaCl211, эластазы12и ангиотенсин II13. Эти модели могут иметь высокую воспроизводимость и явно вызывают патологические изменения, и они были широко использованы в научных исследований. В нашей модели мы оценивали аорты диаметр с помощью УЗИ каждые 7 дней перед процедура была выполнена до 28 дней после процедуры (рис. 3). Результаты показали, что аортальной умеренно увеличился диаметр за 28 дней, указав, что это изменение в диаметре похож на это в предыдущих моделях грызунов. Грубые наблюдения сосудистой формы указано гладкой веретенообразной формы (рис. 2). День 28 мы пожертвовали крыс и провели анализ гистопатологические аорты ткани, которая была восстановлена. Разрывая и исчезновение эластических и коллагеновых волокон туника СМИ и адвентиции наблюдались (рис. 4). Кроме того воспалительные клетки, такие как макрофаги, присутствовали из адвентиции туника туника СМИ.

В настоящее время ограничивается хирургического и эндоваскулярного стент прививки, с смертности составляет 30-50% больных с AAA разрыв14варианты лечения доступны для зенитных орудий. Однако без наркотиков был утвержден для клинического использования для лечения AAAs. Существует дискуссия, что существуют различия в патологических результатов между людьми и установленным животных моделей, используемых в исследованиях AAA. Сходство в патогенезе между AAA человека и животных AAA модели важны для развития фармакологических препаратов. Что касается эффективности грызунов моделей наша модель крыса морфологически похожие на людей с точки зрения внутрипросветная тромб5 и adipogenesis8. Кроме того около 20% крыс в этом исследовании AAA разрыв и умер в течение 28 дней после процедуры. Хотя разрыв аневризмы аорты является наиболее важным событием для этого заболевания, разрыв редко с установленным экспериментальные модели AAA, и этот механизм еще не выяснены. Таким образом эта модель является полезным для понимания механизма дилатация диаметра аорты и разрыв аневризмы.

Создание этой модели является обязательным для некоторых хирургических процедур. Таким образом исследователи должны практиковать, создание этой модели, которая является ограничение этой модели. В будущем мы хотели бы создать модель грызунов, в котором мы можем вполовину сократить поток крови, постепенно утолщение стены VV, что приводит к спонтанной аневризмы аорты.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана дотаций для научных исследований (B) (20291958) для н.у.; Дотаций для молодых ученых () (25713024) для н.з.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
крысаЯпония SLC. IncSlc:SD крысаSprague– Dawley ratTM
раствор повидон-йодаLibatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 шелковая нитьAkiyama Medical MFG. CO.,LTDJIS No.1
сосудистые зажимыNatsume Seisakusho Co., Ltd.C-42-S-2
полиуретановый катетер (постоянная игла 24 калибра)MEDIKIT24GSupercath Z4VTM, постоянный игольчатый
полиуретановый катетер 24 калибра (постоянная игла 18 калибра)MEDIKIT18GSupercath Z3VTM, постоянная игла 18 калибра
8-0 монофиламентная нитьEthicon Suturec-42-S-2PROLENE Полипропиленовый шовный материал, Заделайте разрез с помощью шовной нити
4987335 111457

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wolinsky, H., Glagov, S. Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern. Circ Res. 25 (6), 677-686 (1969).
  2. Sano, M., et al. Lymphangiogenesis and angiogenesis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 9 (3), e89830(2014).
  3. Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J Vasc Surg. 34 (2), 291-299 (2001).
  4. Tanaka, H., et al. Adventitial vasa vasorum arteriosclerosis in abdominal aortic aneurysm. PLoS One. 8 (2), e57398(2013).
  5. Tanaka, H., et al. Hypoperfusion of the Adventitial Vasa Vasorum Develops an Abdominal Aortic Aneurysm. PLoS One. 10 (8), e0134386(2015).
  6. Tanaka, H., et al. Imaging Mass Spectrometry Reveals a Unique Distribution of Triglycerides in the Abdominal Aortic Aneurysmal Wall. J Vasc Res. 52 (2), 127-135 (2015).
  7. Kugo, H., et al. The preventive effect of fish oil on abdominal aortic aneurysm development. Biosci Biotechnol Biochem. 80 (6), 1186-1191 (2016).
  8. Kugo, H., et al. Adipocyte in vascular wall can induce the rupture of abdominal aortic aneurysm. Sci Rep. 6, 31268(2016).
  9. Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Hilfiker, A., Haverich, A. Biological scaffolds for heart valve tissue engineering. Methods Mol Med. 140, 309-317 (2007).
  10. Heistad, D. D., Marcus, M. L., Larsen, G. E., Armstrong, M. L. Role of vasa vasorum in nourishment of the aortic wall. Am J Physiol. 240 (5), H781-H787 (1981).
  11. Yoshimura, K., et al. Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase. Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).
  12. Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J Vis Exp. (29), (2009).
  13. Lu, H., et al. Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice. J Vis Exp. (103), (2015).
  14. United Kingdom, E. T. I., et al. Endovascular versus open repair of abdominal aortic aneurysm. N Engl J Med. 362 (20), 1863-1871 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи