Методическая статья

Модель нефрэктомияй мыши 5/6, который индуцирует экспериментальный уремический кардиомиопатия

DOI:

10.3791/55825

⸱

7 ноября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Marshall Institute for Interdisciplinary Research (MIIR), Marshall University, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University Joan C. Edwards School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись содержит подробные двухэтапный хирургические процедуры для выполнения мыши 5/6й частичной нефрэктомии (PNx) с полюса перевязки. Через четыре недели после операции, по сравнению с приводом Шам мышей, мышей PNx разработали нарушение функции почек, анемия, гипертрофии сердца, фиброз сердца и снижение систолической и диастолической функции сердца.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая болезнь почек (CKD) является большим фактором риска для сердечно-сосудистых заболеваний и смертности и постепенно развивается в клинический фенотип, под названием «уремический кардиомиопатия». Мы здесь описать экспериментальную модель мыши CKD, названный 5/6й частичной нефрэктомии (PNx) с полюса перевязки, который разработал уремический кардиомиопатия на четыре недели после операции. Эта модель PNx была исполнена двухэтапную операцию. В хирургии шаг один были лигируют оба полюса левой почки. В хирургии шаг 2, который был проведен 7 дней после операции шаг один, был удален правой почки. Шам хирургии те же процедуры операции были выполнены, но без полюса перевязка левой почки или удаления правой почки. Хирургические процедуры проще и менее трудоемким, по сравнению с другими методами. Однако остаток функциональной почечной массы не контролируется так же легко, как перевязка почечной артерии. Через четыре недели после операции, по сравнению с приводом Шам мышей, мышей PNx разработали нарушение функции почек, анемия, гипертрофии сердца, фиброз сердца и снижение систолической и диастолической функции сердца.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CKD, также известный как хронической почечной недостаточности, является прогрессивной потере функции почек с течением времени, что в конечном итоге превращается в постоянный почечной недостаточности. CKD, от ранней стадии почечной болезни государства терминальной стадии почечной болезни (ТПН), является большим фактором риска для сердечно-сосудистых заболеваний и смертности и постепенно развивается в клинический фенотип, под названием «уремический кардиомиопатия»1, 2,3. Уремический кардиомиопатия у больных с CKD или ТПН связан с сердечно-сосудистые аномалии, главным образом вызвано перегрузкой левого желудочка (LV) давления и/или объема, приводит к гипертрофии LV (ГЛЖ), LV дилатация и систолической дисфункции LV4 ,5,6. Фиброз сердца является другой общей патологический процесс уремический кардиомиопатия, что уменьшает результате LV диастолическая дисфункция сердечной соответствия. Тяжелой сердечной фиброз может привести к внезапной сердечной смерти, даже в тех, кто без сердца симптомы7.

5/6-й PNx представляет собой часто используемые CKD животных модель для исследования на животных с участием почечной недостаточности, кардиомиопатии уремический и гипертонии. PNx достигается абляции почечной паренхимы 5/6. Крыса была первоначально разработана модель с двумя наиболее распространенных протоколов работающих хирургическая резекция или миокарда. Крыса PNx модель является чрезвычайно полезной моделью для изучения уремический кардиомиопатия с существенной высоты артериального давления, гипертрофии сердца и нарушение диастолической функции. Позже благодаря широкая доступность и простота изготовления генетических манипуляций в системе мыши были разработаны мыши PNx модели, работала моделью крыса, с аналогичными методами.

Это хорошо документированы, что системные окислителя стресс является постоянной чертой обеих клинической и экспериментальной уремический кардиомиопатия8,9. Кроме того окислитель стресс способствует уремический синдром10и играет важную роль в патогенезе сердечной ненормальности в уремический кардиомиопатия11,12,13. С этого момента, мы показали, что грызун 5/6-й PNx модель вызывает морфологические, физиологические и биохимические особенности уремический кардиомиопатия14,,1516, 17. в модель PNx мыши, описанных здесь, действовали PNx мышей разработала значительные оксидативного стресса, по крайней мере частично опосредованной, Na/K-АТФазы сигнализации функция, которая имеет решающее значение в PNx опосредованной экспериментальной уремический кардиомиопатия. Затухание Na/K-АТФазы сигнализации не только уменьшает окислительного амплификации, но также улучшает фенотипические изменения в PNx опосредованной экспериментальной уремический кардиомиопатия18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

все Уход за животными и экспериментов были утверждены Маршалл университета институционального ухода за животными и использования Комитет (IACUC) в соответствии с руководством национальных институтов здравоохранения (НИЗ) для ухода и использования лабораторных животных. Самцов мышей C57BL/6 (10-12 недель) были размещены в объекте Бесплатные животных патогенов в специально отведенных номерах, оборудованных с клетками, которые поставляют очищенного воздуха под свет/темно цикл 12 h. Пища и вода были предоставленного ad libitum.

1. Подготовка операции

Примечание: хирургические инструменты и материалы полученные из различных источников, которые не являются специфическими для операции. Инструменты и материалы из других источников, могут также использоваться для той же цели. Смотрите Таблицу материалы список хирургических инструментов.

  1. Подготовка к операции
    1. место следующие доступными операционной таблицы: потепление площадку, галогенная лампа, танк кислород и изофлюрановая танк, изофлюрановая испарителем, машинка для стрижки волос, удаления волос крем, весы, стерилизованное набор, стерилизовать хирургические белья, ватные тампоны, 70% спирта, polyhydroxydine раствора (содержит 1% йода), 0,9% раствор NaCl, 1 мл-шприцы и иглы (30 Г), 3-0 и 4: 0 шелковыми швами, бупренорфин и пенициллин, мазь с антибиотиком, и Смазка глазную мазь.
    2. Чистой клетке и место тепла площадку под постельные принадлежности для мышей жилья после хирургии.

2. Шаг 1 хирургия: полюс перевязка левой почки

Примечание: поддерживать стерильные условия во время операции. Обложка газобетона хирургических инструментов стерильной салфеткой. В руке держите больше чем один набор хирургических инструментов для более чем одной операции для предотвращения перекрестного заражения во время операции. Если инструменты должны использоваться снова, в случае нескольких кабинетов, дезинфекция инструментов с Бетадин-раствор и 70% этиловом спирте и затем простерилизуйте в Герминатор стеклянный шарик стерилизатор для 5 минут лечить зоне с 70% этиловом спирте. Носить платье, маска (для покрытия носа и рта), крышка (для покрытия головы) и стерильные перчатки. После каждой операции изменить перчатки.

  1. Мыть и дезинфицировать руки и носить стерильные хирургические перчатки. Носите голову шапку и маска.
  2. Лечить таблицу с 70% спирта. Применение смазки глазную мазь для обоих глаз, мыши, чтобы предотвратить сухость глаз под наркозом.
  3. Поместите курсор мыши в камеру индукционной системы изофлюрановая испарителем и побудить анестезии смесь 2,5% изофлюрановая с 100% кислорода (0,8 - 1,2 Л/мин) для 1-2 мин
    Примечание: Эффективность анестезии определяется отсутствие боли рефлекс вызвал щипать хвост, а также отсутствие глазной рефлекс, прикоснувшись веко.
  4. Придать пенициллин (40,000 подразделения/кг массы тела, IM) и бупренорфин (0,02 мг/кг массы тела, SC) для предотвращения инфекции и боли во время операции.
  5. Поместите курсор мыши на потепление площадку (первоначально устанавливается при 42 ° C) с помощью ректального термометра поддерживать и контролировать температуру тела около 37 ° C во время процедуры. Место мыши носом в носовой конус и проветрить смесью 0,8-1,2% изофлюрановая с 100% кислорода (0,8-1,2 Л/мин) во время операции.
  6. Место мыши на правой стороне. Бритье волос хирургические области с клипер волос, а затем удалить с крем удаления волос. Лечить сайт с polyhydroxydine раствора (содержит 1% йода) следуют на 70% спирте. Совместите газобетона хирургического белья на зоне хирургические.
  7. Сделать ~1.0 см поясничного разреза и отдельных мышц и фасции, чтобы разоблачить левой почки с помощью скальпеля и щипцы ( Рисунок 1a).
  8. Вытащить левой почки очень осторожно потянув околопочечный жир с небольшой тупой щипцами. В процессе, с тем чтобы не нарушить надпочечников, переместите надпочечников вверх из почек с щипцами.
  9. Использование тупой щипцы, аккуратно дразнить соединительной ткани и надпочечников с превосходной конца почек к середине пилоруса почки, где кровеносные сосуды входа и выхода. Идентифицировать и изолировать мочеточника.
    Примечание: Мочеточника лежит вокруг нижней половины почек, внедренные в соединительной ткани и четко видны под светом.
  10. Нежно захватить соединительной ткани и отдельно от почечной ткани для обеспечения что мочеточника не перевязано.
  11. До полярных перешнуровок, используйте стерильные линейки для определения верхней и нижней 1/3 часть почки. Мышь почек обычно составляет около 1,25-1,5 см долго
  12. Ligate с помощью 3-0 шелк шовные строки и с надлежащей силы, около 0,4 см от превосходной части к середине Пилора и аналогично, 0,4 см от нижней части к пилоруса ( рис. 1a, пунктир линии).
  13. После безлигатурные обоих полюсов ( рис. 1b), позволяют наблюдения 2-мин время чтобы убедиться, что есть нет кровотечения.
    Примечание: В процессе, это очень важно избежать лигирование надпочечника, почечной артерии и мочеточника. Если левый Мочеточник перевязано, мышь умрет после удаления правой почки в хирургии шаг два. Лигирование силы можно ограничить приток крови к полюсам не вызывая внутри почечного кровотечения. В течение 1-2 мин после перевязки, поляков бесцветные из-за ограничения притока крови к полюсы.
  14. Нажмите левой почки обратно в первоначальное место. Закройте мышц и кожи с 4-0 и 3-0 строк Шелковый шов, соответственно. Применять мазь с антибиотиком к зоне хирургические для лучшего восстановления и дезинфекции.
  15. После перевязки, дом мыши отдельно в клетке с тепла лампы над клетке так, что постельные принадлежности район находится недалеко от 37 ° C (отслеживается с помощью термометра), до размещения животных в отдельных клетках.
    Примечание: Контролировать мыши до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
  16. Обеспечивают легкий доступ к воде и продовольствию во время восстановления. Управление пенициллина и бупренорфина каждые 12 ч для первых 3 дней после операции для предотвращения инфекции и боль.
    Примечание: Мышь должна оправиться от травмы, операции в течение 2-3 дней и следует вернуться к нормальной еды, питья и перемещение. В это время домовая мышь индивидуально для полного восстановления. Следующие должны контролироваться: пить, есть, ходьба шаблоны, походка, сгорбленная обратно, глазной или носовой разгрузки и агрессивным поведением. Усыпить мыши, если он показывает никаких признаков захвата, кома, неизлечимой инфекции, трудно ходить, потеря походки, не в состоянии съесть и выпить, и потери более чем 15% веса предоперационная.

3. Шаг две операции: удаление правой почки

  1. семь дней спустя, разоблачить правой почки, как описано для левой почки в шагах 2.1 до 2,10, за исключением поместите курсор мыши на его левой стороне.
  2. Место правой почки на белье и снимите окружающие жира и соединительной ткани с тупым щипцами.
  3. Определить почечной артерии и Вены, а затем поместите два лигатуры (3-0 шелк) каждый с одной свободной узел вокруг судов. Аккуратно дразнить соединительной ткани и надпочечников железы от конца Улучшенный почки к середине пилоруса почек с помощью тупого щипцы. Слегка сместить мочеточника от нижнего конца и связать все вместе судов (3-0 шелк) не вызывая кровотечение.
  4. Переместить две свободные лигатура узлов вдоль судов. Один в сторону брюшной аорты и один в сторону почек.
  5. Сначала галстук с узлов лигатура (в сторону брюшной аорты) с двойной узлов; сплошной узел будет менять цвет правой почки. Галстук с вязи узел (в сторону почки) с двойной узлов. Оставьте достаточно места между эти двумя двойной узлы таким образом, чтобы сократить судов между двумя узлов без разрезания узлов лигатура.
  6. Вырезать почечных сосудов между двумя узлов и удалить правой почки. Проверьте возможные кровотечения из почечных сосудов.
  7. Сухой правой почки, используя стерильную марлю и взвесить его.
  8. Закройте мышц разрез с 4-0 Шелковый шов строки и Кожный разрез с строкой Шелковый шов 3-0.
  9. Дом мыши отдельно в чистой одиночную клетку с тепла лампы над клетке (шаг 2.15) с легким доступом к воде и продовольствию для по крайней мере 24 часа для восстановления. Администрирование пенициллин и бупренорфина каждые 12 ч для 3 дней для предотвращения инфекции и боль в.
    Примечание: Мышь должна оправиться от травмы, операции в течение 2-3 дней и следует вернуться к нормальной еды, питья и движущихся.
  10. После операции, контролировать мышей два раза в день за три дня, а затем один раз в день в течение всего эксперимента. Следуйте послеоперационный мониторинг и лечебные процедуры, описанные в шаге 2.16.

4. Липовые хирургии

  1. для Шам хирургии, выполнить те же процедуры хирургии, включая воздействие на почки, рассечение тканей, и закрытие раны, но без полюса перевязка левой почки или удаления правой почки.

5. оценки экспериментальных уремический кардиомиопатия

  1. за один день до самопожертвования, выполняют Трансторакальная эхокардиография и захвата изображения 18.
    Примечание: Здесь, трансторакальная эхокардиография проводилась с помощью мыши, обработка таблицы и ректального термометра. Эхокардиографические изображений были получены с помощью МГц 18-38, Рабочая частота датчика придает съемочной системы. Относительной толщины (RWT), индекс производительности миокарда (MPI) и индекс массы левого желудочка (ИММЛЖ) были рассчитаны как мы описали 18.
  2. В то время жертвоприношения, измерения веса тела. Измерить гематокрит HCT центрифуг согласно производитель ' s инструкции. Подготовьте образцы плазмы, с использованием труб Гепарин покрытием центрифугированием образцов крови для 10 мин на 1500 x g при 4 ° C в настольная центрифуга охлажденных. Измерить Цистатин C, креатинина и Бун, используя наборы после производитель ' s инструкции. Выполнение измерений в двух экземплярах.
  3. В конце эксперимента, анестезировать мышей с кетамин (90 мг/кг, IP) и xylaxine (10 мг/кг, IP) и пожертвовать торакотомии. Измерьте вес сердца после его удаления из груди. Подготовка сердца (LV) и гомогенатах почек, а также определение типа-1 коллагена (COL-1), фосфорилирование карбонилирование c-Src и белка, как описано до 18 , 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данные показывают, что это изменение 5/6-й PNx модель на полюс лигирование представляет собой простой и эффективный модель расследовать уремический кардиомиопатии. На четыре недели после операции Эта модель представляет PNx нарушениями функции почек, анемия, гипертрофии сердца, фиброз сердца и снижение систолической и диастолической функции сердца. Ниже кратко излагаются результаты.

На четыре недели п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Крыса 5/6й PNx модель широко использовалась для изучения CKD. Из-за гораздо меньшие почек размер в мышь классическая артерии перевязки и полюс резекции очень сложным в моделях мыши с возможной высокой смертности и неожиданные кровотечения/кровопотери.

Мы приняли модель PNx мыши с полюса перевязки для преодоления кровотечение/кровопотери. Эта модель PNx занимает меньше времени, с улучшение выживаемости и высокая воспроизводимость. Эта модель лигирование полюс разрабатывает фенотипиче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH R15 1R15DK106666-01A1 (к Лю J.) и низ RO1 HL071556 (к. и. Шапиро).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ножницы с радужной оболочкой, 11,5 см, прямыемировые прецизионные инструменты501758
швейцарский пинцет WPI #5 11 см, 0,1x0,06 мм наконечникиWorld Precision Instruments504506
ювелиры #5, 11 см, прямые, титановыепрецизионные инструменты555227F
Ирисовые щипцы, 10 см, прямые, зазубренныеWorld Precision Instruments15914
Пинцет #3, 11 см, наконечники 0,2x0,4 ммWorld Precision Instruments501976
изогнутые ножницы Medesy Iris 4,5 дюйма, нержавеющая стальNet233512www.Net32.com
ножницы Dr. Slick Iris; 3,5 дюймаAvid Max220-1-965-IrisScsrs-P Веб-сайт. Avid Max.com
Miltex Iris Ножницы 4 1/8" изогнутые4mdmedicalV95-306www.4mdmedical.com
5" Гемостат хлопок, изогнутая челюстьPJTool4355www.pjtool.com
скляр Knapp Ирис ножницы, прямые и острые/тупые 4"Склад медицинского оборудования64-3430www.medicaldevicedepot.com
Kelly Гемостатические щипцы прямые 5,5"PilgtimmedicalFA710-50www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 мышейHilltop Lab Animals Inc.
  Стол для работы с мышью и ректальный термометрVisualsonics
MicroScan transducer Vevo 1100MS400
Vevo 1100 Система визуализации FUJIFILM VisualSonics Inc.
Набор цистатина С ИФА и набор креатинина у мышей Crystal Chem. Inc.
Мышка БУЛОЧКА ИФА набор MyBioSource Inc 
мировые

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sarnak, M. J., et al. Kidney Disease as a Risk Factor for Development of Cardiovascular Disease: A Statement From the American Heart Association Councils on Kidney in Cardiovascular Disease, High Blood Pressure Research, Clinical Cardiology, and Epidemiology and Prevention. Circulation. 108 (17), 2154-2169 (2003).
  2. Levey, A. S., et al. Controlling the epidemic of cardiovascular disease in chronic renal disease: what do we know? What do we need to learn? Where do we go from here? National Kidney Foundation Task Force on Cardiovascular Disease. Am J Kidney Dis. 32 (5), 853-906 (1998).
  3. Schiffrin, E. L., Lipman, M. L., Mann, J. F. E. Chronic Kidney Disease. Effects on the Cardiovascular System. 116 (1), 85-97 (2007).
  4. Foley, R. N., et al. Clinical and echocardiographic disease in patients starting end-stage renal disease therapy. Kidney Int. 47 (1), 186-192 (1995).
  5. Foley, R. N., et al. The prognostic importance of left ventricular geometry in uremic cardiomyopathy. J Am Soc Nephrol. 5 (12), 2024-2031 (1995).
  6. Alhaj, E., et al. Uremic cardiomyopathy: an underdiagnosed disease. Congest Heart Fail. 19 (4), 40-45 (2013).
  7. Gulati, A., et al. Association of fibrosis with mortality and sudden cardiac death in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy. JAMA. 309 (9), 896-908 (2013).
  8. London, G. M., Parfrey, P. S. Cardiac disease in chronic uremia: pathogenesis. Adv Ren Replace Ther. 4 (3), 194-211 (1997).
  9. Mohmand, B., Malhotra, D. K., Shapiro, J. I. Uremic cardiomyopathy: role of circulating digitalis like substances. Front Biosci. 10, 2036-2044 (2005).
  10. Himmelfarb, J., McMonagle, E. Manifestations of oxidant stress in uremia. Blood Purif. 19 (2), 200-205 (2001).
  11. Okamura, D. M., Himmelfarb, J. Tipping the redox balance of oxidative stress in fibrogenic pathways in chronic kidney disease. Pediatr Nephrol. 24 (12), 2309-2319 (2009).
  12. Himmelfarb, J., Stenvinkel, P., Ikizler, T. A., Hakim, R. M. The elephant in uremia: oxidant stress as a unifying concept of cardiovascular disease in uremia. Kidney Int. 62 (5), 1524-1538 (2002).
  13. Becker, B. N., Himmelfarb, J., Henrich, W. L., Hakim, R. M. Reassessing the cardiac risk profile in chronic hemodialysis patients: a hypothesis on the role of oxidant stress and other non-traditional cardiac risk factors. J Am Soc Nephrol. 8 (3), 475-486 (1997).
  14. Drummond, C. A., et al. Reduction of Na/K-ATPase affects cardiac remodeling and increases c-kit cell abundance in partial nephrectomized mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (12), 1631-1643 (2014).
  15. Kennedy, D. J., et al. Partial nephrectomy as a model for uremic cardiomyopathy in the mouse. Am J Physiol Renal Physiol. 294 (2), 450-454 (2008).
  16. Haller, S. T., et al. Monoclonal antibody against marinobufagenin reverses cardiac fibrosis in rats with chronic renal failure. Am J Hypertens. 25 (6), 690-696 (2012).
  17. Tian, J., et al. Spironolactone attenuates experimental uremic cardiomyopathy by antagonizing marinobufagenin. Hypertension. 54 (6), 1313-1320 (2009).
  18. Liu, J., et al. Attenuation of Na/K-ATPase Mediated Oxidant Amplification with pNaKtide Ameliorates Experimental Uremic Cardiomyopathy. Sci Rep. 6, 34592(2016).
  19. Yan, Y., et al. Involvement of reactive oxygen species in a feed-forward mechanism of Na/K-ATPase-mediated signaling transduction. J Biol Chem. 288 (47), 34249-34258 (2013).
  20. Leelahavanichkul, A., et al. Angiotensin II overcomes strain-dependent resistance of rapid CKD progression in a new remnant kidney mouse model. Kidney Int. 78 (11), 1136-1153 (2010).
  21. Ma, L. J., Fogo, A. B. Model of robust induction of glomerulosclerosis in mice: importance of genetic background. Kidney Int. 64 (1), 350-355 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C

Похожие статьи