Method Article

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

DOI:

10.3791/55779

⸱

September 17th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Biology of Membranes, Nanoobjects, UMR5248 CNRS, Université de Bordeaux

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Структуры супрамолекулярные белка сборок на атомной резолюции имеют большое значение из-за их решающую роль в различных биологических явлений. Здесь мы представляем протокол для выполнения высокого разрешения структурных исследований на нерастворимы и некристаллических высокомолекулярных белков сборок магии-угол спиннинг твердотельного ЯМР спектроскопии (MAS SSNMR).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Супрамолекулярная белка сборки фундаментальные роли в биологических процессах, начиная от хост возбудитель взаимодействия, вирусные инфекции для распространения нейродегенеративных расстройств. Такие сборки состоят в несколько субблоков белка, организованных non ковалентные образом сформировать большой макромолекулярных объектов, которые можно выполнять различные клеточные функции или вызвать негативные последствия. Атомной понимание механизмов Ассамблеи и функционирования этих макромолекулярных сборок часто остаются скудными с их неотъемлемым нерастворимость и не кристалличности часто резко снижает качество данных, полученных из большинства методов используется в структурной биологии, например рентгеноструктурного анализа и решения ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Здесь мы представляем магии угол спиннинг твердотельного ЯМР спектроскопии (SSNMR) как мощный метод для изучения структуры макромолекулярных сборок на атомной резолюции. SSNMR можно выявить атомной детали на собранный комплекс без ограничения размера и растворимость. Протокол, представленные здесь описываются основные шаги от производства 13C /15N меченных изотопом высокомолекулярных белков сборки на приобретение стандартных SSNMR спектры и их анализа и интерпретации. В качестве примера мы покажем трубопровода Ассамблеи нитчатые протеина структурного анализа SSNMR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Достижения в магии угол спиннинг твердотельного ЯМР спектроскопии (SSNMR) предлагают эффективный инструмент для структурной характеристики сборок высокомолекулярных белков в атомной резолюции. Эти сборки белков являются вездесущими систем, которые играют важную роль во многих биологических процессах. Их молекулярные структуры, взаимодействий и динамика доступны для SSNMR исследований, как уже было показано для вирусных (1capsids) и механизмы бактериальной инфекции (секреции систем2,3, пили4), мембраны белковых комплексов5,6,,78 и функциональных Амилоиды 9,10,11. Этот тип молекулярной сборки может также провоцировать патологий, таких как в нейродегенеративных заболеваний, где белки собрать в Протеолиз, амилоида государствах и вызвать поведение аномальные клетки или клетки смерти 12,13. Белка сборки часто строятся путем симметричного олигомеризации кратные копий субблоков белок в больших супрамолекулярные объектов различной формы, включая фибрилл, нитей, поры, трубы или наночастиц. Четвертичные архитектура определяется слабого взаимодействия между белковых субъединиц организовать пространственной и временной Ассамблеи и для проведения сложных биологических функций. Структурные исследования на атомной шкале на эти сборки являются вызовом для высокого разрешения методов с их внутренней нерастворимость и очень часто их не кристалличности ограничивает использование обычных рентгеноструктурного анализа или решения ЯМР подходы. Магия угол спиннинг (MAS) SSNMR является новой техникой для получения данных атомной резолюции нерастворимые высокомолекулярные сборок и доказал свою эффективность для решения 3D атомной модели для все большего числа сложных биомолекулярных систем, включая Бактериальные нитей, амилоида сборки и вирусных частиц 14,,1516,,1718,19,20, 21,22. Технические авансы на высоких магнитных полей, методологических разработок и подготовки проб создала MAS SSNMR в надежный метод расследовать нерастворимые белки в различных средах, особенно в их биологически соответствующих высокомолекулярных соединений собрал государством или в клеточных мембран, что делает технику очень дополнение к крио электронной микроскопии. Во многих случаях очень высокая степень симметрии характеризует такие сборки белков. MAS SSNMR использует эту функцию, как всех субблоков протеина в сборке homomolecular будет иметь ту же структуру местных и поэтому практически одинаковую подпись SSNMR, резко уменьшая сложность анализа.

Эффективный протокол для структурных исследований высокомолекулярных белков сборок по умеренной MAS (< 25 кГц) SSNMR представлены в этом видео и могут быть разделены на различные этапы (рис. 1). Мы продемонстрируем критических этапов рабочего SSNMR структурные исследования свидетельствуют о волокнистых белков Ассамблеи (см. выделены шаги на рис. 1), за исключением очистки субъединицы белка, различные для каждого белка Ассамблея но решающее значение для структурных исследований и не вдаваясь в технические/методологические детали SSNMR спектроскопии и структуры расчета какие специализированные учебники доступны онлайн. Хотя настоящий Протокол будет главным образом сосредоточена на твердотельного ЯМР эксперименты, проведенные в условиях MAS, использование выровнены биологических сред 23,24,25,26 , 27, таких как соответствие bicelles, позволяют для расследования конформации белка и динамических протеин взаимодействия в средствах массовой информации мембраны как без MAS технологии. Мы будем показывать выражения протеина и Ассамблее шаги, а также запись решающую спектры SSNMR и их анализа и интерпретации. Наша цель – обеспечить понимание структурного анализа трубопровода, позволяя читателю выполнить атомно резолюции структурные исследования высокомолекулярных Ассамблеи SSNMR методами.

Протокол включает в себя 3 секции:

1. твердотельного ЯМР образца производство

Предпосылкой для твердотельного ЯМР анализ, белковых компонентов макромолекулярных Ассамблеи необходимо быть выражены, меченных изотопом, очищенная и собран в пробирке в родной как комплекс состояние (для примера см. Рисунок 2) . Чтобы обеспечить высокую чувствительность ЯМР, обогащения изотопов в 13C и 15N маркировки требуется минимальный бактериальный выражение массовой информации дополнена 13C и 15N источников, таких как равномерно 13 C-меченых глюкозы/глицерина и 15NH4Cl соответственно. В поздней стадии протокола, выборочно 13C-меченых образцов производится с выборочно 13C-меченых источников, таких как (1,3 -13C)- и (2 -13C)-глицерин (или (1 -13C)- и (2 -13C)- глюкоза) используются для облегчения анализа ЯМР. Смешанные помечены образец, соответствующий эквимолярных смесь из 50% 15N - и 50% 13C-меченых или 50% (1,3 -13C)- и 50% (2 -13C)-глюкозы вводятся для описания обнаружения межмолекулярных взаимодействий. Высокая степень чистоты белка, а также жесткие условия на этапе сборки являются ключевыми факторами для обеспечения однородной структурного порядка окончательного образца.

2. Предварительный структурных характеристик на основе одномерный твердотельного ЯМР (1D)

Мы представляем основные эксперименты для структурного анализа, SSNMR. Одномерный (1D) кросс поляризация (CP) и INEPT / RINEPT28 экспериментов, обнаруженные на 13C ядер используется для обнаружения жестких и гибких белка сегментов в Ассамблее, соответственно и оценить степень структурной однородность и местные полиморфизм (для примера см. рис. 3).

Жун > 3. Конформационный анализ и 3D определения структуры

Подразделы 1 и 2 касаются конформационный анализ, который основывается на SSNMR резонанс назначение всех жестких остатки белка Ассамблеи, как химические сдвиги являются очень чувствительных зондов для местной окружающей среды и может использоваться для прогнозирования Пхи/psi двугранных углов и тем самым определить вторичную структуру. Рисунок 4 иллюстрирует пример последовательного резонанса уступки в ядре жесткой белка Ассамблеи. Определение 3D структура основано на коллекции структурных данных, такие, как ограничения расстояния кодирования закрыть proximities (< Å 7-9), содержащие внутри - и межмолекулярных информации. Подпункты 3 и 4 описывают дальнего действия далеких сдержанность сбора и интерпретации. Загрязнении контактов определяются как внутримолекулярной 13C -13C proximities вытекающих из остатков i j, с | i-j | ≥4, определяя тем самым складке третичного белка мономерных Субблок, или как межмолекулярных 13C -13C proximities, определение межмолекулярных взаимодействий между субблоков протеина в Ассамблее. Внутри - и межмолекулярных интерфейсы показано на рисунке 5. SSNMR ограничений обнаруживаются через 13C -13C и 15N -13C сцепленный эксперименты обычно кодировать для internuclear расстояния < 1 Нм. Подраздел 4 объясняет обнаружения межмолекулярных расстояние ограничений. В симметричных белка сборках, использование однородно помечены выборок (т.е. 100% равномерно или выборочно помечены) для выявления межмолекулярных Субблок Субблок взаимодействия является ограниченным, как оба интра - и Межамери - молекулярных контактов приведет к обнаружить сигналы. Недвусмысленный обнаружения межмолекулярных proximities достигается с помощью смешанных помечены образцы, содержащие эквимолярных смесь двух по-разному помечены образцов, комбинированные до агрегирования. Подраздел 5 кратко знакомит структуры моделирования.

figure-introduction-1
Рисунок 1 : Рабочий процесс атомно резолюции структурные исследования твердотельного ЯМР. 13 C, 15N изотоп помечены производства белка, субъединицы очистки, субъединицы Ассамблеи, контроль формирования Ассамблеи, SSNMR эксперименты, SSNMR эксперимент анализа и извлечения расстояние ограничений и показаны структура моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. твердотельного ЯМР образца productiona

  1. производство равномерно 13 C / 15 N-меченых белковых субъединиц
    1. использования недавно преобразована, pET24-пептид 6his плазмиды содержащих E. coli BL21 (DE3) клетки, собирать их от плиты готовым агар.
    2. Инокуляции до культуры 15 мл подогретым LB среды с одной колонии. Инкубировать при 37 ° C ночь встряхивании 200 об/мин.
    3. Передачи предварительно культуры в 1 Л основной культуры подогретым M9 среды (см. состав в таблице 1), содержащий требуемый меченных изотопом углерода и азота источники.
      Примечание: Это может быть равномерно 13 C-меченых глюкозы, выборочно (1 - 13 C)- или (2 - 13 C)-помечены глюкозы 29 , , 30 31 или () 1,3 - 13 C)- или (2 - 13 C)-помечены глицерин 32 ,- 33.
    4. Инкубировать это при 37 ° C и измерить ОД 600 как только культуру мутнеет. Когда ОД 600 достиг значения 0,8, побудить выражение протеина с 0,75 мм ИПТГ для 4 х.
      Примечание: Оптимальная индукция условия могут меняться от одного белка в другой.
    5. Восстановить клетки центрифугированием на 30 мин в 6000 x g и 4 ° C.
  2. Очистки эскиз (не показано в видео-протокол)
    1. Лизируйте клетки, с использованием стандартных методов, таких как sonication или лизоцима лечения и очищения субъединицы белка, с использованием методов созданы или адаптированы для исследованы белка Ассамблеи.
      Примечание: Белка может выражаться в включения органов, проверьте для локализации протеина лизис клеток и последующим центрифугированием. Если белок обнаруживается в отложениях с мусором клетки, он накопил в органах включения.
      2. Выражение
    2. теста и чистоту белка выборки например, стандартная 12-15% трис-Трицин SDS-PAGE, смотрите рисунок 2A. Если чистота является достаточным, белок может быть собран, в противном случае выполнить шаг дополнительной очистки.
  3. В vitro Ассамблея белка нитей
    1. проверить концентрацию белка в чистые решения. Если белок содержит поглощающих остатков, измерения поглощения в УФ спектрофотометры на 280 nm. Вставьте чистый буфера в спектрофотометр как калибровки и измерения затем белка поглощения.
    2. Рассчитать концентрацию белка, используя коэффициент поглощения субъединицы белка с адаптированы закону Бугера-Ламберта — Бера: λ = ε λ x l x c; здесь является оптическая плотность при данной длине волны λ; ε — коэффициент поглощения; l-длина оптических траектории в см; c-концентрация в моль/л
    3. Концентрат белка до концентрации 1 мм в единице центробежного фильтра. Ввести образец в центробежный фильтр и центрифуги на 4000 x г за 30 мин, осторожно перемешать раствор в группе фильтр с накапайте избежать осаждения белков в фильтр. Повторите процедуру, пока не будет достигнут желаемый концентрация.
      Примечание: Оптимальный Ассамблеи концентрация зависит от системы и должна быть оптимизирована (обычно между 0,1 - 1 мм). Если эквимолярных смешанные помечены образец двух партий различных помечены белка готовится (например (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-помечены), Смешивание должно происходить до или сразу после концентрации шаг для обеспечения гомогенизация смешанного решения.
    4. Передачи образца в трубку и инкубировать его под агитации за одну неделю при комнатной температуре и.
    5. Обычно полимеризации подразделений на нити сопровождается решение становится мутным. Проверить микроскопических фибриллярных морфологии и однородности например, электронной микроскопии (увеличение 6300 X - 45000 X), см. Рисунок 2B.
    6. Центрифуг образца за 1 ч на 20000 x g и 4 ° C. удалить большинство супернатанта, оставить только достаточное количество жидкости для покрытия поверхности, чтобы избежать высыхания образца. Проверьте супернатант за несобранных подразделения на УФ спектрофотометры.
    7. Мыть образец путем добавления H 2 O и тщательного Ресуспензируйте содержимого с помощью пипетки. Сделать не вихря. Спиновые образца для 30 мин на 22000 x g и 4 ° C. Повторите шаг Стиральная 3 раза. Проверить на всех этапах Стиральная Если гранулы сохраняет ее аспект после центрифугирования и проверить супернатант за несобранных подразделения на УФ спектрофотометры.
    8. Добавить азид натрия 0,02% (w/v) (НАН 3) Избегайте бактериального загрязнения и хранить образца до измерения на 4 ° C.
  4. Ротор твердотельного ЯМР заполнение
    1. центрифуга дважды за 30 мин при 22000 x g и 4 ° C. удалить максимальное количество супернатант; результирующей последовательности образца зависит от сборки белков и обычно гель-как депозит.
    2. Использовать капиллярные пипетки для вставки образца в ротор SSNMR.
      Примечание: Здесь мы представляем процедура на ротор диаметром 4 мм.
      1. Центрифуг ротора на столе центрифуги осторожно ввести образец в ротор. Повторите процедуру до тех пор, пока ротор заполнено вверх. Держите минимальное пространство чтобы закрыть ротор ротор крышкой. Если количество образец не является достаточным, ввести коммерчески доступных вставка для заполнения оставшегося пространства для обеспечения однородности распределения выборки в ротор.
        Примечание: Зависимые на согласованность собранных образцов, может быть более адекватной, для тонкой лопаточкой, особенно для очень плотных образцов. Роторы с диаметром 2,5-4 мм используются при умеренной MAS частотах.
    3. Добавить следы 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic кислоты (DSS) для внутреннего химический сдвиг и температуры калибровки.
    4. Закройте крышку с запорное устройство.
    5. Проверить под лупой если хорошо вставлена и полностью закрыта крышка.

figure-protocol-1
Рисунок 2: результаты представитель Субблок очищение протеина и Ассамблеи. A) 15% трис Трицин SDS-PAGE субъединицы белка (включая его 6-тег) на разных стадиях очистки. Переулок 1 - маркер молекулярного веса белка; переулок 2 - E. coli BL21 (DE3) клетки uninduced управления; Лейн 3 - E. coli BL21 (DE3) клетки, индуцированной с 0,75 мм ИПТГ; пер 4 - солюбилизирован включения органов майной 5 - супернатанта фракций ячейки lysate; переулок 6 - очищенная фракция после никеля прикол металла аффинной хроматографии (ИАЦ) ПСОК и обессоливания. B) отрицательно окрашенных белка фибриллами изображений ТЕА. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Предварительные структурных характеристик на основе одномерный (1D) твердотельного ЯМР

  1. начальной настройки и 1 D кросс поляризация (CP)
    1. вставить ротор в магнит ЯМР
    2. начинают вращение ротора на частоте 5 кГц и подождать стабилизации ±10 Гц, затем ускорение до 7 кГц. Настраивать и матч 1 H, 13 C и 15 N каналов. Установите температуру на 2-10 ° C (275-283 K); образец, Отопление на 7 кГц MAS низка и регулировка температуры обычно не требуется на этой частоте MAS.
    3. Записать сингл импульсная 1D 1 H спектра с помощью 16 сканов.
      Примечание: Уровни мощности должны ранее были оптимизированы на соединение ссылку (например 13 C / < Суp > 15 N гистидина или Глицин), предоставить начальные значения для оптимизации уровней мощности в экспериментах на целевой выборки; Эта процедура является рутинных задач и, следовательно, вне сферы в этом протоколе.
    4. Держать температуру во время всех экспериментов между 2-10 ° C, в гидратированных образцах температуры отражается в относительный сдвиг Массовая воды 1 H резонанса отношении DSS сигнал 34. Измерения температуры после отношения δ (H 2 O) = 7,83 T/96,9 с точностью 1-2 ° C 35.
    5. Набор до желаемого MAS частоты и дождаться стабилизации ±10 Гц.
      Примечание: Здесь она показана на частоте 11 кГц.
    6. Мелодия и матч 1 Ч и 13 C каналы снова и регулировать температуру с помощью 1 D 1 H эксперимент.
    7. Создана 1D 1 H - 13 C CP- 36.
      Примечание: CP эксперименты показывают сигналы, вытекающих из остатков в жесткой конформации. Пульс калибровки и дезинтеграцию данных параметров может быть непосредственно оптимизирована на образце при достаточно высокой, соблюдать сигналы после менее чем 32 ~ сканирует чувствительность. Значения первоначальной оптимизации взяты из стандартных оптимизации на соединение ссылку. Время контакта CP и уровни мощности выбраны исходя интенсивность максимального сигнала. В образцы протеина оптимальное время контакта CP обычно составляет 200 МКС и 2 г-жа развязки параметры следует также вновь корректироваться от калибровки на соединение ссылку.
      1. Тщательно соблюдать локализации спиннинг боковых полосах на заданной частоте MAS.
    8. Запись ссылки 1D 13 C CP спектра, который служит 1 D спектральных отпечатков пальцев. Типичные параметры являются 128 сканов, 1 мс CP время контакта, 100 кГц разделение силы, рециркулировать задержка 3 s и 25 мс приобретения.
    9. Калибровка, 1 H и 13 C химические сдвиги после рекомендации ИЮПАК 37. Определить резонансную частоту сигнала 1 H DSS (химический сдвиг 0 ppm); 13 C химические сдвиги есть ссылки на 1 час смены (обычно ~ 0.25144, производный от соотношения 13 C 1 H резонансной частоты 37).
    10. Процесс, 1D 1 H - 13 C CP эксперимент без аподизации функции (см. Рисунок 3A и B для обнаружения на сборку однородно упорядоченной белка). Выберите изолированное пик для оценки linewidth в образце, свидетельствует о структурного порядка и однородности. Типичный 13 C стандартам для упорядоченного биологических белка сборки под МАС в сильных магнитных полях колеблется в пределах 20-150 Гц (измеряется как полной ширины на половинной высоты (FWHH)).
    11. Оценить соотношение сигнал шум (S/N) в спектре CP.
      Примечание: S/N соотношение зависит от многих факторов, включая главным образом количество образцов в ротор, степень жесткости структуры белков и наличие единого молекулярной конформации. Как правило, образца должны быть пригодны для многомерных SSNMR спектроскопии, если сигнал наблюдается в оптимизированный 1D 1 H - 13 C CP спектра Записанная с 64 сканирует.
    12. Зум в регионе спектральных белка позвоночника карбонильных резонансов (главным образом) локализованные между 165-180 ppm. Оценить содержание вторичной структуры в Ассамблее позицией белка позвоночника карбонильных резонансов с резонансами из остатков в α-винтовой или β-стренги конформации смещается downfield или upfield, соответственно (см. рисунок 3B для главным образом α-винтовой субъединицы) 38.
  2. 1 D INEPT эксперимент
    1. 1 D 1 H - 13 C НЕУМЕЛОЕ эксперимент установить зонд очень подвижными частями (суб µs) Ассамблеи белка.
      Примечание: GARP развязки в нескольких кГц во время приобретения 39 обычно используется, чтобы разрешить для коротких interscan задержки (обычно 1 s) без повреждения датчика.
    2. Запись ссылка НЕУМЕЛОЕ спектра, который служит отпечатков пальцев для мобильных белка сегментов; типичные параметры являются 128 сканирует и время приобретения 25 г-жа
    3. Процесс 1 H - 13 C НЕУМЕЛОЙ экспериментировать. Сумма и позиции сигналы указывают количество мобильных остатков и аминокислотный состав соответственно.
      Примечание: Также записывать 2D 1 H - 13 C НЕУМЕЛОЕ эксперимент, если сигналы присутствуют в спектре НЕУМЕЛОЕ 1 D (см. рис. 3 c для примера) для идентификации более конкретные аминокислоты. В случаях неоднозначной уступки, мы рекомендуем проверять позиции сигнала буфер компонента решения ЯМР.
    4. Использовать базы данных BMRB 40 и опубликованных данных 38 назначить их соответствующие аминокислоты в рядом случайных катушки конформации резонансы; спектра содержит только компоненты мобильных буфера, если не остатки находятся в режиме высокомобильных.

figure-protocol-2
Рисунок 3: представитель результаты SSNMR приобретение спектры для сборки структурированный белка. C-обнаружены FID эксперимента кросс поляризация 1 H - 13 C) 13. B) 1 H - 13 C кросс поляризации эксперимент. C) 1 H - 13 C НЕУМЕЛОЕ эксперимент жесткой белка Ассамблеи; видны только буфера компонентов. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. определения структуры конформационный анализ и 3D

  1. последовательный резонанс назначения
    1. создана 2D 13 C - 13 C спин протона driven диффузии (PDSD) 41 эксперимент для обнаружения остатков внутри 13 C - 13 C корреляции, включая боковые цепи. Взять на себя значения для начального 1 H - 13 C кросс поляризация шаг от 1 D 1 H - 13 C CP эксперимент.
      1. Задать время смешивания 50 мс для равномерно 13 C-меченых образцов и 100 мс для выборочно 13 C-меченых образцы. Установите время косвенного приобретения между 5-25 мс и прямое приобретение между 15-25 мс зависит от внутренней спектральных резолюции, которая может быть оценена путем видимый сигнал свободной индукции распада (FID) длиной (проявляется в рис. 3A).
      2. Тест несколько параметров обработки, чтобы найти оптимальные значения в отношении сигнал / шум и резолюции в спектре, обычно может быть достигнуто адекватной обработки, с помощью функции окна qsine со сдвигом Белл Синус (SSB) 2,5-4.
    2. Настройка, запись и процесс 2D 13 C - 13 C PDSD с эксперимента промежуточное время смешивания для обнаружения последовательных 13 C - 13 C корреляции соединения главным образом i - i±1, а также i±2 и i±3 остатков, в зависимости от белка позвоночника жесткость и элементы вторичной структуры. Время смешивания должен быть установлен между 100-200 мс для равномерно помечены образцов. Все остальные значения могут быть взяты из коротких, смешивания время 2D 13 C - 13 C PDSD.
    3. Создан, процесс 2D 15 N - 13 C N, я CA я и N, я CO я эксперимент с помощью CP 1 H - 15 N и конкретных CP 15 N - 13 C передача и запись 42. оптимизировать передачу поляризации 13 C 15 N - в моде 1 D непосредственно на образце интерес, на основе максимальной интенсивности в регионе карбонила или сертификации, соответственно. ХарактернымCal значений для конкретных CP время контакта между 2-6 г-жа
    4. создана, запись и процесса серии 2D 15 N-(13) C - 13 C эксперименты с целью назначения.
      Примечание: Первое значение параметра 15 N - 13 C поляризации передачи могут быть взяты из N, я CA я / N, я CO я экспериментов. Внутри остатки корреляции установлены от N, я (CA я) CB я и N я (CA я) CO я, соответственно, с помощью мечта 43 и PDSD 13 C - 13 C поляризация трансферы. Остаток (i) остатков (i-1) последовательного подключения извлекается из N, я (CO i-1) CA i-1 и N, я (CO i-1) CX i-1 эксперименты, как с использованием PDSD 13 C - 13 C поляризация передачи.
    5. Выберите ЯМР анализ программы как CcpNmr анализ 44 или спарки 45
    6. Загрузить 2D спектры в программное обеспечение (например, с CcpNmr анализ) и загрузить основной белок последовательности.
    7. Начать с идентификации аминокислоты типы, видимые в короткий смешивание 13 C - 13 C PDSD спектра. Подключите атомов углерода спин систем для " остаток тип " конкретные уступки; Смотрите Рисунок 4A для назначения треонин остатков. Определить как много остатков как можно скорее; Это будет зависеть от размера субъединицы белка, спектральное разрешение и дисперсия.
    8. Наложение короткий смешивания с промежуточных смешивания 13 C - 13 C PDSD спектра.
      Примечание: Дополнительные пики, видимые в промежуточные смешивания PDSD возникают главным образом от последовательного (остатки i - i±1 остатков) контактов. Пример для последовательное назначение двух остатки иллюстрируется в рисунке 4В.
      1. Марка вершины резонанс закрутки системы и найти корреляции в промежуточные смешивания PDSD с резонансной частоты других систем спина. В маленькие белки и пептиды, может быть можно добиться всего последовательный резонанс назначения на основе 2D 13 C - 13 C PDSD экспериментов.
        Примечание: В β-стренги вторичной структуры мотивов остатков i - остатки i±2 13 C - 13 C контакты могут показать более интенсивным сигналов, чем последовательные контактов из-за их близости в космосе; в α-винтовой вторичной структуры мотивов остатков i - остатки i±3 13 C - 13 C контакты также может привести к интенсивной сигналы.
    9. Если промежуточные смешивания PDSD экспериментов на выборочно 13 C-меченых образцы доступны, наложения их на короткие смешивания спектр (если доступно на выборочно 13 C-меченых образец) и назначить дополнительного пики, принимая во внимание селективного 13 C маркировки узор (1,3 - 13 C и 2 - 13 C глицерин 32 , 33 или 1 - 13 C и 2 13 C глюкозы 29 , 30 , 31.
      Примечание: например, в 2 - 13 C глицерин надписью образец несколько типов аминокислоты помечены на позиции Cα без соседних атомов углерода (Cβ и C ') помечены, поэтому в пользу Cα-Cα передача между соседними остатков. В выборочно помечены образцов загрязнении 13 C - 13 C корреляции может строить уже в средней смешивание 13 C - 13 C PDSD экспериментов. Если пик не может быть объяснено последовательный корреляции, он может возникнуть от большой дальности контакта. Для высоко приказал однородной Субблок структур в макромолекулярных Ассамблее, только один набор резонансов, как ожидается, будет видимым в спектрах. Если два раза (или далее умножается) резонансов являются видимыми для 13 C атомов или белка костяк тянется, два (или более) конформации для атома или растягивать первичной последовательности в Ассамблее, соответственно, существуют.
    10. Использовать 2D спектра НКА, содержащих интра остаток 15 N - 13 Cα корреляции для идентификации 15 N резонансных частот для каждого остатков. Если резолюция в измерении 13 C не является достаточным, используйте дополнительную информацию о Cβ резонанс в 2D NCACB для идентификации интра остаток 15 N резонансную частоту.
    11. Использовать 2D NCACB и NCACO спектры, содержащие интра остаток 15 N - 13 C - 13 C корреляции для (i) определения частоты 15 N интра остатков и (ii) для устранения неясностей в 13 C - 13 C PDSD с помощью дополнительных 15 N измерения. Инверсию сигнала из-за передачи сон приводит к наблюдению типичных корреляции Cα-Cβ, для которых Cα сигнал является положительным и отрицательным Cβ сигнал. Дальнейшие боковой цепи 13 C, если видна в спектре, являются положительными снова.

figure-protocol-3
Рисунок 4: 2-мерной 13 C - 13 C SSNMR PDSD экспериментов на упорядоченной, равномерно 13 C, 15 N-меченых белка Ассамблеи. A) короткое время PDSD смешивания (смешивание 50 мс). B) назначение 2-остатки стрейч Ile32 - Thr33 с помощью наложения короткого времени перемешивания PDSD с время долго смешивания PDSD (200 мс смешивания). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. для определения вторичной структуры
    1. использовать 13 Cα, 13 Cβ химический сдвиг значения для вычисления среднего химические сдвиг 46 ΔδCα-ΔδCβ , свидетельствует о вторичной структуры. Рассчитать 13 Cα(assigned) - 13 Cα (случайные катушки) и 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (случайные катушка).
      Примечание: Химический сдвиг значения для остатков в конформации случайных катушки могут быть получены из 38.
      1. Участок ΔδCα-ΔδCβ, отрицательные или положительные значения для > 3 остатков в строке указывают β-нить или α-винтовой конформации соответственно; глицин и пролина остатков может показать значения необычных химический сдвиг, как они часто выступают в качестве " вторичной структуры выключатели ".
    2. Предсказать белка двугранных углов от назначенного химически переносы, используя TALOS + 47 , 48 или 49 , PREDITOR 50. Предсказал Phi/Psi двугранных углов отражают вторичную структуру белка subuНИТ и используются как структурных ограничений на протяжении всего процесса моделирования.
  2. Коллекции структурных ограничений
    1. установите вверх и записывать 2D 13 C - 13 C PDSD эксперимент с давно смешивания время для выявления долгосрочных 13 C - 13 C корреляции. Типичный смешивания раза диапазоне от 400 мс до 1 s. выборочно использовать 13 C-меченых образцы, как спин разрежения значительно улучшает передачу поляризации среди далеких углей.
    2. Наложения Лонг смешивание 2D 13 C - 13 C PDSD, записанные на выборочно помечены образца на промежуточных смешивания 13 C - 13 C PDSD, если возможно, записанные на образце же выборочно помечены. Дополнительные пики возникают от корреляции между более отдаленные 13 C атомов. Во время назначения резонанс, учитывать селективного схема маркировки.
    3. Тщательно оценить резолюции спектра для определения окна назначения толерантности, т.е. зависит от резонансов спектральное разрешение в определенном диапазоне, это может способствовать сигнала ppm. Стандартное отклонение точности назначения автоматически рассчитывается в NMR назначение программы, такие как CcpNmr анализ или SPARKY.
    4. Если сигнал может быть объяснено последовательный (остатки i - i±1 остатков) или средней дальности 13 C - 13 C контакт (остаток-остатков я ± 2, 3 или 4), сохранить это назначение с ретрансляции поляризации передачи может объяснить даже если расстояние 13 C - 13 C выше ожидаемый диапазон видимых контактов корреляции.
    5. Классификации назначений на большие расстояния 13 C - 13 C контактов в недвусмысленной и неоднозначные сигналы частоты. В случае частотных присвоений и недвусмысленным, назначение только одной резонанс возможен в отношении терпимость окно назначения.
      Примечание: Неоднозначного задания содержат все возможные резонанс назначения в окне терпимости. Двусмысленность может быть поднят одновременно во время вычисления структуры путем итеративного раундов значения на основе предварительных структур, рассчитывается только однозначные ограничений, как в вычислительные процедуры, такие как Ария 51 или 52 UNIO. Кроме того структурные данные из различных источников биофизических (например мутировал или усеченных Субблок структуры решения ЯМР или рентгеноструктурного анализа, измерения массы за длины, крио EM карты) может также использоваться для снижения уровня неопределенности, для Примеры смотрите 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
  3. Обнаружение ограничений межмолекулярных расстояние в сборке симметричный белка
    1. создано 2D 15 N - 13 C боль-CP 59 эксперимент смешанная (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-меченых образца. Сигналы обнаружены на боль-CP спектра должны вытекать из между молекулярной 15 N - 13 C proximities. Используйте ранее назначенного резонансов для выполнения назначения межмолекулярных контактов.
    2. Настройка 2D 13 C - 13 C PDSD с время долго смешивания (> 600 мс) на (50/50) смешанного (1,3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-глицерин или (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-образец глюкозы.
      Примечание: Сигналы обнаружены в этом спектре 13 C - 13 C возникают внутри молекулярная и между молекулярной 13 C - 13 C proximities. Однако, высокая взаимодополняемости двух схем маркировки позволяет особый резонанс пар однозначно обусловлены между молекулярной контактов, например Серина CA в (2 - 13 C)-глюкозы, помечены субблоков, которые коррелируют Серина CB в (1 - 13 C)-глюкозы, помечены субъединиц.
      1. Наложение спектра смешанного образца 2D 13 C - 13 C спектры, записанные на однородно помечены образцы ((1,3-13C) - и (2 - 13 C)-глицерин или (1 - 13 C)- и (2 - 13 C)-глюкозы Приклеенные этикетку образцов). Дополнительные сигналы в спектре, записанная на образце смешанной возникнет между молекулярного взаимодействия с.
  4. Структуры моделирования от SSNMR данных
    1. подготовить списки сдержанность SSNMR, необходимые для расчета структуры: последовательности белка (1); (2) внутри молекулярная недвусмысленные расстояние ограничений; (3) внутри молекулярная неоднозначной расстояние ограничений; (4) на основе TALOS двугранный угол ограничения; (5) между-молекулярные недвусмысленные расстояние ограничений; (6) между-молекулярные неоднозначной расстояние ограничений; (7) дополнительные данные из других биофизических методов (например, параметров массы в длину, симметрии).
    2. Несколько обзоров обеспечивают понимание структуры моделирования, основанные на данных SSNMR и в сочетании с дополнительных структурных данных 14 , 60 , 15 , 19 , , 61 62 Обратите внимание, что ограничения неоднозначной расстояние можно однозначно во время расчета структуры в отношении предварительного структурные модели, основанные на однозначные расстояние ограничений. Для обеспечения точности структуры, тщательно соблюдать, если структура сходится к двойная.

figure-protocol-4
Рисунок 5 : внутри - и межмолекулярных Контакты в сборках симметричный белка. Схематическое изображение внутри - и межмолекулярных 13 C - 13 C переноса контактов в сборке винтовой высокомолекулярных соединений. Подразделения окрашены в белый и красный, чтобы проиллюстрировать смешанных маркировки субблоков; т.е. перед Ассамблеей, 1:1 смесь двух различных схем маркировки была выполнена (например 1 - 13 C глюкозы и 1 - 13 C глюкозы). A) внутримолекулярной 13 C - 13 C переноса контактов (синяя пунктирная стрелка); B) межмолекулярных 13 C - 13 C переноса контактов (красный барашек стрелки). пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Типичный рабочий процесс SSNMR включает в себя несколько этапов, показанного на рисунке 1. Обычно субблоков протеина производятся в vitro гетерологичных выражением в E. coli, очищенная и собрал под тряску, но иногда также в статических условиях. Выражение и очистки субъединицы белка следуют SDS гель-хроматографии (рис. 2A). Формирования высокомолекулярных сборок затем может быть подтверждена электронной микроскопии (EM) анализа (см. Рисунок 2B пример нитчатые Ассамблеи).

После введения Ассамблеи белка в SSNMR ротора ротор вставляется в спектрометре, регулируются MAS частоты и температуры и спектры записываются. Первые идеи можно получить 1D SSNMR методами. На рисунке 3 показана типичная SSNMR FID, обнаруженных на канале 13C на образец структурно однородных белка, 1H -13C CP спектра, раскрывая13C резонансов в жесткой ядро субъединицы белка в Ассамблея и 2D 1H -13C НЕУМЕЛОЕ спектра, представляющие мобильные остатков. Для атомной взглянуть на жесткую основу структуры Ассамблея многомерные SSNMR эксперименты должны быть записаны на равномерно и выборочно помечены образцы сначала назначить SSNMR резонансы и затем обнаружить на большие расстояния (см. Рисунок 4 proximities ).

Все спектры обрабатываются и анализируются с адекватного программного обеспечения для присвоения SSNMR резонансы и извлечь внутри - и межмолекулярных расстояние ограничения (рис. 5). SSNMR расстояние ограничения используются самостоятельно либо совместно с данными из дополнительных методов, которые могут быть интегрированы в программу моделирования.

Для представителя атомных структур макромолекулярных сборок, решается SSNMR методы Рисунок 6 иллюстрирует несколько нитчатые сборки из бактериальных придатков и амилоидных фибрилл.

figure-results-1
Рисунок 6:нитчатые макромолекулярных структур, определяется твердотельного ЯМР подход: бактериальные филаментов и белка амилоида фибриллами. A) типа 1 pilus uropathogenic E. coli, PDB код 2N7H 4; B) ASC накаливания, PDB код 2N1F 63; C) тип III секреторной системы иглы, PDB коды 2MME, 2LPZ и 2MEX 2,3,-правовая64; D) AB42 бета-амилоидных фибрилл, PDB код 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,,6667 и Осака мутант PDB код 2MVX 57, Айова мутант PDB код 2MPZ 58; E) альфа synuclein фибрилл, PDB код 2N0A 68; F) домен прионных HET-s, 2RNM код PDB, 2KJ3 69,70. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Твердотельного ЯМР (SSNMR) является методом выбора для характеризующие высокомолекулярных белков сборок на атомарном уровне. Одним из центральных вопросов в определении на основе SSNMR структуры является спектральной качество исследуемой системы, что позволяет установить 3D структурных моделей различных точности, обычно начиная с разрешением модели (содержащий вторичного Структура элементов и мало 3D информации) для псевдо-атомной трехмерных структур. Количество и качество структурных сведений, извлеченных из многомерного SSNMR экспериментов является ключом для вычисления структуру ЯМР высокого разрешения Ассамблеи.

Описывается протокол основывается на обнаружение 13C -13C и 15N -13C структурные ограничения требующие записи спектров несколько 2D (и иногда 3D) с высокой сигнал шум. При умеренной MAS частотах (< 25 кГц), образец вводится в роторы с размерами 3,2-4 мм диаметром, позволяя для количеств белка до ~ 50 мг, зависит от образца гидратации. Количество образцов внутри ротора прямо пропорциональна соотношение сигнал шум в SSNMR спектры, решающим фактором для обнаружения дальнего расстояния ограничений и их однозначной назначения.

Cпектральное разрешение является параметром решающее значение во время присваивания последовательный резонанс и коллекции ограничений. Для получения оптимальных результатов, параметры подготовки образца должны быть оптимизированы, особенно в очищение субъединицы и Ассамблея условий (pH, буфера, тряска, температуры и т.д.). Пример оптимизации рекомендуется подготовить немеченого образцы для нескольких отдельных условий для которого наблюдается Ассамблеи и для записи 1D 1H -13C CP спектра (описано в шаге 2.1) на каждого подготовленного образца. Спектры служат для сравнения спектральное разрешение и дисперсия между различных препаратов, на основе которой можно определить оптимальные условия.

Качество данных SSNMR сильно зависит от выбора параметров приобретение ЯМР, особенно для передачи шаги поляризации. Использование высоких магнитных прочностями поля ( 1H частота ≥600 МГц) имеет важное значение для высокой чувствительности и спектральным разрешением, требуется когда сталкиваются сложных целей таких сборок высокомолекулярных белков.

Ограничивающим фактором во многих случаях является наличие спектрометр. Поэтому разумный выбор образцов должен быть подготовлен должно предшествовать спектрометр сессии. В любом случае, равномерно 13C, 15N-меченых образца является необходимым условием для выполнения назначения последовательных и внутри остаточного резонанс. Белки, присвоенный твердотельного ЯМР методами71см. Определение структуры макромолекулярных сборок при умеренной MAS частотах требует выборочно 13C-меченых образцов; для обнаружения на большие расстояния 13C -13C и 13C -15N контакты пробы, основанные на 1,3 -13C - и 2 -13C-gylcerol или 1 -13C - и 2 -13C-глюкозы маркировки являются обычно используется, как описано выше. Выбор между двумя схемами маркировки основана на спектральные отношение сигнал шум и резолюции. Чтобы различать внутри - и межмолекулярных контактов на большие расстояния, смешанные маркировку и разбавленных образцы показали эффективным.

Короче говоря, критические шаги для атомной SSNMR структурные исследования являются: (i подготовка подразделений и Ассамблее необходимо оптимизировать получить отличный образец количество и качество, прочность и приобретения параметры (ii) спектрометр поля должны быть выбраны тщательно; (iii) селективного маркировки стратегии необходимы для определения 3D структуры и количество требуемых данных зависит от качества данных и наличия дополнительных данных.

Несмотря на его применимость к широкому спектру супрамолекулярных систем, начиная от мембранных белков homomultimeric нано объекты SSNMR часто ограничивается потребность мг количество гетерогенны помечены материала. Последние технологические разработки в ультра-быстрой SSNMR MAS (≥100 кГц) открывают проспект 1H-обнаружены ЯМР и push предел количества минимальный пример суб мг 72,,7374. Тем не менее для детального изучения структурных 13C-меченых образцы являются незаменимыми, что ограничивает применение SSNMR образцы собраны в пробирке или систем, выраженные в организмах, которые выживают на минимальный средний, где в клеток SSNMR является новым методом (для отзывов см 75,76,77,78).

Важным фактором в SSNMR приложении, чтобы получить с высоким разрешением 3D структур является спектральное разрешение: встроенные конформационные гетерогенность в сборке может ограничить спектрального анализа спектров и резолюции. Остатков конкретных 13C маркировки может в некоторых случаях обеспечивают альтернативу получить определенное расстояние информацию о стратегических остатков с целью получения структурных моделей (для последних примеров см. 79,80).

SSNMR для определения 3D структуры по-прежнему требует коллекции нескольких наборов данных с временем сбора данных часто long на сложных инструментов, в зависимости от подхода и системы нескольких дней до недель на 600-1000 МГц (частота1H) спектрометр. Таким образом доступ к спектрометра время может быть ограничивающим фактором в углубленное исследование SSNMR.

В случае homomultimeric белка сборки, приводит к SSNMR данных достаточного качества, чтобы выявить большое количество структурных ограничений, таких как в 3,,5764,70, SSNMR по-прежнему дает без доступ к микроскопические размеры. Таким образом в определении структуры SSNMR de novo homomultimeric Ассамблеи, EM или массы в длину (MPL) данных идеально дополняют SSNMR данных для получения параметров симметрии. SSNMR данных только обеспечивают атомной внутри - и межмолекулярных интерфейсов

SSNMR отлично дополняют друг друга с структурные методы, такие как EM или MPL измерения, но данные могут также прекрасно сочетается с атомных структур, полученные кристаллографии рентгеновского снимка или решения ЯМР на мутировавших или усеченных субъединиц. Все большее количество исследований можно найти в литературе, где совместно различных структурных данных позволило для определения атомного 3D моделей высокомолекулярных сборок (см. Рисунок 6 представитель примеры).

В области структурной биологии SSNMR появляется как перспективный способ изучениянерастворимый и некристаллических сборки в атомной, т.е. предоставление структурных данных уровня атомного масштаба. В этой связи, SSNMR является Кулон решение ЯМР и рентгеноструктурного анализа для молекулярной сборки, включая мембранных белков в их родной среде и белка сборок, таких как вирусный конверты, бактериальных нитей или Амилоиды, а также РНК и РНК белковых комплексов (см., например,81). Его чрезвычайно универсальным приложениям в пробирке и в контексте сотовой, например отслеживание вторичные, третичные и четвертичные структурных изменений, выявление поверхности взаимодействия с молекулами партнера на атомной шкале (например, 82) и картирование молекулярной динамики в контексте собрал комплексов, указывают важный потенциал SSNMR в будущих структурных исследований сложных биомолекулярных сборок.

КомпонентM9 среднего
NaCl0,5 г/Л
KH2PO43 г/Л
Na2HPO46,7 г/Л
MgSO41 мм
ZnCl210 МКМ
FeCl31 МКМ
CaCl2100 МКМ
MEM витамин смесь 100 X10 мл/Л
13 C-глюкоза2 г/Л
15 NH4Cl1 г/Л

Таблица 1: Состав минимальной выражение среды для рекомбинантных белков производство в E. coli клетки BL21.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансируется НРУ (13-PDOC-0017-01 B.H. и АНР-14-CE09-0020-01-а.л.), «Инвестиции в будущее» программы IdEx Бордо/CNRS (ПЗЛ 2016 в б.х.) Справочник АНР-10-IDEX-03-02 для б.х., Фонд pour la исследований сообщала ( FRM-AJE20140630090 до а.л.), FP7 программы (FP7-люди-2013-CIG до а.л.) и Совет европейских исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (ERC начиная Грант а.л., соглашение не 639020) и проект " WEAKINTERACT.»

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
NMR спектрометр (> 11,7 Тесла)Bruker-тройной
резонансный зонд MAS SSNMR Роторы Bruker-SSNMR
4 ммЦентрифуга BrukerK1910
5804 R Eppendorf5805000629
GeneQuant 1300 спектрометрDutscher28-9182-13
IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 лDutscher228001
MaxQ 4450 настольный орбитальный шейкерDutscher78376
Трубчатый револьвер МешалкаDutscher79547
сонопульс HD 3100Bandelin3680
МикроПульсер электропораторBiorad165-2100 
mini-PROTEAN тетраклеточная системаBiorad165-8000
AKTA pure systemGE Healthcare29-0182-24
капиллярный микромен M25 пипеткаGilson F148502
Название>CompanyКаталожный номер>Комментарии
Материалы
amiconR ультра-15сигмаZ740199-8EA
капилляры и поршниGilson 
шпательFisher13263799
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Реагенты
D-глюкоза 13C6Сигма389374
Аммоний-15N-хлоридSigma299251
1,3 13C2 глицеринSigma492639
2 13C глицеринSigma489484
канамицинSigmaK1876
карбенициллинSigmaC3416
Фосфат натрия двухосновнойSigmaS7907
Фосфат калия одноосновнойSigmaP5655
Хлорид натрияSigma71380
Хлорид кальцияSigmaC1016
Сульфат магнияSigma208094
хлорид железаSigma157740
Раствор витамина хлорида цинкаSigma793523
MEM (100&раз;)SigmaM68954
IPTGFisherBP1755
База Тризма SigmaT1503
TricineSigmaT0377
SDSSigma436143
азид натрияsigma71289
4,4-диметил-4-силапентан-1-сульфоновая кислота Sigma178837
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Softwares
Unicorn 6.3GE HealthcareAkta systems
ccpNMRCCPN Спектрометрические системы
F148112

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).">Morag, O., Sgourakis, N. G., Baker, D., Goldbourt, A. The NMR-Rosetta capsid model of M13 bacteriophage reveals a quadrupled hydrophobic packing epitope. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 971-976 (2015).
  2. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).">Loquet, A., et al. Atomic model of the type III secretion system needle. Nature. 486 (7402), 276-279 (2012).
  3. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).">Demers, J. P., et al. High-resolution structure of the Shigella type-III secretion needle by solid-state NMR and cryo-electron microscopy. Nat Commun. 5 (4976), (2014).
  4. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).">Habenstein, B., et al. Hybrid Structure of the Type 1 Pilus of Uropathogenic Escherichia coli. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (40), 11691-11695 (2015).
  5. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).">Cady, S. D., et al. Structure of the amantadine binding site of influenza M2 proton channels in lipid bilayers. Nature. 463 (7281), 689-692 (2010).
  6. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).">Park, S. H., et al. Structure of the chemokine receptor CXCR1 in phospholipid bilayers. Nature. 491 (7426), 779-783 (2012).
  7. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).">Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 649-652 (2015).
  8. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).">Wang, S., et al. Solid-state NMR spectroscopy structure determination of a lipid-embedded heptahelical membrane protein. Nat Methods. 10 (10), 1007-1012 (2013).
  9. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059(2015).">Daskalov, A., et al. Signal transduction by a fungal NOD-like receptor based on propagation of a prion amyloid fold. PLoS Biol. 13 (2), e1002059(2015).
  10. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).">Daskalov, A., et al. Identification of a novel cell death-inducing domain reveals that fungal amyloid-controlled cell death is related to necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2016).
  11. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).">Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  12. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).">Knowles, T. P., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (6), 384-396 (2014).
  13. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).">Aguzzi, A., Lakkaraju, A. K. Cell Biology of Prions and Prionoids: A Status Report. Trends Cell Biol. 26 (1), 40-51 (2016).
  14. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).">Habenstein, B., Loquet, A. Solid-state NMR: An emerging technique in structural biology of self-assemblies. Biophys Chem. , (2015).
  15. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).">Meier, B. H., Bockmann, A. The structure of fibrils from 'misfolded' proteins. Curr Opin Struct Biol. 30, 43-49 (2015).
  16. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).">Miao, Y., Cross, T. A. Solid state NMR and protein-protein interactions in membranes. Curr Opin Struct Biol. 23 (6), 919-928 (2013).
  17. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).">Tang, M., Comellas, G., Rienstra, C. M. Advanced solid-state NMR approaches for structure determination of membrane proteins and amyloid fibrils. Acc Chem Res. 46 (9), 2080-2088 (2013).
  18. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).">Weingarth, M., Baldus, M. Solid-state NMR-based approaches for supramolecular structure elucidation. Acc Chem Res. 46 (9), 2037-2046 (2013).
  19. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).">Loquet, A., Habenstein, B., Lange, A. Structural investigations of molecular machines by solid-state NMR. Acc Chem Res. 46 (9), 2070-2079 (2013).
  20. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).">Yan, S., Suiter, C. L., Hou, G., Zhang, H., Polenova, T. Probing structure and dynamics of protein assemblies by magic angle spinning NMR spectroscopy. Acc Chem Res. 46 (9), 2047-2058 (2013).
  21. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).">Tycko, R., Wickner, R. B. Molecular structures of amyloid and prion fibrils: consensus versus controversy. Acc Chem Res. 46 (7), 1487-1496 (2013).
  22. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).">Hong, M., Zhang, Y., Hu, F. Membrane protein structure and dynamics from NMR spectroscopy. Annu Rev Phys Chem. 63, 1-24 (2012).
  23. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).">Jelinek, R., Ramamoorthy, A., Opella, S. J. High-Resolution Three-Dimensional Solid-state NMR Spectroscopy of a Uniformly 15N-Labeled Protein. J Am Chem Soc. 117, 12348-12349 (1995).
  24. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).">Xu, J., et al. Bicelle-enabled structural studies on a membrane-associated cytochrome B5 by solid-state MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (41), 7864-7867 (2008).
  25. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).">Durr, U. H., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelles lights up membrane protein structure. Chem Rev. 112 (11), 6054-6074 (2012).
  26. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556(2013).">Yamamoto, K., et al. Probing the transmembrane structure and topology of microsomal cytochrome-p450 by solid-state NMR on temperature-resistant bicelles. Sci Rep. 3, 2556(2013).
  27. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).">Huang, R., et al. Probing the transmembrane structure and dynamics of microsomal NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase by solid-state NMR. Biophys J. 106 (10), 2126-2133 (2014).
  28. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).">Durr, U. H., Yamamoto, K., Im, S. C., Waskell, L., Ramamoorthy, A. Solid-state NMR reveals structural and dynamical properties of a membrane-anchored electron-carrier protein, cytochrome b5. J Am Chem Soc. 129 (21), 6670-6671 (2007).
  29. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).">Hong, M. Determination of multiple phi-torsion angles in proteins by selective and extensive (13)C labeling and two-dimensional solid-state NMR. J Magn Reson. 139 (2), 389-401 (1999).
  30. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).">Lundstrom, P., et al. Fractional 13C enrichment of isolated carbons using [1-13C]- or [2- 13C]-glucose facilitates the accurate measurement of dynamics at backbone Calpha and side-chain methyl positions in proteins. J Biomol NMR. 38 (3), 199-212 (2007).
  31. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).">Loquet, A., Lv, G., Giller, K., Becker, S., Lange, A. 13C spin dilution for simplified and complete solid-state NMR resonance assignment of insoluble biological assemblies. J Am Chem Soc. 133 (13), 4722-4725 (2011).
  32. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).">Castellani, F., et al. Structure of a protein determined by solid-state magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Nature. 420 (6911), 98-102 (2002).
  33. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).">Higman, V. A., et al. Assigning large proteins in the solid state: a MAS NMR resonance assignment strategy using selectively and extensively 13C-labelled proteins. J Biomol NMR. 44 (4), 245-260 (2009).
  34. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).">Bockmann, A., et al. Characterization of different water pools in solid-state NMR protein samples. J Biomol NMR. 45 (3), 319-327 (2009).
  35. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).">Cavanagh, J., Fairbrother, W. J., Palmer, A. G., Skelton, N. J. Protein NMR spectroscopy, principles and practice. , Academic. San Diego. (1996).
  36. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).">Hartman, S. R., Hahn, E. L. Nuclear Double Resonance in the Rotating Frame. Phys Rev. 128 (5), 2042-2053 (1962).
  37. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).">Harris, R. K., et al. Further conventions for NMR shielding and chemical shifts IUPAC recommendations 2008. Solid State Nucl Magn Reson. 33 (3), 41-56 (2008).
  38. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).">Wang, Y., Jardetzky, O. Probability-based protein secondary structure identification using combined NMR chemical-shift data. Protein Sci. 11 (4), 852-861 (2002).
  39. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).">Shaka, A. J., Baker, P. B., Freeman, R. Computer-Optimized Scheme for Wideband Applications and Low-Level Operation. J Magn Reson. 64, 547-552 (1985).
  40. http://bmrb.wisc.edu/ (2017).">BMRB - Biological Magnetic Resonance Bank. , http://bmrb.wisc.edu/ (2017).
  41. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).">Szeverenyi, N. M., Sullivan, M. J., Maciel, G. E. Observation of Spin Exchange by Two-Dimensional Fourier-Transform C-13 Cross Polarization-Magic-Angle Spinning. J Magn Reson. 47, 462-475 (1982).
  42. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).">Baldus, M., Petkova, A. T., Herzfeld, J., Griffin, R. G. Cross polarization in the tilted frame: assignment and spectral simplification in heteronuclear spin systems. Mol Phys. 95 (5), 1197-1207 (1998).
  43. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).">Verel, R., Ernst, M., Meier, B. H. Adiabatic dipolar recoupling in solid-state NMR: the DREAM scheme. J Magn Reson. 150 (1), 81-99 (2001).
  44. http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).">CcpNmr Analysis — Collaborative Computational Project for NMR. , http://www.ccpn.ac.uk/software/analysis (2017).
  45. https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).">Sparky - NMR Assignment and Integration Software. , https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ (2017).
  46. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).">Luca, S., et al. Secondary chemical shifts in immobilized peptides and proteins: a qualitative basis for structure refinement under magic angle spinning. J Biomol NMR. 20 (4), 325-331 (2001).
  47. http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).">TALOS+: Prediction of Protein Backbone Torsion Angles from NMR Chemical Shift. , http://spin.niddk.nih.gov/bax/software/TALOS/ (2017).
  48. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).">Shen, Y., Bax, A. SPARTA+: a modest improvement in empirical NMR chemical shift prediction by means of an artificial neural network. J Biomol NMR. 48 (1), 13-22 (2010).
  49. http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).">SHIFTOR Dihedral angles from chemical shifts and homology. , http://wishart.biology.ualberta.ca/shiftor/ (2017).
  50. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).">Berjanskii, M. V., Neal, S., Wishart, D. S. PREDITOR: a web server for predicting protein torsion angle restraints. Nucleic Acids Res. 34 (Web Server issue), W63-W69 (2006).
  51. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).">Bardiaux, B., Malliavin, T., Nilges, M. ARIA for solution and solid-state NMR. Methods Mol Biol. 831, 453-483 (2012).
  52. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).">Guerry, P., Herrmann, T. Comprehensive automation for NMR structure determination of proteins. Methods Mol Biol. 831, 429-451 (2012).
  53. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).">Vasa, S., et al. beta-Helical architecture of cytoskeletal bactofilin filaments revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), E127-E136 (2015).
  54. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).">He, L., et al. Structure determination of helical filaments by solid-state NMR spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (3), E272-E281 (2016).
  55. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).">Tang, M., et al. High-resolution membrane protein structure by joint calculations with solid-state NMR and X-ray experimental data. J Biomol NMR. 51 (3), 227-233 (2011).
  56. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).">Paravastu, A. K., Leapman, R. D., Yau, W. M., Tycko, R. Molecular structural basis for polymorphism in Alzheimer's beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18349-18354 (2008).
  57. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).">Schutz, A. K., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of amyloid beta fibrils bearing the Osaka mutation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 331-335 (2015).
  58. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).">Sgourakis, N. G., Yau, W. M., Qiang, W. Modeling an in-register, parallel "iowa" abeta fibril structure using solid-state NMR data from labeled samples with rosetta. Structure. 23 (1), 216-227 (2015).
  59. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).">Lewandowski, J. R., De Paepe, G., Griffin, R. G. Proton assisted insensitive nuclei cross polarization. J Am Chem Soc. 129 (4), 728-729 (2007).
  60. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).">Carlon, A., et al. How to tackle protein structural data from solution and solid state: An integrated approach. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 92-93, 54-70 (2016).
  61. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).">Judge, P. J., Taylor, G. F., Dannatt, H. R., Watts, A. Solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy for membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. 1261, 331-347 (2015).
  62. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).">Wang, S., Ladizhansky, V. Recent advances in magic angle spinning solid state NMR of membrane proteins. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 82, 1-26 (2014).
  63. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).">Sborgi, L., et al. Structure and assembly of the mouse ASC inflammasome by combined NMR spectroscopy and cryo-electron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (43), 13237-13242 (2015).
  64. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).">Loquet, A., et al. Atomic structure and handedness of the building block of a biological assembly. J Am Chem Soc. 135 (51), 19135-19138 (2013).
  65. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).">Walti, M. A., et al. Atomic-resolution structure of a disease-relevant Abeta(1-42) amyloid fibril. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4976-E4984 (2016).
  66. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).">Colvin, M. T., et al. Atomic Resolution Structure of Monomorphic Abeta42 Amyloid Fibrils. J Am Chem Soc. 138 (30), 9663-9674 (2016).
  67. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).">Xiao, Y., et al. Abeta(1-42) fibril structure illuminates self-recognition and replication of amyloid in Alzheimer's disease. Nat Struct Mol Biol. 22 (6), 499-505 (2015).
  68. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).">Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human alpha-synuclein. Nat Struct Mol Biol. 23 (5), 409-415 (2016).
  69. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).">Wasmer, C., et al. Amyloid fibrils of the HET-s(218-289) prion form a beta solenoid with a triangular hydrophobic core. Science. 319 (5869), 1523-1526 (2008).
  70. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).">Van Melckebeke, H., et al. Atomic-resolution three-dimensional structure of HET-s(218-289) amyloid fibrils by solid-state NMR spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (39), 13765-13775 (2010).
  71. http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).">BMRB Solid-state NMR entries. , http://www.bmrb.wisc.edu/data_library/solidstate.shtml (2017).
  72. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).">Lamley, J. M., et al. Solid-state NMR of a protein in a precipitated complex with a full-length antibody. J Am Chem Soc. 136 (48), 16800-16806 (2014).
  73. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).">Agarwal, V., et al. De novo 3D structure determination from sub-milligram protein samples by solid-state 100 kHz MAS NMR spectroscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (45), 12253-12256 (2014).
  74. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).">Stanek, J., et al. NMR Spectroscopic Assignment of Backbone and Side-Chain Protons in Fully Protonated Proteins: Microcrystals, Sedimented Assemblies, and Amyloid Fibrils. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (50), 15504-15509 (2016).
  75. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).">Baker, L. A., Baldus, M. Characterization of membrane protein function by solid-state NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 27, 48-55 (2014).
  76. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).">Luchinat, E., Banci, L. In-cell NMR: a topical review. IUCrJ. 4 (Pt 2), 108-118 (2017).
  77. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).">Freedberg, D. I., Selenko, P. Live cell NMR. Annu Rev Biophys. 43, 171-192 (2014).
  78. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).">Selenko, P., Wagner, G. Looking into live cells with in-cell NMR spectroscopy. J Struct Biol. 158 (2), 244-253 (2007).
  79. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).">Qiang, W., Yau, W. M., Luo, Y., Mattson, M. P., Tycko, R. Antiparallel beta-sheet architecture in Iowa-mutant beta-amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (12), 4443-4448 (2012).
  80. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).">Bateman, D. A., Tycko, R., Wickner, R. B. Experimentally derived structural constraints for amyloid fibrils of wild-type transthyretin. Biophys J. 101 (10), 2485-2492 (2011).
  81. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024(2015).">Marchanka, A., Simon, B., Althoff-Ospelt, G., Carlomagno, T. RNA structure determination by solid-state NMR spectroscopy. Nat Commun. 6, 7024(2015).
  82. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).">Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (26), 5956-5960 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Solid State NMRMacromolecular AssembliesIsotope LabelingMagic Angle SpinningProtein Filament AssemblyCP ExperimentPDSD ExperimentResonance AssignmentDistance RestraintsStructural Modeling

Related Articles