Методическая статья

Гипоксическое предварительное кондиционирование клеток-предшественников, полученных из костного мозга, в качестве источника для генерации зрелых клеток Шванна

DOI:

10.3791/55794

⸱

14 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Hong Kong, 2Department of Orthopaedics and Traumatology, The University of Hong Kong

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стромальные клетки костного мозга (MSC) с нейронным потенциалом существуют в костном мозге. Наш протокол обогащает эту популяцию клеток посредством гипоксической предварительной кондиции и после этого направляет их на зрелые клетки Шванна.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается средство обогащения для нейронных предшественников из популяции стромальных клеток костного мозга (MSC), а затем для направления их в зрелую судьбу клеток Шванна. Мы подвергли крысам и человеческим MSCs переходные гипоксические условия (1% кислорода в течение 16 часов), а затем расширение в виде нейросферов на субстрате с низкой степенью присоединения с добавлением фактора роста эпидермального фактора роста (EGF) / основного фибробласта (bFGF). Нейросферы высевали на поликультурный пластик, покрытый поли-D-лизином / ламинином, и культивировали в глиогенном коктейле, содержащем β-Heregulin, bFGF и тромбоцитарный фактор роста (PDGF) для генерации клеточных клеток Schwann (SCLC). SCLC были направлены на участие судьбы через сокультуру в течение 2 недель с очищенными нейронами дорзальных корневых ганглиев (DRG), полученными от E14-15 беременных крыс Sprague Dawley. Зрелые клетки Шванна демонстрируют стойкость в экспрессии S100β / p75 и могут образовывать миелиновые сегменты. Клетки, генерируемые таким образом, имеют потенциалПри трансплантации аутологичных клеток после травмы спинного мозга, а также при моделировании заболеваний.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансплантация нейронных предшественников и их производных обещает быть стратегией лечения после травматического повреждения нерва 1 , 2 и нейродегенерацией 3 , 4 . Перед клиническим применением важно обеспечить: i) способ доступа и расширения на аутологичный источник клеток стебля / предшественника и ii) средство для направления их к соответствующим зрелым типам клеток 3 . Наш интерес к клеточной терапии для повреждения спинного мозга привел нас к поиску надежного, аутологичного источника клеток нервных предшественников из тка....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, проводились в строгом соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Комитетом по использованию живых животных для обучения и исследований, Медицинский факультет Ли Ка Шинг, Университет Гонконга. Образцы костного мозга человека были получены из подвздошного гребня здоровых доноров после получения информированного согласия. Протоколы были одобрены Институциональным советом по обзору, Университет Гонконга.

1. Подготовка культур MSC крысы

  1. Урожай МСК с бедренной кости
    1. Автоклавируйте все инструменты для рассечения ( т.....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обзор основных этапов нашего протокола показан на рисунке 1 . Таким образом, крысиные и человеческие MSC выбираются путем прилипания к пластике тканевой культуры. Расширенные MSC предопределены гипоксией и затем подвержены условиям формирования нейросферы. Нейросферы покрыты и позволяют дифференцироваться в SCLC. SCLCs сокультивированы с очищенными нейронами DRG для генерации сукнантных клеток Шванна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Крайне важно сохранить «стебельность» MSC до обогащения нейронных предшественников посредством гипоксической предварительной кондиции и культуры нейросферы. По нашему опыту, мультипотентные MSC могут быть надежно идентифицированы по их удлиненной фибробластоподобной морфологии. Напротив, MSC, которые приняли более уплощенную, четырехугольную морфологию с выраженными клетками стволовых клеток, не с готовностью принимают судьбы нейронных клеток и должны быть отброшены. В общем, мы не используем MSC с номерами прохода боль.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все авторы этой рукописи не имеют раскрытия, чтобы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Най-Су Вонга за предоставление аппаратуры для гипоксии и г-жи Алисы Луи за техническую поддержку.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α MEMSigmaaldrichM4526
DMEM/F12Thermofisher scientific12400-024
Нейробазальная средаThermofisher scientific21103-049
FBSBioseraFB-1280/500
B27Thermofisher scientific17504-001
Эпидермальный фактор роста (EGF)Thermofisher scientific
Основной фактор роста фибробластов (bFGF) Peprotech100-18B/100UG
Фактор роста нервов (NGF) MilliporeNC011
Тромбоцитарный фактор роста-AA (PDGF-AA)Пепротех100-13А Герегулин
бета-3, домен EGF (β-Her)Millipore01-201
UridineSigmaaldrichU3003
5-Fluro-2' - дезоксиуридин (FDU)SigmaaldrichF0503
Поли-D-лизин (PDL)SigmaaldrichP7886-1G
LamininThermofisher scientific23017015
GlutaMAXThermofisher scientific35050061
пенициллин/стрептомицин (P/S)Thermofisher Scientific15140-122
TrypLE ExpressThermofisher Scientific12604-013
10 см пластина для адгезивной культурыTPP93100Используется для отбора МСК путем адгезии культуры тканей
6-луночный планшет для адгезивной культурыTPP92006Используется для расширения МСК после пассирования
UltraLow 6-луночный планшет для неадгезивной культурыCorning3471Используется для обогащения нейронных предшественников
античеловеческим CD90(Thy-1)BD Biosciences555593
античеловеческим CD73BD Biosciences550256
античеловек/крыса STRO-1R& D SystemsMAB1038
античеловеческиеисследования и исследования D SystemsMAB1259
античеловеческий CD45BD Biosciences555480
антикрысиный CD90(Thy-1)BD Biosciences554895
антикрысиный CD73BD Biosciences551123
антикрысиный нестинBD BiosciencesMAB1259
антикрысиный CD45BD Biosciences554875
Анти-S100&бета;DakoZ031101
Anti-p75MilliporeMAB5386
Anti-GFAPSigmaaldrichG3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1)CovanceMMS-435P
Anti-Human NucleiMilliporeMAB1281
Hypoxia камераBillups-RothenbergMIC-101
HEPES буферSigmaaldrichH4034-100G
PHG0313

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury? Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

S100 beta

Похожие статьи