В этом протоколе, клетке протеинкиназа A (PKA), bioeffector трансдукции сигнала сотовой, иммобилизованных на поверхности наночастиц, microinjected в цитозоль и активированную upconverted УФ света от ближней ИК-области спектра (NIR) облучения, вызывая вниз по течению стресс волокна дезинтеграции в цитозоль.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Комплексная система удаленно вызвать внутриклеточного сигнала по Upconversion наночастиц-опосредованной киназы Photoactivation
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Upconversion наночастиц (UCNP)-опосредованной photoactivation представляет собой новый подход для удаленного управления bioeffectors с гораздо меньше Фототоксичность и глубокое проникновение в ткани. Однако существующие измерительные приборы на рынке не легко совместимы с приложением upconversion. Таким образом изменение коммерчески доступных инструмент имеет важное значение для этого исследования. В этой статье мы сначала проиллюстрировать изменения обычных fluorimeter и флуоресценции Микроскоп, чтобы сделать их совместимыми для фотонных upconversion экспериментов. Затем мы опишем синтез возле ИК-области спектра (NIR)-срабатывает клетке протеин киназы A каталитического субъединицы (PKA) иммобилизованных на UCNP комплекс. Сообщается также о параметры микроинъекции и НИР photoactivation процедур. После того, как клетке PKA-UCNP microinjected в REF52 фибробластов клетки, NIR облучения, который значительно превосходит обычные УФ облучения, эффективно вызывает PKA путь трансдукции сигнала в живых клетках. Кроме того положительной и отрицательной контроля эксперименты подтверждают, что PKA-индуцированной путь, ведущий к дезинтеграции стресс волокон специально инициируется NIR облучения. Таким образом использование белков модифицированных UCNP обеспечивает новаторский подход к удаленно контролировать свет модулированных клеточных экспериментов, в которых необходимо избегать прямого воздействия ультрафиолета.
Введение
Химически модифицированных белков, которые могут быть photoactivated (например, белки PKA клетке) были разработаны как новые поля в химической биологии неинвазивно манипулировать межклеточных биохимические процессы1,2 ,3. С помощью света, как стимул обеспечивает отличное разрешение пространственно-временных при активации эти клетке белков. Однако УФ света может привести к нежелательным морфологические изменения, апоптоз и повреждение ДНК клеток4,5. Таким образом последние события в дизайн photocaging групп с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Протокол описывает подробный инструментария модификация для помогал upconversion photoactivation, синтетические процедуры для создания клетке PKA-UCNP, просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) из кремний покрытием UCNP и в клетке PKA-UCNP образцы, НДК и УФ установки фотолиз, подготовка клетки, микроинъекции PKA-UCNP, photoactivation исследование и стресс окрашивание волокна из REF52 клеток.
1. Fluorimeter установки для измерения спектра Upconversion
- установить 4 X объектив рядом с держатель кювет спектрометр флюоресценции, так что лазер ориентирован на середине кювета.
- Место перестраиваемый 0,5 - 8-W 98....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Дизайн конструкции клетке фермент UCNP показано на рисунке 1. PKA фермента сначала реагирует с 2-nitrobenzyl бромид для создания неактивного клетке PKA, и он был затем электростатически лишенных подвижности на поверхности UCNP. UCNPs излучают свет upconverted и следовательно фотолитически прилепится o-nitrobenzyl групп на Cys 199 и Cys 343, генерации активированное PKA. ТЕА изображения и assay Брадфорд подтвердил, что PKA и клетке PKA были иммобилизованных на.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Ранее Hofmann и coworkers обнаружил, что драматические морфологические изменения наблюдались в REF52 клетках после микроинъекции бесплатно PKA19. В другом исследовании Лоуренс группа продемонстрировала, что клетке PKA может быть активирована в естественных условиях, ведущих к морфологические изменения и дезинтеграция стресс волокон при воздействии ультрафиолетового фотолиза20. В предыдущих докладах по эксплуатации upconverted УФ-излучения для photoactivation показа.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим Nano науки и технологии программы Синика и Министерство науки и технологий Тайваня за финансирование (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагент | |||
| Трис(гидроксиметил)аминометан | Сигма | 154563 | |
| Магния хлорид гексагидрат | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium хлорид | Sigma | 31434 | |
| Хлорид калия | Sigma | 12636 | |
| Иттрия ацетат гидрат | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Гидрат ацетата тулия(III) | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 и миддот; xH2O |
| Тетрагидрат ацетата иттербия(III) | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-октадецен | Sigma | O806 | |
| олеиновая кислота | Sigma | 364525 | |
| метанол; | макрон | 304168 | |
| Гидроксид натрия | Sigma | 30620 | |
| Фторид аммония | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| циклогексан | J.T.Baker | 920601 | |
| гидроксид аммония (28% - 30%) | J.T.Baker | 972101 | аммиак |
| тетраэтилортосиликат (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-дитиотреитол (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-гидроксималеимид (NHM) | Sigma | 226351 | PKA реагент, блокирующий активность |
| раствор стабилизатора белка Prionex из свиного коллагена | Sigma | 81662 | Раствор стабилизатора белка |
| 2-нитробензилбромид (NBB) | Sigma | 107794 | реагент для клетки PKA |
| 8-(4-хлорфенилтио)аденозин 3′,5′-циклический монофосфат натриевая соль | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| пируват киназа/молочная дегидрогеназа ферменты из мышц кролика | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Аденозин 5'-трифосфат динатрия | Sigma | A2387 | АТФ |
| &бета;-НАДН уменьшенный из дикалия | Sigma | N4505 | |
| Фосфоенолпируват | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Ressay Resagent, 950 мл | Thermo Scientific | 23200 | Bradford Anasite |
| цАМФ-зависимая протеинкиназа | Promega | V5161 | PKA контроль активности |
| pET15b-PKACAT плазмида | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 плазмида | CoralHue | AM-V0012 | |
| Фосфатный буфер (PBS), pH 7,4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, высокий уровень глюкозы, пируват | Gibco | 12800-017 | Cell питательная среда |
| Leibovitz L-15 Среда | Biological Industries | 01-115-1A | Клеточная культуральная среда |
| Фетальная бычья сыворотка | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Параформальдегид | ACROS | 416785000 | |
| DAPI Invitrogen | D1306 | Окрашивающий ядро | |
| краситель Alexa 594-фаллоидин | Invitrogen | A12381 | Краситель для окрашивания F-актина |
| 5(6)-карбокситетраметилродамин | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Набор для анализа белка | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Трубки/Номинальный рейтинг фильтра MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Диализная мембрана |
| Millex-HV Шприцевой фильтрующий блок, 0,45 &; m, PVDF, 13 мм, гамма стерилизованный | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Просвечивающий электронный микроскоп | JEOL | JEM-1400 | |
| Флуоресцентный спектрофотометр | Agilent Technologies | 10075200 | Кэри Эклипс |
| УФ-ВИД спектрофотометр | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Флуоресцентный микроскоп | Olympus | IX-71 | |
| 950 нм длинночастотный фильтр | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 нм дихроичное зеркало короткопроходное | Chroma | NC265609 | |
| RT3 цветная ПЗС-система | SPOT | RT2520 | |
| Флуоресцентное освещение | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980 нм Инфракрасный диодный лазер | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | Со светодиодом UPH-056-365 нм при 200 мВт/см2 |
| Термодатчик OPHIR | 12A-V1-ROHS | ||
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Внутриклеточные системы дозирования микроинъекций |
| PC-10 Иглосъемник | Narishige | PC-10 | |
| МАНОМЕТР Цифровой манометр | Lutron | PM-9100 | |
| Одноосевой Масляный гидравлический микроманипулятор | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 центрифуга, охлаждаемый | термо Scientific | 75002421 |
Ссылки
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged"....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
