Методическая статья

Микрокристаллизация кристаллов белков и

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55793

⸱

21 июля 2017 г.

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Протокол представлен для рентгеновской кристаллографии с использованием микрокристаллов белка. Сравниваются два примера, анализирующие in vivo- выращенные микрокристаллы после очистки или в целлюлозе .

Аннотация

Появление высококачественных линий микрофокусировки на многих синхротронных объектах позволило провести обычный анализ кристаллов размером менее 10 мкм в их наибольшем измерении, который использовался для представления проблемы. Мы представляем два альтернативных рабочих процесса для определения структуры микрокристаллов белка с помощью рентгеновской кристаллографии с особым упором на кристаллы, выращенные in vivo . Микрокристаллы либо экстрагируют из клеток обработкой ультразвуком, либо очищают путем дифференциального центрифугирования, либо анализируют в целлюлозе после сортировки клеток с помощью проточной цитометрии кристаллосодержащих клеток. Необязательно, очищенные кристаллы или кристаллосодержащие клетки пропитываются в растворах тяжелых атомов для экспериментальной фазировки. Эти образцы затем подготавливают для дифракционных экспериментов аналогичным образом путем нанесения на подложку с микрометом и мгновенного охлаждения в жидком азоте. Кратко описываем и сравниваем серийные дифракционные эксперименты изолированных микрокристаллов и кристалло-Содержащих микрофокусную синхротронную лучевую линию для создания наборов данных, подходящих для фазирования, построения моделей и их доработки.

Эти рабочие процессы иллюстрируются кристаллами полиэдрина Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1), полученным путем заражения клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом. В этом случае исследование в целлюлозном анализе более эффективно, чем анализ очищенных кристаллов, и дает структуру через ~ 8 дней от экспрессии до измельчения.

Введение

Использование рентгеновской кристаллографии для определения структур с высоким разрешением биологических макромолекул наблюдалось устойчивое прогрессирование в течение последних двух десятилетий. Растущее поглощение рентгеновской кристаллографии неспециалистскими исследователями иллюстрирует демократизацию этого подхода во многих областях наук о жизни 1 .

Исторически кристаллы с размерами менее ~ 10 мкм считались сложными, если не непригодными для определения структуры. Растущая доступность выделенных микрофокусных лучей для источников синхротронного излучения во всем мире и технологических достижений, таких как разработка инструментов для управления микрокристаллами, устранила большую часть этих барьеров, что затихло широким использованием рентгеновской микрокристаллической системы. Достижения в серийной рентгеновской микрокристаллографии 2 , 3 и дифракции микроэлектронов 4 гаПоказали, что использование микро- и нанокристаллов для определения структуры не только осуществимо, но и иногда предпочтительнее использования крупных кристаллов 5 , 6 , 7 .

Эти достижения были впервые применены к изучению пептидов 8 и природных кристаллов, продуцируемых вирусами насекомых 9 , 10 . Они теперь используются для широкого круга биологических макромолекул, включая самые сложные системы, такие как мембранные белки и большие комплексы 11 . Чтобы облегчить анализ этих микрокристаллов, они были проанализированы в мезо , в частности мембранных белках 12 и микрочипах микрожидкостей 13 .

Наличие этих новых методологий микрокристаллизации повысило возможность использования вVivo как новый путь для структурной биологии 14 , 15 , 16, предлагающий альтернативу классическому кристаллогенезу in vitro . К сожалению, даже когда кристаллы in vivo могут быть получены, остается несколько препятствий, таких как деградация или потеря лигандов во время очистки от клеток, трудности в манипулировании и визуализации кристаллов на синхротронной пучке и утомительные эксперименты по дифракции рентгеновских лучей. В качестве альтернативных кристаллов также анализировали непосредственно внутри клетки без какой-либо стадии очистки 17 , 18 , 19 . Сравнительный анализ показывает, что такие в подходах целлюлозы могут быть более эффективными, чем анализ очищенных кристаллов и получение данных с более высоким разрешением 20 .

Этот протокол находится вКак правило, помогали исследователям, новым для микрокристаллизации белка. Он предоставляет методологии, ориентированные на подготовку проб и манипулирование экспериментами рентгеновской дифракции на синхротронной пучке. Предлагаются два варианта использования изолированных кристаллов для классической микрокристаллической или кристаллически-содержащих клеток, отсортированных по проточной цитометрии для целлюлитного анализа ( рис. 1 ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание. Кристаллизация in vivo наблюдается во многих организмах, в том числе в бактериях, дрожжах, растениях, насекомых и млекопитающих (см. Ссылку 21 ). Кристаллизация рекомбинантных белков также была достигнута в лаборатории с использованием переходной трансфекции клеток млекопитающих и бакуловирусной инфекции клеток насекомых. Следующий протокол был разработан с использованием гена полиэдрина Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1), клонированного в рекомбинантном бакуловирусе под промотором полиэдрина бакуловируса, сгенерированного в соответствии с инструкциями в ссылке 22 . Таким образом, хотя этот протокол может быть адаптирован к другим типам клеток ( например, к клеткам млекопитающих), мы здесь описываем процедуры для клеток насекомых. Протокол предполагает, что избыточная экспрессия представляющего интерес белка уже достигнута. Способы получения рекомбинантного бакуловируса и его использование для экспрессии интересующего белка представляют собой avВозможно, в ссылках 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. Идентификация хрустально-содержащих клеток

  1. Если клетки выращивают в монослое, немедленно проверяйте их в колбе. Если клетки выращивают в жидкой культуре, используйте следующий протокол.
    1. Используя стерильную серологическую пипетку, переносите 500 мкл клеток в микроцентрифужную пробирку. Позаботьтесь о том, чтобы сохранить стерильность основной культуры; Обрабатывать ячейки в шкафу биобезопасности класса II и следовать стандартным асептическим методам.
    2. Нанесите 5 мкл клеток из микроцентрифужной трубки на стеклянный предмет.
    3. Осторожно поместите покровное стекло на жидкость, избегая образования пузырьков воздуха. Если слайд не может быть визуализирован в течение 15 минут, закройте покровное стекло вакуумной смазкой, чтобы избежать испаренияция.
  2. Image Образьте колбу или поместите с инвертированным микроскопом. Если доступно, используйте фазовую контрастность и / или дифференциальную контрастную микроскопию (DIC). Оба метода усиливают контрастность в прозрачных образцах и подчеркивают линии и края, что облегчает идентификацию кристаллов in vivo .
  3. Тщательно исследуйте клетки. Начните с увеличения 200X и увеличьте при максимальном увеличении при обнаружении потенциального кристалла. Присутствие кристаллов может быть косвенно предложено изменениями в морфологии клеток ( рис. 2 ). Ищите острые края и изменения рефрактерности (при использовании фазового контраста или DIC). Известные кристаллы in vivo принимают различные формы, включая стержни, стопки игл, кубов, пирамид и многогранников (см. Рис. 2 и таблицу 1 для некоторых примеров).
    Примечание. Доля клеток, содержащих кристаллы, будет различной в каждом случае и может накапливатьсяN варьируются между препаратами, но, как правило, не следует ожидать наличия кристаллов во всех клетках. Аналогично, количество кристаллов на ячейку также является переменной (см. Таблицу 1 ), и в одной ячейке может быть найдено более одного кристалла. Эти факторы необходимо оптимизировать, где это возможно, путем корректировки множественности инфекции, изменения длины экспрессии и изменения белковой конструкции. С одной стороны, условия экспрессии белка и роста клеток, которые максимизируют количество кристаллосодержащих клеток, повысят продуктивность ( например, более высокую множественность инфекции и позднюю сборку клеточной культуры). С другой стороны, условия, при которых клетки содержат монокристалл, способствуют сбору данных ( например, низкая множественность инфекции). Учитывая обогащение, вызванное сортировкой потока, описанную на этапе 2.2, мы рекомендуем прицеливаться в более крупные кристаллы ( например, монокристалл на ячейку), даже если доля кристаллосодержащих клеток низкая.
  4. Если кристаллИдентифицируются, записывают свое положение (при образовании монослоя в колбе) и оценивают процент кристаллосодержащих клеток. Если возможно, используйте микроскоп, оборудованный камерой, способной отслеживать изменения на одном уровне ячейки.
  5. Для клеток в суспензии определите степень жизнеспособности клеток по протоколу, указанному в ссылке 28 . Для клеток, культивируемых в монослое, оценивают путем визуального осмотра приблизительную степень слияния и количество отдельных клеток.
  6. Контролируйте рост кристаллов, рост клеток и жизнеспособность два раза в день.
  7. Убирайте клетки, как только кристаллический рост прекратится. Для замечательно прочных кристаллов, таких как вирусные полиэдры, увеличенные времена инкубации (> 4 дня) увеличивают количество крупных кристаллов. Однако для типичных белковых кристаллов мы рекомендуем собирать клетки, когда жизнеспособность падает ниже 80%, чтобы предотвратить повреждение, вызванное лизисами клеток.
  8. Удалите колбу из инкубатора и перейдите кШаг 2.2 как можно скорее. Храните клетки на льду в течение следующих шагов, если не указано иное.

2. Очистка образцов

Примечание. Мы описываем два метода анализа кристаллов in vivo из очищенных кристаллов и целлюли соответственно.

  1. Очистка кристаллов
    Примечание. Если нет доказательств того, что интересующие кристаллы чувствительны к низкой температуре, работают на льду и используют ледяные буферы, чтобы избежать разрушения кристалла.
    1. Пипетируют 50 мл инфицированных клеток Sf9 в 50 мл конической центрифужной пробирке. Это представляет собой ~ 4 × 10 8 клеток в типичном эксперименте.
    2. Клетки гранул при 450 × g в течение 10 мин при 4 ° C.
    3. Удалите супернатант и ресуспендируйте гранулу в 40 мл охлажденного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), pH 7,4.
      Примечание: PBS предлагается в качестве отправной точки для очистки в качестве стандартного изотонического буфера с целью мимическогоВ результате чего клеточная среда, где растут кристаллы in vivo. Он использовался для большинства кристаллов in vivo, выращенных в клеточной культуре до 9 , 14 , 29 . Альтернативно, DMEM-среда также успешно использовалась при очистке кристаллов in vivo из клеток млекопитающих 19 . Если кристаллы заметно страдают от их переноса в PBS или имеют плохую дифракцию, этот параметр следует исследовать как потенциальный источник деградации.
    4. Осадить ресуспендированный гранулят в течение 30 с при 10 мА с помощью ультразвукового аппарата с 19-миллиметровым зондом. Чтобы избежать нагревания образца, поместите его в стакан, заполненный льдом, во время сеанса. Химическое или механическое разрушение клеток может быть использовано в качестве альтернативы, если кристаллы, по-видимому, повреждены ультразвуком, как оценивается на этапе 2.1.7.
    5. Центрифугируют при 450 × g в течение 10 мин при 4 ° C. После центрифугирования кажутся 2 слоя:Верхний слой клеточного мусора, который бледно-коричневый, и более низкий осадок кристаллов полиэдрина, который является белым и меловым.
    6. Удалите супернатант и удалите верхний слой осторожной пипетировкой. Повторно добавьте нижний осадок в 40 мл охлажденного PBS.
    7. Оцените качество образцов путем визуализации с помощью светового микроскопа.
      1. Нанесите 5 мкл клеток или очищенные кристаллы на стеклянный предмет. Это можно сделать при комнатной температуре.
      2. Осторожно поместите покровное стекло на жидкость, избегая образования пузырьков воздуха.
      3. Изображение слайда с инвертированным микроскопом с увеличением 200X. Image Образец образца в течение 15 минут его подготовки на слайде. Если слайд не может быть визуализирован в течение 15 минут, запечатайте покровное стекло вакуумной смазкой, чтобы избежать испарения.
        ПРИМЕЧАНИЕ. В случае полиэдров кристаллы появятся в виде тонкодисперсных кубов размером ~ 1-10 мкм на сторону. Проверьте целостность кристаллов в поисках признаков потери резкости( Например, круглые края), трещины или растворение. Также следить за наличием клеточного мусора, который будет отображаться как скопления и объекты неправильного размера и формы.
    8. Повторите шаги с 2.1.5 до 2.1.7, уменьшив вдвое объем PBS, используемый для ресуспендирования гранулы в каждом цикле до тех пор, пока кристаллы не станут свободными от мусора. Ресуспендируют окончательный осадок в 1 мл охлажденного PBS и переносят кристаллы в микроцентрифужную пробирку. Хранить очищенные кристаллы при 4 ° C.
    9. Оцените концентрацию кристаллов, используя гемоцитометр, как описано изготовителем. Считайте кристаллы, как будто подсчитывая клетки.

figure-protocol-1
Рисунок 3 : Очищенные микрокристаллы in vivo. Типичная очистка кристаллов полиэдрина BmCPV1 от клеток насекомых Sf9, показывающая ( а ) осколки гранулированных клеток и крик(А), а также ( б ) крупным планом на обломках и слоях кристаллов. Слои можно легко ресуспендировать в супернатанте и отбрасывать для более быстрой кристаллизации. ( C ) Изображение оптической микроскопии очищенных полиэдров. Шкала шкалы = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Выделение кристаллосодержащих клеток методом проточной цитометрии
    Примечание. Чтобы облегчить определение ворот в проточной цитометрии, рекомендуется выращивать контрольную культуру параллельно с той, которая выражает интересующий белок. Это может быть сделано путем заражения колбы клеток Sf9 нерегулярным рекомбинантным бакуловирусом или путем приготовления мак-инфицированных клеток. Сортировку и визуализацию образцов обычно проводят при комнатной температуре.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: иодид пропидия является подозреваемым канцерогеном и должен быть обработанс осторожностью.
    1. Пипетируют 4 мл инфицированных клеток Sf9, представляющих ~ 3 × 10 7 клеток, в трубке, адаптированной к анализу проточной цитометрии. Также подготовьте вторую трубку с эквивалентным количеством клеток Sf9, инфицированных не рекомбинантным бакуловирусом.
    2. Добавьте иодид пропидия (PI) в оба образца с конечной концентрацией 1 мкг / мл непосредственно перед проточной цитометрической оценкой. Этот шаг необходим для идентификации мертвых клеток, клеточных глыб и мусора, которые могут изменять или маскировать распределение клеток на участке прямого и поперечного рассеяния. Подготовьте запасы ПИ 1 мг / мл в воде и храните при температуре 4 ° C, защищенной от света.
    3. Применяют клетки к стандартному проточному цитометру, способному сортировать клетки по прямому (FSC) и боковому рассеянию (SSC). Проанализируйте не менее 20 000 событий контрольного ( т.е. некристаллического) образца. После отбрасывания мертвых клеток, клеточных глыб и мусора из анализа, сгенерируйте FSC на график SSC.
    4. Проанализируйте как минимум 20 000Ts кристаллического образца. Сравните FSC с графиком SSC с макетным. Посмотрите на появление отдельной популяции, соответствующей кристаллосодержащим клеткам. Как правило, клетки с внутриклеточными кристаллами будут иметь более высокий SSC из-за увеличения морфологической сложности. FSC может также увеличиваться, если рост кристаллов вызывает увеличение объема клетки. Определите ворота сортировщика потока, чтобы изолировать популяции клеток, соответствующие участкам участка рассеяния, которые отличаются от макетного графика. Изобразите отсортированные образцы с помощью световой микроскопии, как описано в шаге 1, чтобы подтвердить, какая популяция связана с кристаллосодержащими клетками.
    5. Используя ворота, определенные на этапе 2.2.4, сортируйте кристаллосодержащие клетки в PBS или в любом другом изотоническом буфере. Запишите количество отсортированных кристаллов клеток, а также конечный объем, чтобы облегчить последующие шаги. Храните сортированные ячейки на льду или при 4 ° C.
      Примечание: через час> 300 000 полиэдровКоторые сортируются на сортировщике клеток со 100-миллиметровым соплом (138 кПа с частотой 39 кГц). Этого количества клеток достаточно, чтобы подготовить> 1000 меш.
    6. Следуя протоколу, подробно описанному на шаге 2.1.7, изобразите ячейки с помощью светового микроскопа для подтверждения обогащения в кристаллосодержащих клетках. Подготовка проб для сбора данных должна проводиться как можно скорее после сортировки клеток, поскольку кристаллы могут со временем ухудшаться или высвобождаться из-за клеточного лизиса.

figure-protocol-2
Рисунок 4 : Сортировка ячеек. Репрезентативная проточная цитометрия разбрасывает графики из ( а ) неинфицированных клеток (макет), которые не содержат кристаллов, и ( б ) клетки Sf9, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующимся для полиэдрина BmCPV1. Различия в структуре рассеяния между двумя популяциями al(Красные ворота, высокие значения SSC). Каждый сюжет представляет 20 000 событий сортировки. SSC: боковое рассеяние света; FSC: рассеяние вперед света. ( C ) Изображение оптической микроскопии репрезентативной популяции отсортированных клеток, показывающее наличие внутриклеточных кристаллов. Масштаб = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Подготовка проб для сбора данных

Примечание. Если клетки или кристаллы должны быть дериватизированы для экспериментальной фазировки, следуйте протоколу, подробно описанному в разделе 3.1. В противном случае перейдите непосредственно к разделам 3.2 для очищенных кристаллов или 3.3 для целлюлитного анализа.

  1. Дериватизация очищенных или в микрокристаллах целлюлозы
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Перед использованием ознакомьтесь со всеми листами данных о безопасности материалов (MSDS).Большинство химических веществ, используемых для экспериментальной фазировки, являются очень токсичными. Используйте все надлежащие меры безопасности, включая использование химического вытяжного шкафа и средств индивидуальной защиты. Утилизируйте отходы в соответствии с политикой вашего учреждения.
    Примечание. Характер тяжелых атомов, их концентрация и время инкубации приведены на ориентировочной основе для кристаллов многогранника BmCPV1. Эти параметры должны определяться экспериментально для каждой новой цели. Последующее окрашивание трипановым синим на этапе 3.3.2 можно опустить, если клетки легко окрашиваются химическим соединением, используемым для фазировки.
    1. Подготовьте насыщенные растворы желаемых тяжелых атомов (или растворов других химических веществ, используемых для экспериментальной фазировки). Обычно для каждого тяжелого атома требуется объем меньше 100 мкл. Удалите нерастворенные соли и мусор центрифугированием с максимальной скоростью в микроцентрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Подготовьте аликвоты ~ 50 000 кристалловИли отсортированные клетки на соединение тяжелых атомов. Если PBS не совместим с химическим веществом, используемым для дериватизации ( например, формы осадка и раствор становится мутным), осаждают кристаллы при 4000 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре в микроцентрифуге или клетки при 150 × g в течение 3 мин, удаляют Супернатант и осторожно ресуспендируют кристаллы или клетки в 20 мкл подходящего буфера. Повторите гранулирование и ресуспензию, чтобы не осталось следов PBS. Отрегулируйте конечный объем до 20 мкл для всех аликвот.
    3. Добавьте 20 мкл раствора тяжелых атомов или другого химического соединения, выбранного из кристаллов или клеток. Оптимальная концентрация тяжелого атома будет зависеть от комбинации параметров соты (проницаемости, белков вне мишени ...) и природы кристалла интересующего белка. В качестве отправной точки испытайте 3 разных концентрации: полное насыщение, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. Храните образцы при температуре 4 ° C в течение 3 дней. Кристаллы полиЭдрин очень устойчивы и плотны и требуют длительного впитывания для включения тяжелых атомов; Для других типов кристаллов инкубационный период и концентрация тяжелых атомов должны определяться экспериментально. Слишком короткое время инкубации не позволит включить правильное количество тяжелого атома, в то время как длительное время инкубации может повлиять на целостность кристаллов, что снижает их дифракционное качество или даже растворяет их. В качестве отправной точки попробуйте 3 разных времени инкубации для каждого раствора тяжелых атомов ( например, 1 мин, 1 ч и в течение ночи). Успешную дериватизацию оценивают путем анализа данных дифракции, как это кратко описано в разделе 5, и ссылки в ней.
    5. Вымыть избыток раствора тяжелых атомов путем гранулирования кристаллов при 4000 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре в микроцентрифуге или клеток при 150 × g в течение 3 мин, удаления супернатанта и мягкого повторного суспендирования кристаллов или клеток в 10 мкл буфера ,
  2. Приготовление подложки микромеха с очищенными микрокристаллами
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Использование жидкого азота связано с опасностями, такими как удушье, холодные ожоги, огонь в атмосфере, обогащенной кислородом, и взрыв. Проконсультируйтесь с руководством по управлению рисками и безопасностью вашей организации.
    1. На основе концентрации кристаллов, вычисленной на этапе 2.1.9, отрегулируйте концентрацию до 10 7 кристаллов / мл путем разбавления образца; Или путем гранулирования кристаллов при 4000 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре в микроцентрифуге, регулировании конечного объема путем удаления надосадочной жидкости и осторожно ресуспендирования кристаллов.
    2. Если образцы предназначены для предварительной заморозки, охладите сухой грузоотправитель или дьюар с помощью жидкого азота. Приготовьте флаконы или шайбы, если это необходимо, и охладите их жидким азотом.
    3. Ресуспендируют кристаллическую таблетку и наносят 0,5 мкл капли кристаллов на микромер путем пипетирования. Используйте сетки 700 мкм с квадратом 25 мкмВ качестве отправной точки. Площадь сетки не является критичной, но большая площадь обеспечивает больше кристаллов на меш и приводит к более медленному испарению во время подготовки. Может потребоваться оптимизация размеров отверстий в соответствии с размером кристаллов размером более 25 мкм. При необходимости для систематических исследований доступны индексированные сетки для облегчения методического сканирования сетки во время сбора данных.
    4. Удалите большую часть избыточной жидкости, промокая бумажным фитилем. Кристаллы должны быть равномерно распределены по сетке, не касаясь друг друга. Повторите шаг 3.1.1. Для оптимизации концентрации образца. Действуйте быстро и не удаляйте слишком много жидкости. В отсутствие криопротекторов жидкость быстро испаряется с риском образования кристаллов соли и / или потери пленки.
    5. Добавить криопротектор: пипеткой 0,5 мкл раствора 50% этиленгликоля в воде на сетку (состав криобуфера должен быть адаптирован к образцу, предложения по оптимизации сRyoprotectant можно найти в ссылке 30 ). Удалите лишнюю жидкость, промокая бумажным фитилем. В отличие от предыдущего шага, здесь оставшаяся пленка растворителя должна быть настолько тонкой, насколько это возможно, чтобы уменьшить эффекты параллакса, которые усложняют процесс выравнивания между кристаллом, траекторией луча и гониометром; И минимизировать фон, вызванный рассеянием рентгеновских лучей на жидкости в пути пучка.
    6. Немедленно промойте микромер в жидком азоте и перенесите на шайбу или шайбу робота, затем на сухой грузоотправитель или дьюар для хранения.
  3. Получение микромеха с кристаллосодержащими клетками
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Использование жидкого азота связано с опасностями, такими как удушье, холодные ожоги, огонь в атмосфере, обогащенной кислородом, и взрыв. Проконсультируйтесь с руководством по управлению рисками и безопасностью вашей организации.
    1. Перенесите сортированные клетки в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. На основе ячейки cУнций, зарегистрированных сортировщиком клеток, регулируют концентрацию до 10 7 клеток / мл путем разбавления образца PBS; Или путем гранулирования клеток при 150 × g в течение 3 мин при комнатной температуре в микроцентрифуге, регулировании конечного объема путем удаления надосадочной жидкости и осторожно ресуспендирования клеток.
    2. Смешайте клетки с равным объемом раствора трипанового синего (0,4% мас. / Об.) До конечной концентрации 0,2% мас. / Об.
    3. Если образцы предназначены для заморозки заранее, охладите сухого грузоотправителя или обезвоживают жидким азотом. При необходимости подготовьте флаконы или шайбы, а также охладите их жидким азотом.
    4. Аккуратно ресуспендируйте клетки и пипетируйте 0,5 мкл сортированных клеток на микромер.
    5. Удалите лишнюю жидкость, промокая бумажным фитилем. Ячейки должны быть равномерно распределены по сетке, не касаясь друг друга. Если не использовать криопротектор (шаг 3.3.6), оставшаяся пленка растворителя должна быть настолько тонкой, насколько это возможно, чтобы уменьшить эффект параллакса, который затрудняетE процесс выравнивания между кристаллом, траекторией пучка и гониометром; И минимизировать фон, вызванный рассеянием рентгеновских лучей на жидкости в пути пучка.
    6. По желанию добавить криопротектор в клетки: пипеткой 0,5 мкл 50% этиленгликоля, 50% раствора PBS на сетку. Состав криобуфера должен быть адаптирован к образцу; Предложения по оптимизации криопротектора можно найти в ссылке 30 . Удалите избыток жидкости, промокайте бумажным фитилем, оставив только тонкую пленку растворителя.
      Примечание. Отсутствие стадии криозащиты не изменяло качество дифракции рентгеновских лучей при анализе кристаллов полиэдрина в целлюлозе , в то время как эта стадия требовалась для очищенных кристаллов 20 . Это относится только к инкубации клеток с помощью криопротекторного раствора; Образец должен по-прежнему анализироваться при 100 К, чтобы минимизировать влияние радиационного повреждения на кристаллы.
    7. ImmediПолностью охладить микромер в жидком азоте и перенести на флакон или шайбу робота, затем на сухой грузоотправитель или хранилище, в случае необходимости.

4. Сбор данных

Примечание. Параметры, используемые для сбора данных, приведены в качестве руководства и должны быть оптимизированы для каждого типа кристалла и синхротронного пучка.

  1. Соберите данные по линии микрофокусной кристаллографии (см. Ссылку 7 для списка линий микрофокусировки и их характеристик). Если возможно, используйте коллимированный луч, соответствующий размерам кристаллов.
  2. Для экспериментальной фазировки методом одноволновой аномальной дисперсии (SAD) собираются при энергии, максимизирующей аномальный сигнал выбранного тяжелого атома. Для фазинга с использованием метода множественной изоморфной замены (MIR), собирайте выше энергии подходящего края поглощения для выбранного тяжелого атома (см. Http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. После загрузки сетки на гониометр начните с центрирования микромеха с пучком лучей с помощью лицевой (выпуклой стороны) и боковых ориентаций. Затем, с микромешем лицом, установите тонкую настройку выравнивания, выровняв центр определенной горизонтальной полосы микромеша (например, начните с центральной). Затем собирайте данные по этой горизонтальной полосе с незначительными корректировками выравнивания. Если возможно, используйте центрирование на основе растерирования при дифракции рентгеновских лучей с низкой дозой для точной настройки выравнивания (обратитесь к местному контакту на синхротронной диаграмме направленности).
    Примечание. Поскольку ограниченный объем данных может быть собран на микрокристаллах из-за радиационного повреждения (как правило, от 10 до 30 изображений с 1 ° колебанием), теоретически кристалл должен быть выровнен только с траекторией луча на 10-30 °. Тем не менее, очень важно, чтобы выравнивание было точным, так как кристалл может легко пропустить микробой (обычно коллимированный до диаметраEr ~ 10 мкм или меньше).
  4. Собирайте данные дифракции до тех пор, пока дифракция не будет потеряна из-за радиационного повреждения. Для кристаллов полиэдрина время экспозиции 10 с обычно используется для 1 ° колебаний для потока приблизительно 3,6 × 10 11 фотонов / с при 13 кэВ с ПЗС-детектором (общая доза <30 MGy). Оптимизируйте эти настройки в зависимости от пучка и природы используемого кристалла. В частности, для рентгеновских детекторов пикселов рекомендуется использовать низкие дозы и тонкую нарезку.
    Примечание. При использовании стратегии cellulo ячейки, окрашенные трипановым синим цветом, будут отображаться как синие точки на фоне поддержки, что упрощает их согласование с лучом. Если коллимированный микробой имеет примерно тот же размер, что и ячейки (~ 10 мкм), все кристаллы, содержащиеся в ячейке, будут подсвечиваться одновременно. Для клеток, содержащих множественные микрокристаллы, это приводит к наблюдению за множественными дифракционными картинами, которые трудно обрабатывать. Однако diFfraction от одного из кристаллов часто имеет тенденцию доминировать над дифракционной картиной и предпочтительно индексируется во время обработки данных. Для линий пучка с лучом рентгеновского излучения значительно меньше, чем ячейка, растрирование при очень низком рентгеновском потоке (> 95% затухание) следует использовать для центрирования на монокристалле до сбора данных.
  5. Перейдите к следующему кристаллу в переулке.
  6. Как только все кристаллы полосы пройдены, перейдите к следующей полосе и повторите процедуру выравнивания. Продолжайте до тех пор, пока не будет собрано достаточное количество данных или все кристаллы не будут проверены.
    1. Убедитесь, что полосы, которые были обработаны, четко обозначены так, что кристаллы не пропущены или дважды выстрелили (при необходимости нарисуйте эскиз). Как правило, трипановый синий цвет становится желтым после облучения ячейки, который может использоваться в качестве маркера.

figure-protocol-3
Рисунок 5 : Стратегия сбора данных из образцов при поддержке Micromesh. A ) стратегия сбора данных на полосу движения; Выравнивание выполняется в начале каждой полосы (точки), и данные собираются вдоль полосы. ( Б ) Крупный план окрашенной в трипановую окрашенную кристаллосодержащую ячейку на сетке, как видно на экране лучевой линии микрокристаллизации. ( C ) Крупный план очищенных полиэдров на сетке, как видно на экране лучевой линии микрокристаллизации. Квадраты сетки составляют 25 мкм × 25 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь мы кратко остановимся только на шагах обработки данных, которые являются специфическими для серийной микрокристаллографии, где объединяются данные из нескольких кристаллов. Многие отличные статьиДоступный для описания обработки данных по глубине 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 и определение структуры выходит за рамки настоящего протокола.

  1. Выберите кристалл с лучшим разрешением и качеством дифракции в качестве эталона.
  2. Индивидуально обрабатывать каждый кристалл с использованием стандартных пакетов кристаллографии, таких как HKL-2000 31 , Mosflm 32 или XDS 33 . Чтобы радиационное повреждение не ухудшало качество набора данных, тщательно выберите последнее изображение с приемлемым радиационным повреждением. Критерии отсечения, указывающие на чрезмерный радиационный ущерб, специфичны для каждого типа кристаллов, практики обработки и цели эксперимента. Для фазирования кристаллов полиэдрина BmCPV1 данные отбрасывались, как только сигнал-nOise / <σ (I)> на изображение упал ниже 2 или R sym превысил 50%, как сообщается HKL-2000 31 .
  3. Для каждого кристалла определите предел разрешения и количество кадров и переработайте с правильными параметрами, чтобы избежать интеграции данных с небольшим или отсутствующим сигналом.
  4. Масштабируйте и объедините данные из лучших кристаллов в эталонный кристалл (кристаллы), используя стандартные пакеты, такие как Scalepack в HKL-2000 31 , SCALA в CCP4 34 , 35 или XSCALE в XDS 33 . Постепенно добавляйте данные из разных кристаллов, контролируя глобальное качество набора данных, в идеале, до тех пор, пока набор данных не достигнет приемлемой полноты (> 95%). Отклонить кристаллы, которые представляют плохой изоморфизм с лучшим / эталонным кристаллом, как обнаружено различиями в параметрах элементарной ячейки и плохим R- слиянием / хи-квадратом на изображение. Если слишком много наборов данных хорошего качестваНе масштабируйте с помощью эталонного кристалла (кристаллов), используйте программу BLEND 36, которая осуществляет иерархическую кластеризацию, чтобы определить наилучшую комбинацию наборов данных для объединения.
    Примечание. В некоторых пространственных группах альтернативные параметры индексирования необходимо протестировать в соответствии с эталонным кристаллом.
  5. Перейдем к экспериментальной фазировке, замене молекул или уточнению с использованием стандартных пакетов кристаллографии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представлен обзор обоих альтернативных методов определения структуры с использованием микрокристаллов in vivo ( рис. 1 ). Полиэдры могут быть легко очищены ультразвуком и центрифугированием. Из-за их плотности они образуют слой в нижней части трубки под слоем мусора, который может быть удален путем пипетирования ( рис. 3а и 3b ). Затем образец подвергают нескольким раундам обработки ультразвуком и промы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол предусматривает два подхода к анализу микрокристаллов с целью облегчения анализа очень мелких кристаллов, которые в прошлом бы упускались из виду.

Критические этапы очистки микрокристаллов
Представленный протокол оптимизирован с использованием многогранника Bombyx mori CPV1, выраженного в клетках Sf9, в качестве модельной системы. Однако в микрокристаллах in vivo наблюдается большая изменчивость в механической устойчивости. Нап...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить Chan-Sien Lay для предоставления снимков очищенных микрокристаллов, Даниэля Эрикссона и Тома Карадока-Дэвиса для поддержки на линии луча MX2 австралийского синхротрона, а также Кэтрин Фланаган и Эндрю Фриги из объекта FlowCore в Университете Монаш для их Неоценимую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sf9 cellsLife Technologies
SF900-SFM среда для насекомыхLife Technologies
колба для клеточной культуры 1 лThermofisher Scientific
Shaking инкубатор для культуры клеток насекомыхEppendorf
50 мл конические пробиркиFalcon
Centrifuge с качающимися ведрами на 50 мл трубкиEppendorf
Sonicator оснащены 19 мм зондомMSE Soniprep 150 
Предметные стеклаHampton Research Гемацитометр
Sigma-Aldrich
Пропидиум йодидThermofisher Scientific
BD Influx сортировщик клеток Атомные экраны BD Biosciences
Hampton HeavyHampton Research
МикроцентрифугаEppendorf
MicromeshMitigen700/25 имеют большую поверхность. Индексированные сетки можно приобрести для проведения систематических исследований.
Бумажный фитильMitigenРазмер бумажного фитиля можно варьировать для обеспечения оптимального потока. Во многом это будет зависеть от характера используемых кристаллов и криопротектора.
ЭтиленгликольSigma-Aldrich
Trypan blueLife Technologies
MX2 микрофокусная линия излученияАвстралийский синхротронСписок доступных микрофокусных линий пучков можно найти в Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806,
doi:10.1071/CH14455.
Микроцентрифуга

Ссылки

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345(2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451(2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463(2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи