Методическая статья

Скрининг Assays характеризовать Роман эндотелиальной регуляторы, участвующих в воспалительной реакции

6.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55824

⸱

15 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Эндотелия строго контролирует лейкоцита вербовки. Неадекватные лейкоцита кровоподтек способствует воспалительных заболеваний человека. Таким образом Поиск новых нормативных элементов эндотелиальной активации необходимо разработать более терапии воспалительных заболеваний. Здесь мы описываем всеобъемлющей методологии характеризовать Роман эндотелиальной регуляторов, которые можно изменять, лейкоцитарные людьми во время воспаления.

Аннотация

Эндотелиального слоя имеет важное значение для поддержания гомеостаза в организме, контролируя много различных функций. Регуляции воспалительной реакции эндотелиального слоя имеет решающее значение для эффективной борьбы против вредных материалов и помощи в восстановлении поврежденных участков. Когда эндотелиальные клетки подвергаются воспалительным среде, например компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий, липополисахарида (LPS), они выражают растворимых провоспалительных цитокинов, таких как Ccl5, Cxcl1 и Cxcl10 и вызвать Активация циркулирующих лейкоцитов. Кроме того экспрессии молекул адгезии VCAM-1 E-селектина и ИКАМ-1 на поверхности эндотелиальных позволяет взаимодействия и адгезии активации лейкоцитов эндотелиального слоя, и в конечном итоге кровоподтек на воспаленные ткани. В этом случае Эндотелиальная функция должна быть жестко регулируется потому, что чрезмерное или дефектных активации лейкоцитов наборе может привести к расстройств, связанных с воспалительным. Поскольку многие из этих расстройств не имеют эффективного лечения, Роман стратегии с упором на сосудистой слоя должны быть расследованы. Мы предлагаем всеобъемлющий анализов, которые полезны для поиска Роман эндотелиальной регуляторов, которые изменяют функции лейкоцитов. Мы анализируем эндотелиальной активации с помощью конкретным выражением целей участвующих в лейкоцитарной вербовки (например, цитокины, chemokines и молекулы адгезии) с несколько методов, в том числе: реального времени количественные полимеразной цепной реакции ( RT-qPCR), Западная блот, поток цитометрии и адгезии анализов. Эти подходы определения функции эндотелия в контексте воспалительных и очень полезны для выполнения анализов скрининг характеризовать Роман эндотелиальной воспалительных регуляторов, которые потенциально ценные для проектирования новых терапевтических стратегий.

Введение

Воспаление является полезной биологической реакции против инфекционных агентов, с основной целью ликвидации возбудителя и ремонта поврежденных тканей. При определенных условиях, например, хронические инфекции или аутоиммунные заболевания воспаление не решить. Вместо этого есть ненормальная реакция с постоянной инфильтрации лейкоцитов, в длительной иммунной реакции, что приводит в результате повреждения тканей, фиброз, потеря функции и в целом, инвалидности и в некоторых случаях смерти пациента. Эти человеческие расстройств, каталогизированы как воспалительные заболевания, все связаны кровеносных сосудов для контроля лейкоцитов кровоподтек1,2.

Эндотелиальные клетки играют основополагающую роль в регуляции воспалительной реакции, контролируя лейкоцита людьми. Когда эндотелиального слоя подвергается воспалительных медиаторов таких ПЛАСТИНОК, отдыхая эндотелия активирует и выражает провоспалительных цитокинов (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1 и т.д.) и молекул адгезии (E-селектина, VCAM-1 и ИКАМ-1) что пользу набор циркулирующих лейкоцитов к месту инфекции. Лейкоциты, затем загрунтовать выпустила цитокинов посредником прокатки и взаимодействие с эндотелиального слоя через корреспондентские клей партнеров: PSGL-1-селектина, α4β1 Интегрин VCAM-1 и αLβ2 Интегрин ИКАМ-1. Наконец Лейкоциты мигрируют через сосудистую к фокус воспаления3.

Существенную роль эндотелия в регуляции воспалительной реакции была продемонстрирована на мышах, которые были генетически изменены выразить LPS рецепторов, Толл подобный рецептор 4 (TLR4), только на эндотелиальных клеток. Эти животные эндотелия TLR4 были в состоянии реагировать на LPS-опосредованной воспаление и выявления инфекции, сформированное после прививки бактерии и поэтому добиться разрешения инфекции и выживания на аналогичных уровнях как мышей дикого типа4 , 5.

Для пути эндотелий регулируемых воспалительной реакции были постулируется, что ингибирование на некоторых этапах взаимодействия лейкоцита эндотелия приведет к сокращению транс эндотелиальная миграции и лучше прогноз воспалительных заболеваний. В самом деле несколько стратегий, ориентация эндотелиальной активации и лейкоцитов эндотелия взаимодействия были разработаны для препятствовать кровоподтек иммунных клеток для лечения воспалительных заболеваний6,7.

В настоящем докладе мы описываем тщательное группы методов в vitro полностью охарактеризовать эндотелиальной деятельности в ответ на воспалительные стимул ПЛАСТИНОК и его роль в активации лейкоцитов и адгезии сосудистого слоя. Эндотелиальных клеток модель, используемая в этой рукописи был линии эндотелиальных клеток мыши легких (ТЗЭТ-04), как описано в Hortelano и др. 8. линия клетки ТЗЭТ-04 протестирована в литературе быть надлежащей системы для изучения эндотелиальной активации9,10. Основываясь на научных интересов, эти подходы могут быть легко экстраполированы на любом эндотелия или лейкоцитарные системы и воспалительных профиль. После того, как определены эндотелиальных параметров в выбранных условиях, система может проверить роман наркотиков на предлагаемых экспериментов для оценки сосудистой активации. В этом контексте воспалительных клетки эндотелия, протестированы с соединения интереса можно сравнить с условий управления клеток и разногласий результирующей может информировать наркотиков прогнозных результатов развития и прогрессирования воспаления. В заключение, мы предлагаем соответствующие системы для характеристики новых лекарственных препаратов на эндотелиальных клеток, которые могут повлиять на дизайн Роман терапии сосудистых конкретных против воспалительных заболеваний.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. эндотелиальных клеток культуры

  1. культуры ткани лечение плиты
    1. пальто 100 мм культуры ткани пластины с желатином 2,5 мл раствора (газобетона, 0,1% желатина в дистиллированной воде) для 30 минут при 37 ° C; это могут быть экстраполированы на требуемый формат хорошо. Аспирационная раствор желатина и оставить пластины высохнуть в культуре ткани капюшоном.
  2. Культуры ткани условия
    1. культивировать ТЗЭТ-04 клетки внутри биологических инкубатора (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2). Рост клеток в полной СМИ Дульбекко ' s Modified Eagle средний: питательной смеси F-12 (DMEM/F-12) с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл (P/S).
    2. Подсчитать количество ячеек стандартным методом камеры Нойбауэр и добавьте ТЗЭТ-04 клетки желатин лечение пластины 100 мм в 10 мл полный СМИ, на низкой плотности 2-11 x 10 4 клетки/см 2. Разбить ячейки 1:3, когда они достигают слияния.
      Примечание: Обычно это происходит после двух-трех дней в культуры.
    3. Субкультура клетки путем промывки пластин с 10 мл стерильной фосфат буфер солевой (PBS) следуют добавления 2 мл раствора трипсина ЭДТА (трипсин 0.25%, 5 мм ЭДТА) и Инкубируйте 3 мин при 37 ° с.
    4. Остановить трипсина ЭДТА реакции и восстановить подвесной клетки путем добавления 10 мл полный СМИ. Спин вниз клетки (300 x g, 5 мин), удалить супернатант, Ресуспензируйте сотовой гранулы в полной СМИ и субкультуры надлежащим.

2. LPS лечения и посредников

  1. пластины ТЗЭТ-04 клетки в полной СМИ на суб впадения в формате хорошо: 7 x 10 5 клеток/также на 6-ну пластины и 2,5 x 10 5 клеток/колодец на 96-луночных пластин.
  2. Инкубировать культуру для 6 h в инкубатор клетки (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2). Переключитесь клетки неполной СМИ (DMEM-F12, P/S) и оставить ночь (на) для синхронизации и снизить активность клеток.
  3. Удалить средства массовой информации и проверить Роман фармакологических соединений путем инкубации эндотелиальных клеток с (или без) препарата (например DT 10) разводят в неполной СМИ (30 мин., 37 ° C); добавить 1.4 мл/хорошо для 6-ну пластины или 0,14 Мл/хорошо для 96-луночных планшетов).
  4. Вызов клетки путем добавления LPS инкубации СМИ (100 нг/мл, конечная концентрация) на период времени, указанный в каждом assay. Использовать как элемент управления PBS.

3. Оценка транскрипционный анализ профиля на активированный эндотелий, RT-ПЦР

  1. семян ТЗЭТ-04 клетки в суб слияния в культуре 6-ну пластины (7 x 10 5 клеток/хорошо). Проинкубируйте 6 ч (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2) и потом приступить к сыворотке голода (инкубировать на).
  2. Удалить средства массовой информации и лечить (или не лечить) эндотелиальных клеток культур с наркотиками интерес разводят в неполной СМИ (инкубировать 30 мин., 37 ° C); добавить 1.4 мл/хорошо для 6-ну пластины (30 мин., 37 ° C).
  3. Вызов клетки путем добавления 100 нг/мл LPS инкубирован СМИ (как описано в шаге 2.3) и инкубировать на 6 ч. прекратить реакции путем промывания дважды с холодной PBS и держать пластины на-80 ° C до обработки образца.
  4. РНК добыча
    1. оттепель пластины и добавьте 1 mL/хорошо РНК добыча буфера (38% фенола и 0,8 М Гуанидиновые Изотиоцианаты; см. таблицу материалов). Оставить на 30 минут при комнатной температуре (RT) под агитации и собирать огневки в 1,5 мл пробирок.
    2. Добавить 200 мкл хлороформе и нежно агитировать за 15 с. инкубировать на 3 мин в RT и центрифуги (11 600 x g, 15 мин, 4 ° C).
    3. Передавать другой 1,5 мл водной фазе. Осадок РНК, добавив 500 мкл изопропиловый спирт, а затем 10 минут инкубации на RT и затем центрифугирования (11600 x g, 4 ° C).
    4. Удалить супернатант и помыть лепешка с 75% этанола, вихревой агитации и затем центрифугирования (7500 g x, 4 ° C).
    5. Воздушно-сухой гранулы и солюбилизировать последнего РНК в 25 мкл чисто H 2 O по инкубации за 10 мин при 55 ° C. держать РНК-80 ° c до обработки образца.
  5. Количество и чистоты РНК
    1. количественного определения концентрации РНК путем измерения оптической плотности образца на 260 Нм в спектрофотометр (см. Таблицу материалы).
    2. Мера на 230 Нм и 280 Нм для определения чистоты РНК.
      Примечание: Коэффициент на 260/280 указывает белка или фенол загрязнения. Соотношение близко к 2 является приемлемым. Коэффициент на 260/230 указывает ЭДТА, углеводы или примеси фенола. Допустимы значения между 2.0-2.2.
  6. РНК, проверка целостности
    1. Бег 2 мкг всего РНК и РНК лестница на 1,5%, Денатурирующий гель агарозы; визуализировать на гель системы документации (см. Таблицу материалы).
      Примечание: 2:1 соотношение четкие и резкие 28S и 18S рРНК полосы указывает нетронутыми РНК. Частично деградировавших РНК решает как размытый вид.
  7. RT-ПЦР
    1. синтезировать комплементарной ДНК — (cDNA кДНК) от одного мель РНК после стандарт протокола (см. Таблицу материалов) 11.
  8. Вычислить выражение гена по RT-ПЦР
    1. подготовить реакционной смеси для каждого образца: микс 2 мкл cDNA, 7 мкл флуоресцентные соединение, 300 Нм вперед грунт и 300 Нм обратный грунтовка (Таблица 1) в Окончательный объем 13 мкл и добавить к 96-луночных реакции пластины (см. Таблицу материалы).
    2. Уплотнение пластину с оптической клей крышкой, центрифуги (300 x g, 1 мин) и запустить реакции в системе PCR реального времени (горячий старт 95 ° C 20 s следуют 40 циклов: 95 ° C 3 s и 60 ° C за 30 s) (см. Таблицу материалы).
    3. Анализировать результаты по относительной количественный, используя метод сравнительного 2 -ΔΔCt с уборки генов Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) или кислой рибосомных фосфоропротеид P0 (36B4) 12 .

4. Оценка эндотелиальной активации подачей Cytometry

  1. лечения следующих условий, описанных в разделе 2 клетки ТЗЭТ-04 и оценить изменения в эндотелиальных поверхности белки подачей cytometry.
  2. Отсоединение клетки после 6 h LPS стимуляции с трипсина ЭДТА методом, описанным в шаг 1.2.3 и мыть с неполной СМИ на 4 ° C.
  3. Подсчитать ячейки с помощью метода камеры Нойбауэр и 10 х 10 4 клетки в 96-ну u-поддоны. Центрифуга (300 x g, 5 мин) и удалить супернатант на 180° оснастки запястья сверху вниз и быстрое восстановление в первоначальное положение.
  4. 50 мкл выбранного антитела, разбавляют в неполной СМИ (10 мкг/мл, конечная концентрация) в клетки и инкубировать (30 мин., 4 ° C) и.
  5. Мыть дважды w клеткиITH неполной СМИ после процедуры, описанные в шаг 4.3, и инкубировать с 50 мкл на 10 мкг/мл соответствующие вторичные антитела и в сочетании с FITC или аналогичные конъюгата (30 мин., 4 ° C в темном пространстве).
  6. Мыть клетки один раз с неполной СМИ, следуют PBS мыть. Восстановить клетки с 300 мкл PBS с помощью 1 мл наконечники и место в трубы цитометрии.
  7. Оценить образцы в системе цитометрии потока (см. Таблицу материалы). Отрегулируйте популяции клеток вперед и параметры рассеяния стороне. Ворота населения интерес. Отрегулируйте ворота, основанные на отрицательный контроль от клетки инкубировали с изотипа управления. Анализировать результаты как процент положительных клеток или означают интенсивности флуоресценции 8.

5. Оценка эндотелиальной активации на западной помарке

  1. семян эндотелия в суб слияния в 6-ну культуры пластины (7 x 10 5 клеток/а) и лечения с ЛПС, как описано в разделе 2. Проанализировать выражение воспалительные белки Протоколом следующие западную помарку.
  2. Остановить стимуляцию LPS в разное время точках, чтобы прояснить различные аспекты эндотелиального ответа:
    1. определить профиль воспалительные белки после 6 h стимуляции LPS.
    2. Определить ячейки, сигнализации каждые 15 мин через период 60 мин.
  3. В обоих случаях остановить реакции, мыть дважды с холодной PBS и хранить образцы на-80 ° C до обработки образца.
  4. Lyse клеток и экстракции белка
    1. добавить 200 мкл лизис буфер для каждой скважины (1% неионные ПАВ, 10 мм трис-HCl, 1 ЭДТА, натрия хлорида 150 мм, Пирофосфат натрия 30 мм, фторид натрия 50 мм, 2.1 мм натрия Ортованадат на pH 7,6, дополнена ингибитор протеазы коктейль) (см. таблицу материалов).
    2. Инкубировать 15 мин при температуре 4 ° C под агитации, скрести скважин с кончиком пипетки и собирать огневки в 1,5 мл пробирок.
    3. Центрифуга трубы на 11600 x g на 4 ° C.
    4. Хранить супернатант в чистой 1.5 мл пробирок на-80 ° C до обработки.
  5. Мера, концентрацию белка, bicinchoninic кислоты assay после стандарт протокола (см. таблицу материалов) 13.
  6. Решить 30 мкг общего белка lysate для каждого образца, стандартный метод 0,1% натрия лаурилсульфат, 10% геля полиакриламида электрофореза (SDS-PAGE) 14. Запуск образцов с 10 мм β-меркаптоэтанол (сокращение условия) или без (-уменьшение условия) в зависимости от антитела используются для обнаружения протеина интереса.
  7. Передачи разлученных белки от геля полиакриламида винилидена фторид (PVDF) передачи мембраны с 0,45 мкм поры с помощью стандартной процедуры.
  8. После переноса, Промойте мембрану дважды с PBS, 0.1% Полисорбат-20 (PBS-T) и блокировать сайты неспецифических привязки, добавив 20 мл 2% BSA разводят в PBS-T для обнаруженных фосфолипопротеиновый или 5% обезжиренное сухое молоко в PBS-T для всего белки, под агитации (90 мин., RT).
  9. Развести выбранного антитела в 10 мл соответствующие блокировки буфера на рекомендуемая концентрация и Проинкубируйте мембрану под агитации (ON, 4 ° C). Кроме того, место мембраны в запечатанных полиэтиленовых пакетах и используется 5 мл разбавленной антитела.
  10. Следующий день, мыть мембраны, три раза (избыток PBS-Т, 15 мин, RT).
  11. Мембраны под агитации (30 мин., RT) с 10 мл корреспондент вторичные антитела обязан пероксидазы (ПХ) разводят в мэм в соответствующий блокирующий буфер инкубировать.
  12. Мыть мембраны три раза под агитации (избыток PBS-Т, 15 мин, RT).
  13. Проинкубируйте мембрану за 1 мин с 0,1 мл/см 2 пероксидазы субстрат усиленной хемилюминесценции (ЭСЛ). Место в осушенных мембрану между двумя прозрачные пластиковые листы и вставить его в системе обнаружения хемилюминесценции, которая включает в себя Charged-Coupled устройство камеры (CCD).
    1. Использовать камеры на ПЗС для обнаружения сигнала и его программное обеспечение для записи изображения с накопительной программы (изображения отображение накопленной сигнала на каждые 30 s воздействия на период всего 15 мин).
  14. Количественно группа интенсивности, денситометрия с использованием ImageJ программного обеспечения после протокол, описанных в руководстве пользователя 15.
    1. Открыть образец в ImageJ программного обеспечения и выберите группы, представляющих интерес с помощью инструмента Прямоугольное выделение.
    2. Выберите как первый переулок и нажмите Печать полос для получения профиля участков.
    3. Разграничить области пиков с прямой отбор.
    4. Измерить размер каждой группы, щелкнув внутри каждого пика.
    5. Представляют собой результаты в отношении загрузки элемента управления белка (β-актина, тубулин и т.д.).

6. Оценивать эндотелиальный фактор освобожден от активации лейкоцитарной адгезии анализов

  1. получить эндотелиальной кондиционером СМИ.
    1. Лечения ТЗЭТ-04 клетки, как указано в разделе 2 и собирать супернатанта культуры после 24 ч стимуляции с ПЛАСТИНОК (100 нг/мл).
    2. Собирать кондиционером СМИ от обработанной ТЗЭТ-04 клетки и центрифуги (600 x g). Храните супернатант в 0,5 мл аликвоты-80 ° c до использования.
  2. Лейкоцитарной адгезии Пробирная
    1. пальто 96-луночных пластины с 50 мкл/хорошо выбранной внеклеточного матрикса белков, разбавленных в PBS (за исключением коллагена, который разводится в уксусной кислоте 0,1 М): фибронектина (1-10 мкг/мл ), Ламинин (1-10 мкг/мл) и коллаген типа I (10-40 мкг/мл). Отпуск на 4 ° c.
    2. Отменить покрытием СМИ и блокировать сайты неспецифических привязки на скважинах с 150 мкл PBS, 1% BSA инактивированная тепла (1 мин., 100 ° C) 90 мин на RT.
    3. Мыть скважин дважды с PBS и добавить 100 мкл ранее собранные эндотелиальной кондиционером СМИ (раздел 6.1) к скважинам.
      Примечание: Пластины готовы для выполнения адгезии assay.
    4. Культура линии клеток Моноцит макрофагального мыши J774 в биологических инкубатора (37 ° C, влажность 95%, 5% CO 2) с Roswell парк Мемориальный институт среднего (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      Примечание: J774 клетки растут в суспензии.
    5. Собирать J774 клетки в 15 мл трубки и центрифуги (300 x g, 5 мин). Отменить супернатант и Ресуспензируйте сотовой лепешка с 10 мл сыворотки свободных СМИ. Подсчитать ячейки в камере Нойбауэр. Центрифуга клетки (300 x g, 5 мин), удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток в сыворотке свободных СМИ в 15 х 10 4 J774 клеток на 50 мкл СМИ.
    6. Добавить 15 х 10 4 J774 клетки к каждому хорошо в 50 мкл сыворотки свободных средств массовой информации и Инкубируйте 15 мин при 4 ° C, следуют 1 ч при 37 ° C в инкубаторе клеток CO 2.
    7. Мыть скважин дважды, осторожно добавив теплых PBS; центрифуги (300 x g, 5 мин) и удалить супернатант на 180° оснастки запястья сверху вниз и быстрое восстановление в первоначальное положение. Исправить прилагаемый ячейкиs 100 мкл/колодец параформальдегида 4% (PFA), добавив в PBS и инкубировать (10 мин., RT) и.
    8. Отменить СМИ мягко и нежно разрушения клеток с 2% метанола в PBS на 2 мин на RT. Discard СМИ и запятнать клетки, добавляя 50 мкл/хорошо Фиолетовый Кристалл 0.5% в 20% метанола для 90 s на RT.
    9. Мыть тарелку с обильной проточной водой, отбросить лишнюю жидкость и оставить его для воздушно-сухой. Доклад прилагаемый клеток в сочетании с световой микроскоп цифровой фотоаппарат.
    10. Развести клеток, окрашивание, добавив 100 мкл/хорошо цитрата натрия 0,1 М, 50% этанола. Мера, поглощения в 545 Нм и представляют результаты в произвольных единицах поглощения или процент адгезии, рассматривая 100% качестве клеточной адгезии достигло скважин покрытием с большей концентрацией лигандом

7. Испытания эндотелиальной активации Assay Сопредседатель адгезии лейкоцитов-эндотелия

  1. лечения ТЗЭТ-04 клетки на 96-луночных пластины, как описано в разделе 2 и проинкубируйте с ПЛАСТИНОК (6 ч., 37 ° C).
  2. Дневно обозначить J774 клетки с Карбоксифлуоресцеина Succinimidyl эфира (CSFE).
    1. Мыть J774 клетки в PBS после процедуры в разделе 6.2.5. Количество клеток Нойбауэр камерная метод и Ресуспензируйте на 1 x 10 6 клеток/мл в PBS, 0.1% BSA.
    2. Инкубации клеток с CFSE (5 мкм, конечная концентрация) для 20 минут при 37 ° C. добавить 5 мл неполной СМИ и инкубировать (5 мин., 4 ° C) и.
    3. Мыть раз с неполной СМИ, как описано в разделе 6.2.5., Ресуспензируйте в 15 х 10 4 клетки/100 мкл и приступить к assay Сопредседатель адгезии.
  3. После лечения эндотелия, промыть скважин три раза с неполной СМИ. Добавьте CFSE-J774 клетки (15 х 10 4 клетки/100 мкл) для каждой эндотелиальной покрытием хорошо. Инкубировать пластину для 10 мин при 4 ° C, после чего 60 мин 37 ° C.
  4. Промыть лунки нежно, как описано в 6.2.7., используя утепленные PBS и сообщить эндотелиального слоя J774 адгезии, следующие два метода:
    1. Лизируйте клетки в 0,1 М трис-HCl рН 8,8, 1% SDS (100 мкл/а) и измерения CFSE-J774 сигнал флюометрия (возбуждения/выбросов = 492 Нм/517 Нм). Представляют собой результаты как условные единицы интенсивности флуоресценции или процент сцепления в отношении позитивного управления (сигнал от общей ячейки, добавленные в каждой скважине).
    2. Исправить клетки в 4% PFA и доклад вложение CFSE-J774 клеток эндотелия, визуализации под флуоресцентным микроскопом (возбуждения/выбросов = 492 Нм Нм/517).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка LPS-индуцированной эндотелиальных клеток активации RT-ПЦР

Сыворотка голодали ТЗЭТ-04 клетки были простимулированы 100 нг/мл ПЛАСТИНОК для 6 h, и выражение эндотелиальной гена была оценена с помощью RT-ПЦР, сравнивая выражение маркеров активации в состояние покоя. Как показано на рисунке 1A, клетки инкубировали LPS ТЗЭТ-04 индуцированную экспрессию мРНК выбранных сцепления молекул, участвующих в ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот эндотелиальной протокол описывает пошаговая технология, которая устанавливает основу для изучения новых механизмов, участвующих в регуляции воспалительной реакции. Эти подходы основаны на исследование эндотелиальной активности стимулируется ПЛАСТИНОК и оценить критические шаги, участвует в лейкоцитарной набора в течение воспалительной реакции, в частности: релиз эндотелиальной цитокинов, эндотелиальных адгезии молекулы выражение и лейкоцитарной адгезии сосудистой слоя. Как только эндотелия параметры установлены, сис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Ministerio де Economía y развитию (МИНЕКО) и Институту Salud Карлоса III (ISCIII) (Грант номер IERPY 1149/16 а.л.; МРУ 1410/09 для S. Hortelano); по МИНЕКО через Fondo de Investigación en Salud (FIS) (предоставляет номера PI11.0036 и PI14.0055 S. Hortelano). Эрранс Касадо S. было поддержано IERPY 1149/16 от ISCIII.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЖелатинSigmaG9391
DMEM-F12LonzaBE12-719F
Фетальная бычья сывороткаSigmaA4503
Пенициллин стрептомицинLonzaDE17-602E
ТрипсинLonzaBE17-160E
EDTASigmaED2SS
LPSSigmaL2880
TrizolSigmaT9424Буфер для экстракции РНК
ИзопропанолSigma33539
Этанол абсолютныйPanreac1,310,861,612
Чистый H2OQiagen1017979без РНКазы
AgarosePronadisa8020
Краситель для агарозных гелейInvitrogens33102
SuperScript III First-Strand SynthInvitrogen18080051Реагенты для ОТ-ПЦР
Fast SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610флуоресцентным красителем для qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-wellApplied Biosystems4346906планшеты для qPCR
U-bottom 96 луночные планшетыFalcon353072
Цитометрические пробиркиFalcon352054
TX100Panreac212314Неионогенное поверхностно-активное вещество
Tris-HClPanreac1,319,401,211
Хлорид натрияMerck1,064,041,000
Пирофосфат натрияSigma221368
фторид натрияSigmaS7920
Ортванадат натрияsigma13721-39-6
Коктейль ингибиторов протеазыsigmaP8340
Набор для анализа белка BCAPierce23225Реагенты для анализа бицинхониновой кислоты
&бета;-меркаптоэтанолMerck805,740
PVDF Transfer Membrane, 0,45 &микро; mThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611Полисорбат 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLМиллипорыWBKLS0500
фибронектинаSigmaF1141
ЛамининSigmaL2020
Коллаген типа ISigmac8919
Уксусная кислотаPanreac1,310,081,611
Трипановый синийSigmaT8154
ПараформальдегидSigmaP6148
МетанолPanreac1,310,911,612
Кристаллический фиолетовыйSigmaHT90132
цитрат натрияSigmaC7254
Этанол 96%Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Многорежимный считыватель микропланшетов
Gel Doc 2000Bio-Rad2000Система документирования геля
StepOnePlusПрикладные биосистемыStepOnePlusqPCR система
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10Цитометрическое оборудование
ChemiDoc MPBio-RadMPХемилюминесцентная система обнаружения
НазваниеCompanyКаталожный номерКомментарии
Antibodies
PECAM-1BD Biosciences553370Использование при 10 &m; г/мл
ICAM-2Biolegend1054602использования при 10 & микро; г/мл
E-селектинBD Biosciences553749применение при 10 & микро; г/мл
VCAM-1BD Biosciences553330Использование при 10 & микро; г/мл
ICAM-1Becton Dickinson553250Использование при 10 & микро; г/мл
антикрысиного IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006Применение при 10 & микро; г/мл
антиармянский хомяк - FITCJackson Immuno Research127-095-160Применение при 10 & микро; г/мл
Контроль изотиопы IgG у крысInvitrogen10700Применение при 10 & микро; г/мл
Контроль изотипа IgG армянского хомякаInvitrogenPA5-33220Применение при 10 & микро; г/мл
P-Iκ &Бета;-αКлеточная сигнализация2859Использование при 10 и микро; г/мл
β-АктинSigmaA5441Использование при 10 & микро; g/mL
P-ERKCell Signaling9101Использование при 10 & микро; г/мл
анти-мышиный HRPGE HealthcareLNXA931/AEИспользование при 1:10 000
против кролика HRPGE HealthcareLNA934V/AGИспользование при 1:10 000
против крыс HRPSanta CruzSc-3823Использование при 1:10 000

Ссылки

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930(2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149(2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи