Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение первичных клеток сетчатки сетчатки (RGCs) проточной цитометрией

15.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55785

⸱

5 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

В этой статье

Краткое содержание

Миллионы людей страдают от дегенеративных заболеваний сетчатки, что приводит к необратимой слепоте. Общим элементом многих из этих заболеваний является потеря ганглиозных клеток сетчатки (RGCs). Этот подробный протокол описывает выделение первичных мышиных РГК положительным и отрицательным выбором с проточной цитометрией.

Аннотация

Нейродегенеративные заболевания часто оказывают разрушительное воздействие на пострадавших. Потеря сетчатой ​​ганглиозной клетки (RGC) связана с множеством заболеваний, включая диабетическую ретинопатию и глаукому, в дополнение к нормальному старению. Несмотря на их важность, RGCs чрезвычайно трудно изучить до сих пор, отчасти из-за того, что они составляют лишь небольшой процент широкого разнообразия клеток сетчатки. Кроме того, современные методы изоляции используют внутриклеточные маркеры для идентификации РГК, которые производят нежизнеспособные клетки. Эти методы также включают длинные протоколы изоляции, поэтому существует недостаток практических, стандартизованных и надежных методов для получения и изоляции RGC. В этой работе описывается эффективный, всеобъемлющий и надежный метод выделения первичных РГК из сетчатки сетчатки с использованием протокола, основанного на положительных и отрицательных критериях отбора. Представленные методы позволяют в будущем изучать РСК с целью лучшего понимания основныхСнижение остроты зрения, возникающее в результате потери функциональных РГК при нейродегенеративных заболеваниях.

Введение

RGCs являются терминально дифференцированными нейронами, поэтому первичные клетки необходимы для экспериментов. Разработка протокола для выделения и обогащения первичных ячеистых ганглиозных клеток мыши (RGCs) имеет основополагающее значение для выявления механизмов здоровья и дегенерации RGC in vitro . Это особенно важно для исследований, направленных на создание потенциальной терапии для содействия функции RGC и сведения к минимуму их смерти. Дегенерация RGCs связана с дегенеративными заболеваниями сетчатки, такими как глаукома, диабетическая ретинопатия и нормальное старение. Хотя специфические клеточные механизмы, лежащие в основе потери RGC, неясны, определен ряд факторов риска. Отсутствие оксигенации у головы зрительного нерва 1 , 2 , 3 вызывает смерть RGC 4 и действует как нарушение гомеостаза между активацией возбуждающего и iNhibitory в отдельных RGCs 5 , 6 . Ряд проблем препятствует прогрессу в использовании этих клеток для углубленных исследований. Во-первых, количество РГК, присутствующих в мышиной сетчатке, невелико. RGCs составляют менее 1% от общего количества клеток сетчатки 7 , 8 , 9 . Во-вторых, большинство RGC-специфических маркеров являются внутриклеточными белками 10 , 11 , 12 . Выбор на основе этих маркеров оставляет клетки нежизнеспособными, что исключает последующие функциональные анализы. Наконец, имеющиеся в настоящее время протоколы являются длительными и не имеют стандартизации 13 , 14 . Ранние протоколы изоляции RGC были основаны на методах иммунодекундирования. Barres et al. 15 Адаптировал классический иммунопатИ добавили вторую стадию, которая исключала моноциты и эндотелиальные клетки из основной массы клеток сетчатки до положительного отбора на основе иммуноположительности к антитимоцитарному антигену (aka Thy1), маркер поверхности клетки. Годы спустя, Hong et al. Комбинированные методы изоляции магнитных шариков с использованием стратегий сортировки клеток для выделения RGC с более высокой чистотой 16 . Использование магнитных шариков по-прежнему используется во многих научных приложениях. Вместе магнитные гранулы и протоколы проточной цитометрии улучшали чистоту изолированных клеток. Однако эти системы очистки еще не стандартизированы для выделения мышиных РГК из диссоциированных сетчаток.

Проточная цитометрия является мощным аналитическим методом, который измеряет оптические и флуоресцентные характеристики клеточных суспензий. Клетки анализируются как количественно, так и качественно с высоким уровнем чувствительности, обеспечивая многомерный анализ клеточного населенияция. Клеточная дискриминация основана на двух основных физических свойствах: размер ячейки или площадь поверхности и гранулярность или внутренняя сложность 17 . Многомерный анализ может быть осуществлен путем объединения антител, меченных флюорохромами, которые имеют одинаковые длины волн возбуждения и различные выбросы. Потоковая цитометрия быстрая, воспроизводимая и чувствительная. Многоканальные лазеры позволяют проводить еще больший многомерный анализ отдельных клеток методом проточной цитометрии. Таким образом, это привлекательная методология для изучения цитологических образцов. Флуоресцентная активированная сортировка клеток (FACS) использует многомерные фенотипические различия, идентифицированные проточной цитометрией, для сортировки отдельных клеток в отдельные субпопуляции.

В последнее десятилетие множественные поверхностные и внутриклеточные белки были идентифицированы как потенциальные биомаркеры для отбора клеток, включая нейроны. Первоначальные исследования, направленные на выделение RGCs у крыс, использовали Thy1 в качестве ганглия celЛ. К сожалению, Thy1, aka CD90, имеет множественные изоформы у других видов 18 , 19 , 20 грызунов и выражен несколькими типами 19-20 клеток сетчатки, что делает его неспецифическим маркером для RGC. Другой поверхностный маркер, CD48, обнаружен в моноцитарных популяциях сетчатки, включая макрофаги и микроглии. Используя эти два поверхностных маркера, были изменены модифицированные метки RGC-Thy1 + и CD48-негативные клетки 15 , 16 , 21 , 22 . К сожалению, этих двух критериев отбора недостаточно для выбора высокообогащенного популяции RGC. Для решения этой неудовлетворенной потребности был разработан протокол проточной цитометрии 23 на основе многослойных положительных и отрицательных критериев отбора usiNg известных маркеров поверхности клеток для обогащения и очистки первичных мышиных RGC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, описанные в следующем протоколе, были одобрены комиссией по рассмотрению рекомендаций по институциональному уходу и использованию животных (IACUC) в Научном центре здоровья Университета Теннесси (UTHSC) и последовали за Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) Животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения, в дополнение к рекомендациям для лабораторных экспериментов на животных (Институт лабораторных животных, Политика общественного здравоохранения в области гуманного ухода и использования лабораторных животных).

1. Подготовка инструментов, решений и средств массовой информации

Примечание. Вся информация о материалах, реагентах, инструментах и ​​инструментах, о которых сообщается в протоколе, указана в таблице материалов .

  1. Автоклавируйте все инструменты для вскрытия и храните их в стерильной области. Используйте следующие инструменты: 4 стандартных щипца (2 длинных и 2 коротких) и 2 ножницы,А также 2 щипца (1 длинный и 1 короткий) и 1 ножница для рассечения; Сохраните дополнительный набор в качестве резервной копии.
  2. Подготовьте 100 мл стерильного раствора PBS / 1% FBS для использования во время промывок, процедур иммуноблока и процедур сортировки клеток. Хранить раствор охлажденным до 4 ° C.
    Примечание. Не добавляйте азид натрия (NaN 3 ) к раствору, так как он может быть токсичным для живых клеток.
    1. Подготовьте 100 мл PBS / 1% FBS с 99 мл PBS и 1 мл FBS.
  3. Подготовьте 100 мл стерильной нейронной клеточной среды, дополненной 3% FBS (см. Таблицу материалов ) для использования в качестве собирательной и культуральной среды. Держите среду для культивирования клеток стерильной при 4 ° C. Перед нагреванием нагрейте его до комнатной температуры (RT).
    1. Подготовьте 100 мл нейронной клеточной среды, дополненной 3% FBS, используя 97 мл нейронной клеточной среды и 3 мл FBS.
  4. Предварительно охлажденные трубки для сбора (15-мл пробирки), предварительно покрытые 5 мл среды для сбора, помещали tПодол в ведро для льда. Используйте только полипропиленовые трубки, чтобы предотвратить прилипание клеток к поверхности трубки.
  5. Поместите 40-миллиметровые блюда, нейлоновые фильтры объемом 70 мкм, шприцы, пестики для фильтра для клеток и стерильные полипропиленовые трубки в шкафу для биобезопасности. Стерилизуйте все предметы до процедур и поддерживайте их в стерильном режиме во всех процедурах.
    Примечание. Все шаги после сбора сетчатки будут выполняться в шкафу биобезопасности.

2. Энуклеация

Примечание. В этом эксперименте использовали в общей сложности 10 молодых (5-7 недель) мышей C57BL / 6J для выделения 1,0 × 10 6 RGCs с фенотипом CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .

  1. Усыплять мышей с помощью ингаляции СО 2 с последующим вывихом шейки матки. Всегда используйте метод вторичной эвтаназии для обеспечения того, чтобы погибшее животное умерло.
    Примечание. Изофлуран можно использовать в качестве альтернативы CO 2 . Кетамин не рекомендуется, так как он связан с увеличением внутриглазного давления (ВГД) при использовании в качестве индуктора анестезии 24 , 25 .
  2. Вставьте щипцы под земной шар глаза, возьмитесь за зрительный нерв и подтяните; Глобус будет enucleated, с оптическим нервом нетронутым. Поместите собранные глаза во флакон, содержащий PBS, и держите флакон на льду до следующего шага.
    Примечание. Любой персонал может выполнить этот шаг после получения соответствующего обучения в Лаборатории по уходу за животными (LACU).

3. Приготовление суспензии клеток сетчатки

  1. Поместите собранный глаз на базовую пластину рассекающего микроскопа, чтобы начать рассечение роговицы. Рассекайте каждый глаз индивидуально.
  2. Аккуратно держите глобус на поверхности зрительного нерва с помощью щипцов. Для этого шага используйте один лонГ, и один короткий стандартный пинцет.
  3. Используйте 30-мерную (30G) острую иглу для прокола роговицы, чтобы водный юмор мог эвакуироваться из глаза, что облегчает удержание глаз с помощью щипцов.
  4. Удерживайте роговицу с помощью щипцов и используйте ножницы, чтобы сделать небольшой разрез в роговице. Аккуратно очистите роговицу и склеру с помощью щипцов. Когда глобус очищается наполовину, прокрутите сетчатку и объектив с помощью щипцов. Отбросьте роговицу, склеру и линзу.
    Примечание. Этот метод гарантирует, что сетчатка полностью отсоединяется от остальной части глаза.
  5. Поместите сетчатку в маленькую 40-миллиметровую чашку Петри, содержащую PBS / 1% FBS.
    Примечание. В качестве альтернативы чашке Петри можно использовать блюдо для культуры клеток. Обязательно всегда держите сетчатку влажной, как в физиологических условиях.
    1. Промойте каждую сетчатку три раза свежей стерильной PBS / 1% FBS в шкафу биобезопасности.
  6. Установите до 12 ретинок наСтерильный нейлоновый фильтр размером 70 мкм, смоченный PBS / 1% FBS. Используя задний конец 10-мл шприца, осторожно мацерируйте сетчатки, используя круговое движение, чтобы отсоединить клетки.
    1. В качестве альтернативы, используйте пестик для мацерации сетчатки или используйте ферментативное расщепление с комбинацией папаина 15 МЕ / мл, 5 мМ L-цистеина и 200 ед. / Мл ДНКазы I в течение 15 мин при 37 ° С с последующей инактивацией с помощью PBS / 10% FBS.
      Примечание. Никаких изменений в процентном соотношении клеток, восстановленных, не наблюдалось, когда ферментативное расщепление сравнивали с мацерацией либо с задним концом шприца, либо с пестиком.
  7. Чтобы перенести изолированные клетки, поместите стерильный нейлоновый фильтр размером 70 мкм поверх трубки для сбора полипропилена. Пропустите собранные клетки через фильтр, используя пипетку P1000. Промойте фильтр ( шаг 3.6 ) с PBS / 1% FBS, чтобы освободить оставшиеся клетки и перенести их в собирающую трубку.
  8. Добавить PBS / 1% FBS доКонечный объем 1 мл на сетчатку. Центрифугируют суспензию клеток в течение 7 мин при 200 мкг и RT.
    Примечание. В зависимости от количества мацерированной сетчатки (<6 сетчатки), осадок клеток может быть слишком мал, чтобы быть видимым.
    1. Удалите клеточный супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в PBS / 1% FBS, используя соотношение 1 мл на 5 ретиналей.
  9. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
    1. Очистите стеклянный гемоцитометр и покровное стекло с 70% -ным спиртом. Аккуратно закрутите пробирку, содержащую клетки, чтобы обеспечить равномерное распределение суспензии клеток сетчатки. Поместите 20 мкл 0,4% трипанового синего в микроцентрифужную пробирку и смешайте с 20 мкл клеточной суспензии.
    2. Аккуратно перемешайте и нанесите 10 мкл 0,4% смеси трипановых синих / клеточных суспензий на гемоцитометр, заполняя обе камеры; Капиллярное действие будет подтягивать подповерхностную смесь 0,4% трипановой сине-клеточной суспензии. Используя микроскоп, подсчитайте все трипановые сине-отрицательные клетки; ТхиS представляет собой живые клетки.
    3. Определите жизнеспособность клеток, используя следующую формулу: количество живых клеток / общее количество клеток =% жизнеспособности.
      Примечание. Если жизнеспособность клеток составляет менее 95%, использование флуоресцентного красителя для дискриминации жизнеспособности клеток требуется во время FACS.
  10. Используйте флуоресцентный краситель, который не является проницаемым для живых клеток. Промойте клетки с помощью PBS, чтобы удалить следы сыворотки. Добавьте 1 мкл флуоресцентного красителя для селективности жизнеспособности клеток на 5,0 × 10 6 клеток в конечном объеме 100 мкл. Инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин, защищать от света. Добавьте 10x объем PBS / 1% FBS. Центрифуга в течение 5 мин при 200 мкг и RT.
  11. Инкубируйте клеточную суспензию в течение ночи при 4 ° C, если необходимо. Если это будет сделано, заполните трубку суспензии клеток нейронной клеточной средой, а не PBS / 1% FBS. Поместите трубку горизонтально и держите ее при 4 ° C.

4. Иммунобразование ReТитановые клетки

  1. Используйте следующее преобразование для определения объема антитела на число клеток: 2 мкл антитела на 5,0 × 10 6 клеток в объеме 100 мкл.
  2. Вымойте клетки и поддерживайте их в PBS / 1% FBS. Возьмите небольшую аликвоту клеток (5,0 × 10 6 клеток) для использования в качестве отрицательного контроля (немеченого) во время сортировки.
    Примечание. Этот отрицательный контроль имеет решающее значение для правильной калибровки сортировщика клеток.
  3. Чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание антител с клетками, которые экспрессируют рецепторы Fcγ II и III, добавить 1 мкл антимышиного CD16 / 32 антитела на 1,0 × 10 6 клеток в конечном объеме 50 мкл с использованием PBS / 1% FBS. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Добавьте коктейль антитела к образцу и осторожно перемешайте пипетированием. Инкубируйте 30 минут в ведерко. Убедитесь, что ведро льда покрыто, поскольку свет может скомпрометировать эксперимент из-за фотообесцвечивания меченого фтораphores.
    1. Подготовьте коктейль антитела с помощью следующих флюоресцентно меченых антимышиных антител: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE и немаркированный CD57.
      Примечание. Для каждого антитела используйте следующие концентрации на 5,0 × 10 6 клеток: CD90.2 AF700, 1 мкг; CD48-PE-цианин7, 0,4 мкг; CD15 PE, 0,02 мкг; И без метки CD57, 0,4 мкг.
      1. Используйте объемы в соответствии со следующими расчетами (на основе коммерчески доступных антител, перечисленных в Таблице материалов ): всего 5,0 × 10 7 клеток, подлежащих маркировке; 2 мкл на 5,0 × 10 6 клеток = 20 мкл каждого антитела; 4 разных антитела = 80 мкл коктейля антител; Конечный объем = [(5,0 × 10 7 полных клеток) / 5,0 × 10 6 клеток] × 100 = 1000 мкл; 80 мкл Abs + 50 мкл антимышиного CD16 / 32 + 870 мкл PBS / 1% FBS = 1000 мкл.
        Примечание. Эта комбинация обеспечилаОптимальное сочетание флуорохромов для конфигурации прибора. Следующие параметры суммируют излучение и возбуждение: AF-700, излучение 719 нм при возбуждении красным диодным лазером на 638 нм; PE-Cyanine7, излучение 767 нм при возбуждении синим диодным лазером 488 нм; И PE, излучение 575 нм при возбуждении синим диодным лазером 488 нм.
  5. После 30-минутной инкубации довести объем до 5 мл с использованием PBS / 1% FBS. Промывают образцы, центрифугируя их в течение 7 мин при 200 мкг и RT. Повторите процедуру один раз, чтобы удалить все несвязанные антитела.
  6. Добавьте 2 мкл вторичного антитела (0,1 мкг), который свяжет CD57 5,0 × 10 6 клеток. Инкубируйте в течение 30 мин в ведерко для льда, как на этапе 4.4 . Вымойте ячейки дважды, как на шаге 4.5 .
    1. Обозначьте клетки вторичным антителом, если на этапе 4.4 использовалось немаркированное первичное антитело.
      Примечание: второйАрильное антитело, выбранное для этой конфигурации, приведено в таблице материалов ; Он имеет длину волны излучения 421 нм. Используйте его с полосовым фильтром 450/50 нм при возбуждении фиолетовым диодным лазером при 405 нм.
    2. Используйте объемы согласно следующим расчетам (на основе коммерчески доступных антител, перечисленных в таблице материалов ): 2 мкл на 5,0 × 10 6 клеток = 20 мкл вторичного антитела; Конечный объем = [(5,0 × 10 7 полных клеток) / 5,0 × 10 6 клеток] x 50 = 500 мкл; 20 мкл Abs + 480 мкл PBS / 1% FBS = 500 мкл.
  7. Храните помеченные клетки в PBS / 1% FBS. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра; Используйте конечную концентрацию клеток сетчатки 3,0 - 4,0 × 10 7 клеток / мл.
    Примечание. Не используйте клеточную среду для разбавления клеток, потому что фенольный красный может увеличить аутофлуоресценцию, тем самым уменьшая разрешение между негативнымиIve и положительные клетки. Конечная концентрация клеток на объем сильно зависит от объемного расхода конфигурации прибора.
  8. Используйте одноцветные элементы управления во время настройки, чтобы минимизировать флуоресценцию.
    Примечание. Этот шаг, также известный как компенсация, применяется для коррекции шума, создаваемого комбинацией флуорофоров. Полистирольные микросферы в PBS / 0,1% BSA / 2 мМ NaN 3 с способностью связывать флуоресцентно меченные изотипы иммуноглобулина (Ig) от нескольких видов обеспечивают положительный контроль для установления компенсации.
    1. Поместите 3 капли полистироловых микросфер в стерильные трубки FACS, выделяя один на флуорофор. Добавьте 1 мкг соответствующего флуорофора в каждую пробирку. Инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Добавить 3 мл PBS / 1% FBS в пробирки для образцов. Центрифуга в течение 5 мин при 200 мкг и RT. Осторожно удалить супернатант и ресуспендировать в 250 мкл PBS / 1% FBS.
    2. Чтобы настроить отрицательный символOls, используют полистирольные микросферы, которые не связываются с Ig. Проведите этот шаг накануне, если необходимо.

5. Стратегия сортировки ячеек

Примечание. Конкретные инструкции по настройке прибора для FACS с длиной волны 355 нм; 405 нм, фиолетовый; 488 нм, синий; И 640 нм, красные лазеры с распределением каналов флуоресценции 2, 2, 5 и 3 соответственно. Операционное программное обеспечение было DIVA версии 8.0.1. Сортировка клеток проводилась с помощью сопла 70 мкм, давления оболочки 70 фунтов на квадратный дюйм, частоты 87,5, амплитуды 48,6 с первым перерывом при разрыве на 333, разрыва в ширину 6, точности сортировки, установленной на четырехстороннюю чистоту с маской чистоты по умолчанию (32), и падение С поправкой на 42,98 с использованием бисера.

  1. Используйте 15-миллилитровые полипропиленовые конические трубки в качестве сборных сосудов. Добавьте в каждую пробирку 5 мл среды для сбора (клеточная культуральная среда) и поверните трубку для покрытия стенок.
    Примечание. Этот шаг предотвращает прилипание клеток к сторонам tСборщик труба. В качестве альтернативы трубку можно покрыть неразбавленным FBS.
  2. Примите во внимание эффективность сортировщика клеток для оценки конечного выхода клеток.
    Примечание . Эффективность сортировки зависит от используемого проточного цитометра. RGCs с CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg фенотип составляют около 1% всех клеток сетчатки.
  3. Проведите сортировку ячеек, выполненную обученным оператором (обычно в основном объекте). Убедитесь, что прибор очищен и стерилизуется 70% этанолом до получения образца. Тщательно протрите снаружи сборных трубок 70% этанолом.
  4. Если клетки оседают или агрегируются, пипетка клеток вверх и вниз и фильтруют суспензию через стерильный 40 мкм нейлоновый фильтр перед приобретением. Обязательно контролируйте температуру и удерживайте ее при 4 ° C, пока выполняется сортировка ячейки; Неспособность сделать это уменьшит celЛ.
  5. Перед проведением экспериментов обсудите детали сортировки с оператором сортировки клеток.
    Примечание. Во время эксперимента оператор сортировщика клеток щелкнул по кнопке с панели инструментов рабочего пространства программного обеспечения для сбора данных для цитометра. Это браузер , цитометр , инспектор , рабочий лист и панель сбора данных . Стратегия сортировки клеток, используемая здесь, называется двухопорной. Собираются две популяции: обогащенные РГК и все другие типы клеток. Если необходимо собирать дополнительные популяции, можно выделить до двух дополнительных популяций в виде 4-сторонней сортировки. Если будут собраны дополнительные популяции, сортировщик клеток потребует разных труб для сбора и настройки.
  6. Выполните компенсацию для коррекции спектрального перекрытия от флуорофоров.
    Примечание. Этот процесс можно выполнить вручную, настроивС каждой настройкой, или это может быть сделано автоматически как часть используемого программного обеспечения. Большинство программ для оборудования сортировки ячеек имеют возможность автоматической компенсации. Он считается золотым стандартом и самым точным видом компенсации. На этом этапе будет использоваться отрицательный образец (без флуорофора) и отдельные контрольные образцы, полученные с использованием микросфер полистирола (гранулы компенсации), специально изготовленные для связывания всех соответствующих моноклональных антител, используемых в эксперименте.
    1. Выберите « Эксперимент»> «Настройка компенсации»> «Создать элементы управления компенсацией» . Добавьте элементы управления, специфичные для флуорофора, из списка, отображаемого на экране. Нажмите « ОК» .
      Примечание. Отображается компенсационная трубка для каждого из элементов управления.
      1. Используйте немеченой контроль (без флуорофора, шаг 4.2 ), чтобы проверить рассеянный вперед свет (FSC), рассеянный на стороне свет (SSC) и затвор начальной популяции (P1).
    2. Установите отрицательную контрольную трубку на цитометр и нажмите «Нагрузка». Убедитесь, что отображается интересующая популяция и выберите ее. Это популяция 1 (P1). Щелкните правой кнопкой мыши по элементу P1 и выберите « Применить ко всем элементам управления компенсацией» . Нажмите « Записать данные» . После завершения записи нажмите « Разгрузить» и удалите трубку.
    3. Установите следующую трубку на цитометр, как показано на экране. Повторите шаг 5.6.2 до тех пор, пока не будут записаны все данные из элементов управления.
    4. Выберите « Эксперимент»> «Настройка компенсации»> «Рассчитать компенсацию» . Сохраните настройки и назовите эксперимент. Нажмите « Связь и сохранение» .
      Примечание. Компенсация является необходимым шагом, поскольку она устраняет перекрытие спектра между детекторами.
    5. Если требуется ручная компенсация, сделайте это, настроив средства положительных сигналов так, чтобы они равны отрицательным значениям для eacЧ используемых флуорохромов.
      Примечание. Этот шаг выполняется при работе сортировщика клеток и может занять 30 минут.
  7. Стратегия игры ( Рисунок 3A ).
    1. Настройте P1, построив FSC по сравнению с SSC; FSC указывает на размер, а SSC ​​указывает внутреннюю сложность ячеек. См. Рисунок 3A .
    2. Нарисуйте псевдоколорный график SSC-H (высота) по сравнению с SSC-W (ширина) с использованием выбранной совокупности на шаге 5.7.1 (P1); Псевдоколорный график позволяет визуально отображать плотность клеток относительно друг друга.
      Примечание: нижняя плотность ячейки представлена ​​синим и зеленым цветом, тогда как красная и оранжевая области представляют собой высокую плотность клеток.
      1. Выполните этот шаг, чтобы собрать только отдельные ячейки; Одиночный элемент ячейки называется P2. См. Рисунок 3A .
    3. Повторите шаг 5.7.2FSC-H по сравнению с FSC-W с использованием P2. Убедитесь, что выбор отдельных ячеек как «дублетов» или клеточных глыб содержит как положительный, так и отрицательный маркер, обеспечивая ложную положительность.
    4. Нарисуйте псевдоколорный график CD90.2 по сравнению с CD48. Выделите все CD90.2 + CD48 негативные клетки для устранения моноцитов из обогащения RGC; Вызовите этот диск CD90.2 + CD48 neg или P3. См. Рисунок 3A .
    5. Используя выбранную CD90.2 + CD48 негативную популяцию или затвор P3, нарисуйте псевдоколорный график CD57 по сравнению с CD15, чтобы устранить примеси amacrine-клеток из обогащения RGC. Ворота CD15 neg CD57 neg population. См. Рисунок 3A .
  8. Определите популяции, собираемые для образца в окне «Сортировка макета», и продолжите сортировку ячеек; Образцом для сбора является CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg р>.
    Примечание. Сортировка населения выбирается из раскрывающегося меню « Добавить» в окне сортировки. После добавления населения он будет запрашивать целевые события или сколько событий нужно собирать. В любое время макет сортировки можно отредактировать, щелкнув поле « Местоположение сортировки», в котором содержится население. 0,9% ± 0,3 RGCs с фенотипом CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg получены из молодых (5-7 недель) и 0,5% ± 0,3 и старых (> 12 месяцев) мышей C57BL / 6J 23 .
  9. Используя 25 000 ячеек, выполните проверку чистоты 23 . См. Рисунок 3B -E.
    Примечание. Проверка чистоты - это процесс повторного анализа отсортированных ячеек для проверки точности сортировки ячеек. Небольшая аликвота отсортированных клеток будет загружена на цитометр, чтобы проверить эффективность сортировки.
_title "> 6. Подтверждение для внутриклеточных маркеров RGC

  1. Внутриклеточная маркировка.
    1. Исправить сортированные клетки в течение 1 часа и пермеабилизировать при 4 ° C, чтобы сделать клетки метаболически неактивными и позволить проникновение внутриклеточных антител.
    2. Разбавить следующие антитела в пермеабилизационном растворе: анти-РНК-связывающий белок с множественным сращиванием (RBPMS) при разведении 1: 100 в 100 мкг / мл запаса; Анти-синуклеина гамма (SNCG), 1: 100 в 1 мг / мл запаса; Мозговой специфический гомеобокс / POU доменный белок 3A (BRN3A), 1: 100 в 200 мкг / мл запаса; И анти-нейрон-специфический бета-тубулин класса III (TUJ1), 1: 100 в 1 мг / мл. Инкубируйте клетки и растворы антител в течение 1 часа в покрытом ведро для льда.
    3. Промойте образцы дважды PBS / 1% FBS.
    4. Ресуспендируют клетки в соответствующем AF488-меченых вторичных антителах при разведении 1: 200 в течение 30 мин в ведерко для льда.
    5. Вымойте образцы, как на этапе 6.1.3. Храните ячейки вPBS / 1% FBS (250 мкл) до готовности к анализу.

7. Проверка сортировки ячейки методом qPCR

Примечание. См. Рисунок 4 .

  1. Извлечение РНК 23 .
    1. Извлеките РНК из 5,0 × 10 5 отсортированных клеток путем лизиса клеток и гомогенизации с последующим добавлением хлороформа.
    2. Перенесите верхнюю бесцветную фазу на чистую микротрубу для осаждения алкоголя с последующей концентрацией экстракта в спиновой колонке. Выполните ДНК-расщепление на колонке.
    3. Промыть колонку водой без РНКазы для элюирования РНК.
    4. Оценить концентрацию РНК с помощью спектрофотометрии.
  2. Синтез кДНК и предварительное усиление.
    1. Использовать 100 нг материала РНК и смешивать с раствором, содержащим фермент обратной транскриптазы, ингибитором рекомбинантной рибонуклеазы (во избежание разложения РНК), хлоридом магния (MgCЛ 2 ) и дезоксинуклеотиды.
    2. Смешайте содержимое трубки и инкубируйте в течение 10 мин при 25 ° С, затем 60 мин при 42 ° С. Реакционную смесь завершают 5-минутной инкубацией при 85 ° С. Храните полученную кДНК при -20 ° C до готовности к использованию.
      Примечание: материал кДНК можно хранить при -20 ° C в течение месяца, если шаг предварительной амплификации не может быть выполнен немедленно.
  3. Предварительная амплификация кДНК.
    1. Предварительно амплифицировать материал кДНК с использованием серии праймеров, специфичных для нескольких типов клеток сетчатки, включая: ганглиозные клетки сетчатки, амакриновые клетки, астроциты, мюллеры, биполярные, горизонтальные, фоторецепторы и эпителиальные клетки сетчатки сетчатки, как подробно описано в ссылке 23 и в таблице Материалов .
      Примечание. Реакцию предварительного амплификации готовят для повышения чувствительности обнаружения для количественной оценки. Реакция предварительного амплификации содержит смесь праймераСмеси из таблицы материалов ; 2,5 мкл кДНК, которая начиналась с 100 нг РНК; Фермент обратной транскриптазы; И свободной от нуклеазы воды в конечном объеме 10 мкл.
    2. Проведите стадию активации фермента при 95 ° C в течение 10 минут, затем 14 циклов при 95 ° C в течение 15 с, затем 60 ° C в течение 4 минут. Разбавьте предварительно амплифицированный материал 1:10 в буфере Tris EDTA и держите его при -20 ° C до готовности к использованию.
  4. 7.4. Реакция qPCR.
    1. Подготовьте все реакции qPCR в конечном объеме 10 мкл, используя разбавленную предварительно амплифицированную кДНК (2,5 мкл), праймеры (перечисленные в таблице материалов ), воду без нуклеазы и концентрат с ДНК-полимеразой и дезоксинуклеотидами.
    2. Используйте следующие условия прибора для запуска qPCR: шаг фиксации 50 ° C в течение 2 минут, затем 95 ° C в течение 10 минут. Проведите в общей сложности 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с, затем 60 ° С в течение 1 мин. Выполнять все измеренияВ репликах трех.
    3. Выполните относительную количественную оценку с использованием сравнительного порога (C T ) после определения значений C T для домашнего хозяйства и генов-мишеней в каждом образце. Вычислите относительное изменение складки (R q ), используя следующее уравнение: R q = 2 T -ΔC , где ΔC T = C T -цепочечный ген - C-контрольный ген 23 .
      Примечание: C T определяется как цикл ПЦР, при котором флуоресцентный сигнал репортерного красителя пересекает произвольно установленный порог 26 . C T обратно зависит от количества ампликона (продукта ПЦР) в реакции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Глубокое исследование RGCs затруднено многими факторами, в том числе их низкой частотой и отсутствием надежной и стандартизованной методологии их изоляции. На рисунке 1 показана методология, используемая для изоляции сетчатки. Вариации в процедуре энуклеации существуют на основе типа анализа, например, если энуклеация является частью экспериментов in vivo 27 . Энуклеация в этом протоколе выполняется на эвтаназированных ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

FACS - это метод выбора для очистки популяций клеток. Другие способы изоляции включают в себя иммунодепрессанты, магнитные гранулы и истощение фиксации комплемента. Преимущество FACS над этими другими методологиями основано на одновременной идентификации маркеров клеточной поверхности с различной степенью интенсивности. Интенсивность флуоресценции молекулы пропорциональна количеству экспрессии белка. До сих пор изоляция RGC была основана исключительно на позитивности Thy1 (CD90) и отрицательности CD48 ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить г-на Тима Хиггинса, старшего иллюстратора из отдела микробиологии, иммунологии и биохимии, за техническую поддержку видео; Д-р Мэтью Уилсон для обсуждения и членов лабораторий Jablonski и Morales-Tirado за их полезные комментарии. Эта работа была поддержана Институтом молодых исследователей Института Алькона (VMM-T), Исследовательским фондом Университета Теннесси (VMM-T), Национальным институтом глаз EY021200 (MMJ), Стипендией Гервина (VMM-T); (ZKG), Министерство обороны США по военным исследованиям и командованию армии (VMM-T) и Неограниченный грант от исследования, чтобы предотвратить слепоту.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антимышь CD15 PEBioLegend125606Клон MC-480
Антимышь CD48 PE-Cy7BioLegend103424Клон HM48-1
Антимышь CD57Sigma AldrichC6680-100TSTКлон VC1.1
Антимышь CD90.2 AF700BioLegend105320Клон 30-H12
Бриллиантовый фиолетовый 421 Козий антимышь IgGBioLegend405317Клон Poly4053
Очищенный антимышиный CD16/32BioLegend101302блок FcgRII/III, клон 93
Zombie Aqua BioLegend423102Дискриминация живых клеток/мертвых клеток
Фетальная бычья сывороткаHycloneSH30071.03Происхождение из США
AbC Total Антитела Компенсационный набор бусинThermo Fisher ScientificA10497Многовидовой Ig
Нейробазальный среднийThermo Fisher Scientific21103049Добавьте сыворотку в среду перед посевом.
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Физиологический раствор
Рассекционный микроскопOlympusSZ-PT МодельСтереомикроскоп
Сорвалл ЦентрифугаThermo ScientificST 16RВсе центрифугирование выполнено  на
опорной плите RT – Поддон для пресеченияFisher ScientificSB15233FIMТакже можно использовать восковую пластину
ЩипцыAesculap5002-74 ½ дюймы
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ дюймы
Falcon 15 мл конические трубкиFisher Scientific352097Полипропиленовые трубки
Falcon 50 мл конические трубкиFisher Scientific352098Полипропиленовые трубки
BD FACSТрубки Fisher Scientific352003Полипропиленовые трубки
40 мм тарелкиMidSciTP93040Культура тканей обработанная
70 мкм; m нейлоновое ситечкоMidSci70ICSстерильное
40 μ m нейлоновое ситечкоMidSci40ICSстерильное
  BD 10 мл шприцFisher Scientific301604одноразовый шприц без иглы
PestlesMidSciPESTстерильный
флакон Wheaton FisherScientific986734без вкладыша
BD 30 г иглаFisher Scientific3051281 дюйм
Hausser Scientific Bright-Line стеклянная счетная камераFisher Scientific0267151BГемоцитометр
Gibco Trypan синий 0,4% растворFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251,5 мл
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113флуоресцентная визуализация с 20-кратным объективом
100% этанолFisher Scientific04-355-452Используется для производства 70% этанола
Пипетка Pipet-Lite LTS L-1000XLS+Rainin17014282Пипетка LTS
Пипетка Pipet-Lite LTS Пипетка L-200XLS+Rainin17014391Пипетка
LTS Pipet-Lite Пипетка L-20XLS+пипетокRainin17014392
LTS LTS 1000 мл – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Стерильные наконечники
LTS 250 мл – GPS-L250SRainin17005092Green Rack Стерильные наконечники
LTS 20 мл – GPS-L10SRainin17005090Красная стойка Стерильные наконечники
FACSAria II Сортировщик клетокBD BiosciencesН/ДЦитометр
LSR II Н/ДНестандартный заказ Индивидуальный заказ
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Mü ller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Mü ller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retina Pigment Epitelial Cells
Gad2Thermo Fisher НаучныйMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1ThermoFisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1фоторецепторы
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1горизонтальные
pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1биполярное, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1ганглиозные клетки
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retina Ganglias Cells
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Фоторецепторы
rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Retinal Pigment Epitelialal Cells
Slc1a3Thermo Fisher НаучныеMm00600697_m1Астроциты
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1ганглиозные клетки сетчатки
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Gangliance Cells
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Mü ller cells
Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047qPCR Реагент
miRNeasy Mini KitQiagen217004Выделение РНК
SuperScript VILO Набор для синтеза кДНКThermo Fisher Scientific11754250синтез кДНК
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128этап предварительной амплификации
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Фиксация/ Буфер для пермеабилизации
BD Perm/ WashBD Biosciences554723раствор для пермеабилизации
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815внутриклеточное антитело
SNCGGene TexGTX110483внутриклеточное антитело
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429внутриклеточное антитело
TUJ1BioLegend801202внутриклеточное антитело
Штатив для сетчатки

Ссылки

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936(2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62(2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99(2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Изоляция клетокпервичные клетки мышисортировка клетокиммуномаркировкаCD90.2-положительныеCD48-отрицательныеконтроли компенсациижизнеспособная популяция клеток
Выделение первичных клеток сетчатки сетчатки (RGCs) проточной цитометрией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.