Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55829

⸱

28 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

В этой статье

Краткое содержание

Ранние endosome функции зависят от F-актина полимеризации. Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются биохимических и генетических манипуляции.

Аннотация

Многие ранние endosome функции, особенно грузовых белка сортировки и мембраны деформации, зависит патчи короткие F-миозина нитей, тому на мембраны от англ. Мы создали на основе микроскопии в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках, делая этот комплекс серии реакций поддаются генетических и биохимических манипуляции. Размещения в сахарозы градиенты из клеток, выражая раннего от англ белка GFP-RAB5 готовятся дроби от англ. Цитозольной фракции готовятся из отдельных партий клеток. От англ и цитозольной фракции могут храниться в жидком азоте, при необходимости. В assay от англ и цитозольной фракции являются смешанными, и смесь инкубировали при 37 ° C при соответствующих условиях (например, ионной силы, сокращение среды). В нужное время реакционную смесь является фиксированным, и F-актина раскрывается с Фаллоидин. Актин нуклеации и полимеризации затем анализируются микроскопии флуоресцирования. Здесь мы сообщаем, что этот assay может использоваться для изучения роли факторов, которые участвуют в актина нуклеации на мембрану, или последующих удлинение, ветвление или сшивки F-миозина нитей.

Введение

В высших эукариотических клеток белков и липидов интернализации в начале endosomes, где происходит сортировка. Некоторые белки и липиды, которые суждено быть переработке, включены в трубчатых регионов раннего endosomes и затем транспортируется к плазматической мембраны или транс Гольджи сеть (TGN)1,2. Напротив другие белки и липиды выборочно упаковываются в регионах раннего endosomes, которые экспонат multivesicular внешний вид. Эти регионы расширить и на отрыв от ранних мембран от англ, в конечном итоге Зрелые в свободной от англ перевозчик везикулы или multivesicular органов (ECV/MVBs), которые отвечают за грузового транспорта на конце endosomes1, 2.

Актина играет решающую роль в процессе реконструкции мембраны, связанные с endosome биогенеза сортировки потенциала от англ. Сортировка по утилизации пути к плазматической мембраны или TGN белка зависит от связанных белков и retromer комплекс. Этот механизм сортировки, как представляется, быть связан к формированию рециркуляции трубочки через взаимодействия retromer комплекс, с WASP и шрам гомолог (ВСГ) сложной и разветвленной актина3,4,5 . В отличие от молекул предназначенных для деградации, особенно активации сигнализации рецепторов, в внутрипросветная везикулы (ILVs), сортируются от англ, сортировка комплексы для транспорта (ESCRT)2,6, 7. Хотя возможная роль актина в процессе сортировки зависит от ESCRT не известно, F-актина играет важную роль в биогенеза ECV/MVBs и транспорта за ранней endosomes. В частности мы обнаружили, что annexin A2 связывает холестерин обогащенный регионов ранних endosome и вместе с spire1, зарождается F-актина полимеризации. Формирование сети разветвленной актина, наблюдается на endosomes требует ветвления деятельность связанных с актина белка (ARP) 2/3 комплекс, а также moesin белка ERM и актин связывания белка cortactin8,9.

Здесь мы описываем микроскопии основанные в vitro assay, который восстанавливает нуклеации и полимеризации F-актина на начале от англ мембраны в пробирках. Ранее был использован этот assay расследовать роль annexin A2 в F-актина нуклеации и moesin и cortactin в формировании от англ актина сети8,9. Этот протокол в пробирке серии сложных реакций, которые происходят на endosomes в процессе полимеризации актина стать поддаются биохимических и молекулярных анализ последовательных шагов этого процесса, включая актина нуклеации, линейный полимеризация, ветвления и сшивки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. решения и препараты

Примечание: все буферы и решения должны быть подготовлены в двойной дистиллированной (dd) H 2 O. Потому что меняется состояние гидратации сахарозы, конечная концентрация всех решений сахароза должна определяться с помощью рефрактометра.

  1. Подготовить фосфат амортизированное saline без двухвалентной катионов (PBS-): 137 мм NaCI, 2,7 мм KCl, 1,5 мм х 2 PO 4 и 6,5 мм Na 2 HPO 4. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4. Стерилизация автоклавированием (1 цикл при температуре 121 ° C 15 мин) и хранить при комнатной температуре.
  2. Подготовить Стоковый раствор 300 мм имидазола: 0,204 g имидазола в 10 мл ddH 2 O.Adjust рН 7,4 на 4 ° C, с использованием HCl. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и хранить при 4 ° C.
  3. Подготовка гомогенизации буфера (HB; подготовки приблизительно 100 мл): 250 мм сахарозы в 3 мм имидазола. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 на 4 ° C, с помощью рН метр. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C. дополнение HB непосредственно перед использованием с коктейлем ингибиторов протеазы в окончательный концентрациях, соответствующий 10 мм leupeptin, А pepstatin 1 мм и 10 нг/мл Апротинин.
  4. Для размещения градиентов шаг, подготовить 62%, 39% и 35%-ая сахароза решения в 3 мм имидазола, рН 7,4, как описано ниже. Точно определить окончательный концентрации всех решений сахарозы с помощью рефрактометра.
    1. Подготовить 100 мл раствора сахарозы 62% в 3 мм имидазола, рН 7,4. Растворяют путем перемешивания 80.4 г сахарозы в ddH 2 O предварительно разогретую до 35 ° C. Добавить 1 мл 300 мм имидазола Стоковый раствор и заполнить до 100 мл с ddH 2 O. Adjust рН 7,4 на 4 ° C. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и магазин при 4 ° C.
    2. Подготовить 100 мл раствора сахарозы 35% в 3 мм имидазола, рН 7,4. Растворяют путем перемешивания 40.6 г сахарозы в ddH 2 O. Добавить 1 мл 300 мм имидазола Стоковый раствор и заполнить до 100 мл с ddH 2 O. Регулировка рН 7,4 на 4 ° C. фильтр-стерилизации с помощью 0,22 мкм поры размер фильтра и хранить при 4 ° C.
    3. Подготовка 50 мл 39% сахарозы в 3 мм имидазола, рН 7,4. Разбавьте раствор сахарозы 62% 35% раствором сахарозы. Хранить при 4 ° C.
  5. Растворить 3 g параформальдегида (PFA) путем перемешивания в 100 мл PBS-предварительное warmed до 60 ° C при добавлении 1 M NaOH каплям; настроить окончательный рН 7,4, с использованием NaOH. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при -20 ° с.
    Предупреждение: 3% PFA является токсичных реагентов.
  6. Раствор готовят 1 M KCl. Распустить 3.73 г KCl при перемешивании в 50 мл ddH 2 O. фильтр-стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре.
  7. Подготовка 50 X сосредоточены акций раствор, содержащий 0,625 М Hepes pH 7.0 и 75 мм MgOAc 2 ddH 2 O. Алиготе и хранить в -20 ° с.
  8. Подготовка монтажа среднего. Смесь, помешивая 2.4 g poly(vinyl alcohol) M w ~ 31000 (ПВА) с 6 г глицерина. Добавить 6 мл ddH 2 O и оставить по крайней мере 2 ч при комнатной температуре. Добавить 12 мл 0,2 М трис-Cl (рН 8,5) и тепла к ° C приблизительно 53 с иногда помешивая, пока не растворится ПВА.
  9. Уточнить решения центрифугированием в 5000 x g 20 мин при комнатной температуре. Собирать супернатант и добавить 2,5% (w/v) 1,4 - diazabicyclo-[2.2.2] октана (DABCO) для предотвращения Фотообесцвечивание во время флуоресценции обнаружения. Вортекс для около 30 s распустить. Аликвота в 1,5 мл пластиковых трубок и хранить при -20 ° с.

2. Клеточные культуры

  1. культуры НеЬа клетки в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего дополнена плода теленка 10% сыворотки, 10% несущественные аминокислот, 10% L-глютамином и 1% пенициллин стрептомицином. Поддерживать их при 37 ° C в 5% CO 2 инкубатора.
  2. Transfect клетки 24 h перед эксперимент с GFP-RAB5 10, используя коммерческие трансфекции реагента по заявлению производителя ' s инструкции.
  3. При необходимости, подготовить дроби от англ и цитозоле от клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих форму wildtype или мутанта протеина интереса.

3. Подготовка дроби от англ

Примечание: этот протокол описывает простой подготовке субцеллюлярные фракций, содержащих endosomes и другие легкие мембраны. При необходимости, очищенный endosome фракции также может быть использоваться 11. Готовить 2 чашки Петри (наружный диаметр 10 см; 57 см 2) вырожденная клеток, выражая GFP-RAB5 как исходный материал. Общее количество вырожденная клеток HeLa в 2 чашки Петри примерно соответствует 2,5 x 10 7 клеток. Когда необходимо, endosomes также может быть получен из клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих форму wildtype или мутанта протеина интереса, всегда выражая GFP-RAB5.

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: все шаги фракционирование протокола должна быть выполнена на льду

  1. Петри на влажной металлической пластиной в плоский ведро льда и немедленно вымыть клетки дважды с 5 мл ледяной PBS-.
  2. Удаления всех PBS - из последнего мыть и добавить 3 мл ледяной PBS-за блюдо. Клетки не должна сохнуть при обработке: в случае необходимости, место ведро льда на качающейся платформе адекватно охватывать клетки с жидкостью.
  3. Механически удалить ячейки в PBS из Петри, используя гибкий резиновый полицейский (т.е., домашний мобильный волокуши). Скрип клетки от блюда сначала в быстро, круговые движения вокруг вне блюдо, следуют нисходящего движения в середине блюдо. Скрип осторожно, чтобы получить " листы " прилагаемый клеток. Аккуратно перенести ячейки, используя пластиковые пипетки Пастера с широким отверстием 15 мл конические полипропиленовые трубы на ice.
  4. Центрифуги для 5 минут при 175 x g и 4 ° C.
  5. Осторожно удалить супернатант (СН) и добавить 1-3 мл HB в гранулы. С помощью Пластиковая пипетка Пастера с широким отверстием, нежно Пипетка вверх и вниз один раз чтобы Ресуспензируйте клетки.
  6. Центрифуги для 7-10 мин в 1355 x g и 4 ° C. Осторожно удалить SN.
  7. Выполняют клетки гомогенизации.
    Примечание: Условия должны быть нежным, так что плазменных мембран клеток разбиты, но endosomes остаются нетронутыми.
    1. Добавить известный объем HB с ингибиторами протеазы на каждой ячейки Пелле (примерно 100 мкл в Пелле клеток). Аккуратно с помощью микропипеткой 1000 мкл, Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока высокомобильна клетки. Не надо ввести воздушных пузырьков.
    2. Подготовить туберкулин 1 мл шприц с иглой 22G предварительно промыть HB и свободного воздуха или пузырьков.
    3. Наполните шприц суспензию клеток сравнительно медленно (чтобы избежать создания пузырьков воздуха), место среза кончик иглы к стене трубы и высылать суспензию клеток быстро для сдвига от мембраны плазмы клеток прилагаемый.
    4. Взять небольшой Алиготе огневки (примерно 3 мкл) и развести его в 50 мкл HB на стеклянное скольжение. Mix и крышка с coverslip стекла. Осмотрите огневки под микроскопом фазово контрастной оснащены 20 X или 40 X цель.
      Примечание: При оптимальных условиях, большинство клеток нарушена, но не являются ядра, которые появляются как темно-серый и круглых структур, ( рис. 1).
    5. Повторите шаг 3.7.3 и 3.7.4 до большинства клеток сломанной; как правило, необходимы 3-6 прихваченного ударов через иглу. Храните небольшой Алиготе (10-30 мкл) огневки для определения белков.
  8. Гомогенат трутневых центрифуги для 7 мин в 1355 x g и 4 ° C.
    Примечание: после центрифугирования, гранулы (определяемой как ядерной гранулы; NP) содержит ядра и супернатант (определяемой как шпагу супернатант; ПНС) содержит цитозоле и органеллы, выпущенный после гомогенизации и свободного подвеса.
  9. Тщательно собирать ПНС. Держите небольшой аликвоты (10-30 мкл) векселей и NP для определения белков и отбросить NP.
  10. Отрегулировать ПНС на 40,6% сахарозы, разбавляя 62% раствор сахарозы с ПНС, с использованием коэффициента 1:1.1 PNS:62% сахарозы. Смесь осторожно, но тщательно, не создавая пузырьки воздуха. Проверка концентрации сахарозы с помощью рефрактометра.
  11. Место ПНС в 40,6% сахарозы в нижней части трубки ultracentrifugation. Наложение тщательно с 2,5 мл раствора сахарозы 35% и заполнить пластиковых пробирок с HB.
    Примечание: Сахароза решения следует слоистых интерфейсов явно видны.
  12. Ультрацентрифуга градиенты на 1 ч в ̴165, 000 x g и 4 ° C.
  13. Тщательно удалить белый слой липидов на вершине градиента. Далее, собирать интерфейс, содержащий endosomes, между HB и 35%-ая сахароза, используя 200 мкл микропипеткой с вырезать кончик.
    Примечание: Дроби от англ может использоваться непосредственно в assay актина полимеризации в пробирке или может быть aliquoted на льду, флэш замороженные в жидком азоте и хранятся на -80 ° C.
  14. Определения концентрации белковых фракций ПНС и от англ.
    Примечание: Эта концентрация должна быть по крайней мере 100 мкг/мл. Примерно 2,5 x 10 7 клеток, выращиваемых в 2 чашки Петри необходимы для получения ПНС с по крайней мере 100 мкг/мл (см. примечание выше).

4. Цитозоль подготовка

Примечание: подготовка 2 чашки Петри (диаметр 10 см; 57 см 2) вырожденная клеток HeLa как исходный материал. При необходимости, цитозоле также может быть получен из клетки истощены протеина интереса (то есть, используя RNAi или ТРИФОСФАТЫ/Cas9) и/или экспрессирующих wildtype или мутантные формы протеина интереса. Что касается протокола endosome фракционирования, все шаги должны выполняться на ice.

  1. Повторите пункты 3.1-3.8.
  2. Место ПНС в пластиковых пробирок и ультрацентрифугирования 45 мин в ̴250, 000 x g и 4 ° C.
  3. Тщательно удалить белый слой на вершине и собирать SN (цитозоль фракция) не нарушая микросомы Пелле. Держите Алиготе цитозоль дроби для определения белков.
    Примечание: Цитозоль может использоваться непосредственно в assay актина полимеризации в пробирке или может быть aliquoted на льду, флэш замороженные в жидком азоте и хранятся на -80 ° C.
  4. Определить концентрацию белка цитозоль.
    Примечание: Он должен быть по крайней мере 3 мг/мл.

5. Assay измеряя Endosome зависимых актина полимеризации В пробирке

Примечание: Endosome зависимых актина полимеризации может производиться с использованием двух альтернативных подходов. Первый подход материалы смешиваются в пробирке, фиксированной и переведен в coverslip и проанализированы. Второй подход, описанный здесь assay может осуществляться непосредственно в тепловизионной камере и можно фиксированной и анализировать без механических возмущений ( рис. 2 c). В этой второй подход пробирного смесь не передается из пробирки coverslip и таким образом остается невозмущенной, уменьшение опасности F-актина сетей, будучи физически возмущенных во время передачи. Кроме того этот второй подход совместим с покадровый анализ F-актина полимеризации. Следует отметить, что с любой подход было отмечено никакой разницы в анализе F-актина полимеризации.
Примечание: Использование вырезать советы по всему протоколу.

  1. В пробирке
    1. нежно микс ледяной очищенный GFP-RAB5 endosomes (шаг 3) с цитозоле (шаг 4) в соотношении 1:10 (концентрация белка) в ледяной 1,5 мл коническую пробирку.
      Примечание: Типичный эксперимент проводится с приблизительно 40-50 мкл.
    2. Настроить ледяной реакционную смесь для окончательного концентрации 125 мм KCl (с помощью Стоковый раствор KCl 1 М), 12,5 мм Hepes и 1,5 мм MgOAc 2 (с использованием 50 x Стоковый раствор). Затем настройте в смеси с ингибиторами протеазы для окончательного концентрации leupeptin 10 мм, 1 мм pepstatin A и 10 нг/мл Апротинин. Осторожно смешать все компоненты.
    3. И инкубировать на требуемое время и место пробирки, содержащие реакционной смеси при 37 ° C без встряхивания,.
      Примечание: Как правило, это займет примерно 3 мин для обнаружения актина полимеризации на endosomes и 30 минут для формирования широкой сети.
    4. В нужный момент (т.е., 3 мин или 30 мин), остановить реакции, поместив пробирки на льду и добавить 1/10 (vol:vol) помощи 3% раствора PFA.
    5. Добавить 0.3:10 (vol:vol) из 200 единиц/мл (~6.6 мкм) Фаллоидин спрягаются в красно оранжевый краситель пятно полимеризованной актина.
    6. Место 12 мкл смеси на 12 мкл ПВА монтажа среды на слайде микро стекла. Положить сверху coverslipon стекла 18 x 18 мм 2.
    7. Анализ образца с confocal микроскопии.
  2. В тепловизионной камере
    1. сделать микроскопических тепловизионных камер, используйте плазмы пылесос за 1 мин для очистки круглые диаметром 18-мм coverslip и круглых 35 мм диаметр Петри с низа стекла 20 мм (0,16-0,19 мм).
    2. Инкубировать очищенные поверхности с 1% β-казеина для 20 минут свести к минимуму связывания белков на стекло. Мыть дважды с 3 мм имидазола.
    3. Добавить endosome и цитозоле, в том же пробирного смесь как шаги 5.1.1 и 5.1.2, к помощи 1,5 мл пробирку и дополняют пробирного смесь с 0,1 мкг/мкл родамин актина.
    4. Настроить окончательный преломления смеси 1.375 (26,5% сахарозы) 39% раствором сахарозы.
      Примечание: Как правило, добавляется того же объема; Однако, это должно быть эмпирически повторно скорректированной, в зависимости от концентрации сахарозы собираемой фракции, определяется с использованием refractomer, так как концентрация сахарозы может слегка изменить от эксперимента к эксперимент.
    5. Поместить смесь в предварительно обработанные блюдо 35-мм (шаг 5.2.1) и залить предварительно обработанные coverslip 18-мм (шаг 5.2.1).
    6. Место палата при 37 ° C без встряхивания.
    7. Анализ образца с помощью конфокальной микроскопии флуоресцирования.

6. Внешние изображенияние анализа актина сети и

  1. захвата изображений
    1. приобрести изображений на Перевернутый Сканирующий конфокальный микроскоп.
      Примечание: Приобретение параметры изображения были оптимизированы для Перевернутый Сканирующий конфокальный микроскоп с целью нефти NA 63 X 1,25. Отрегулируйте мощность лазера (обычно около 50%), для достижения хорошее соотношение сигнал шум.
  2. Количественное определение сети актина
    1. анализ флуоресцентной микроскопии. Использование программного обеспечения с открытым исходным кодом CellProfiler (v2.1.1) 12 измерить количество актина за endosome (альтернативное программное обеспечение может использоваться).
      1. Во-первых, определить endosomes как основной объект с помощью GFP-RAB5 сигнал. Затем, количественно F-актина, связанные с отдельными endosomes, используя распространение сигнала актина (красно оранжевый краситель конъюгированных Фаллоидин) как вторичные объект.
      2. Средняя и нормализует количество связанного материала для каждого объекта в состояние элемента управления.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы получить понимание формирования F-актина патчи на ранних endosome мембраны, мы следовали протокол, изложенные на рисунке 2. Вкратце были transfected клеток с GFP-RAB5 и затем раннего endosomes были подготовлены субцеллюлярные фракционирования. Эти чистые раннего endosomes инкубировали с цитозоле обеспечить актина сам, а также другие факторы, возможно, участвующих в реакции. В конце инкубационного периода реакция была остановлена фиксации смеси. Образец ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Актин играет решающую роль в endosome мембраны динамика4,14. Мы ранее сообщали, что актина нуклеации и полимеризации происходит на начале endosomes, образуя небольшие F-актина патчи или сетей. Эти сети F-актина абсолютно необходимы для мембранный транспорт за пределами ранних endosomes по пути деградации. Вмешательства на любом этапе этого процесса нуклеации и полимеризации предотвращает endosome созревания и, таким образом, ниже по течению транспорта к поздно en...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Поддержка была получена от швейцарского национального научного фонда; Швейцарская компания "Синергия" программы; Польско Швейцарский исследований программы (PSPB-094/2010); NCCR в химической биологии; и LipidX из швейцарской SystemsX.ch инициативы, оцениваются как Швейцарский Национальный научный фонд (с J. G.). О. м. была поддержана EMBO долгосрочных стипендий (ALTF-516-2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NaClSigma-Aldrich71380
KClAcros Organics196770010
KH2PO4AppliChemA1042
Na2HPO4Acros Organics424370025
HepesAppliChemA3724
Магнезиун ацетата тетрагидратFluka63047
Дитиотреитол (DTT)AppliChemA2948
ИмидазолСигма-Олдрич10125
NaOHFluka71690
СахарозаMerck Millipore107687
ЛейпептинРош11017101001
ПепстатинRoche10253286001
AprotininRoche10236624001
ParaformaldehidePolysciences. Inc380
Alexa Fluor 555 фаллоидинмолекулярные зондыA34055
актин родаминцитоскелет. IncAPHR-A Mowiol
4-88Sigma-Aldrich81381поли(виниловый спирт), Mw ~31 000
DABCOSigma-AldrichD-2522
Tris-HClAppliChemA1086
&бета;-казеинSigma-AldrichC6905
Фильтр 0,22 mMillexSL6V033RS
Круглая 10 см посуда для клеточной культурыThermo Fisher Scientific150350
Пластиковая пипетка ПастераAssistent569/3 40569003
15-мл полипропиленовая трубкаTPP91015
Игла для подкожных инъекций 22G Черная 30 ммBD Microlance300900
Стерильная люэр-слип 1 мл Шприцы без иглаBD Plastipak300013
Микростекла слайдыAssistent2406
18 x 18 мм стеклянная покровная трубкаAssistent1000/1818
SW60 центрифужная трубкаBeckman344062
центрифужная трубка TLS-55Сошник Beckman343778
200-μ L желтый наконечникStarlabS1111-0706
1,000-μ L Синий градуированный наконечникStarlabS1111-6801
1,5 мл пробиркаAxygenMCT-175-C 311-04-051
Круглый покровный лист диаметром 18 ммAssistent1001/18
Круглая чашка диаметром 35 мм со стеклянным дном 20 мм (0,16 - 0,19 мм)In vitro ScientificD35-20-1,5-N
РефрактометрCarl Zeiss79729
ПлазмоочистительHarrick PlasmaPDC-32G
Sorvall WX80 УльтрацентрифугаThermo Fisher Scientific46900
Настольная ультрацентрифугаBeckmanTL-100
SW60 РоторBeckman335649
ротор TLS-55Сошник Beckman346936
Конфокальная микроскопияCarl ZeissLSM-780
Реактив для трансфекции Fugene HDPromegaE2311
Реактив для анализа белка ABio-Rad500-0113
Реактив для анализа белка BBio-Rad500-0114
Реактив для анализа белка SBio-Rad500-0115
Скребок для клетокДомашнийКусок силиконовой резины около 2 см, разрезанный под очень острым углом и прикрепленный к металлическому стержню или удерживаемый щипцами
РефрактометрCarl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Sigma-AldrichM0643
FCS ThermoFisher Scientific10270-106
MEM Заменимые аминокислоты (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140-035
L-глютаминThermo Fisher Scientific25030-024
Пенициллин-стрептомицинThermo Fisher Scientific15140-122
pH-метр 691Metrohm
ImageJ программное обеспечениеNIH, Bethesda MD

Ссылки

  1. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  2. Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
  3. Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
  4. Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up! Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
  5. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774(2014).
  6. Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
  7. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
  8. Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
  9. Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
  10. Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
  11. Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
  12. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  13. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  14. Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
  15. Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
  16. Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
  17. Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616(2014).
  18. Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Полимеризация F-актинаанализ in vitroфлуоресцентная микроскопиясахарозный градиентцитозольная фракцияэндосомальная фракциянуклеация актинаокрашивание фаллоидиномконфокальная микроскопия
В пробирке Полимеризация F-актина на ранних Endosomes
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.