Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55832

⸱

28 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

В этой статье

Краткое содержание

Представлен в vitro assay биолюминесценции для определения сотовой Циркадный ритм в эпителиальных клетках молочной железы. Этот метод использует mammalian клетки репортер плазмид, выражая дестабилизировали Люцифераза под контролем промотора гена период 2 . Она может быть адаптирована для других типов клеток, оценить эффекты органоспецифическая на суточный ритм.

Аннотация

Циркадный ритм процесс основных физиологических настоящее во всех организмах что регулирует биологические процессы, начиная от экспрессии генов спать поведение. В позвоночных суточный ритм контролируется молекулярной осциллятор, который функционирует как Супрахиазмальное ядро (SCN; Центральная кардиостимулятора), так и отдельных ячеек, состоящий из наиболее периферических тканей. Что еще более важно нарушения циркадного ритма воздействием света ночью, экологических стрессоров или ядовитых веществ связаны с повышенным риском хронических заболеваний и старения. Способность определить агенты, которые могут нарушить Центральной или периферической биологические часы и агенты, которые могут предотвратить или смягчить последствия нарушения циркадного, имеет существенные последствия для профилактики хронических заболеваний. Хотя грызунов модели могут использоваться для определения воздействия и агентов, которые вызывают или предотвращения и смягчения суточного нарушения, эти эксперименты требуют большого количества животных. В vivo исследования также требуют наличия значительных ресурсов и инфраструктуры и исследователей работать всю ночь. Таким образом существует настоятельная необходимость для камерного типа соответствующие в vitro системы экран для окружающей среды суточного разрушители и усилители в типах клеток от болезни государств и различных органов. Мы построили вектор, диски транскрипции дестабилизировали Люцифераза в эукариотических клетках под контролем промотора гена человека период 2 . Эта конструкция суточного репортер был стабильно transfected в человеческих эпителиальных клеток молочной железы, и суточного реагировать репортер клетки были отобраны развивать пробирного биолюминесценции в пробирке . Здесь мы представляем подробный протокол для создания и проверки assay. Далее мы подробно для доказательства концепции экспериментов, демонстрирующих способность нашего анализа в vitro пилки в vivo воздействию различных химических веществ на клеточном биологические часы. Результаты показывают, что assay может быть адаптирована для различных типов клеток для окружающей среды разрушители и заметкой усилители суточного часов.

Введение

Суточный часов регулирует широкий круг биологических процессов от суточного экспрессии генов спать поведение в предсказуемый ритм с периодичностью около 24 ч. эпидемиологические исследования показывают, сильно, что хроническое нарушение суточного ритм увеличивает риск рака груди и рака простаты в сдвиг рабочих, включая медсестер и рейс экипажей1,2,3. Эти выводы подтверждаются грызунов исследования, демонстрируя что подверженность постоянный свет, свет ночью, или света циклов, которые имитируют биоритмов увеличение распространенности опухоли и ускоряет рост опухоли4,5. Основываясь на данных исследований, как людских, так и грызунов, международное агентство по изучению рака классифицируются посменной работы как вероятный канцероген человека (тип 2A) в 20106.

Ранее мы показали, что канцерогенные однократным введением конкретных канцерогенов молочной железы опухоль, N- нитрозосоединения-N- methylurea (НГУ), нарушается суточного выражение основных суточного генов (СГС) (например, период 2 , Per2) и несколько суточного контролируемой генов (CCGs), включая основные повреждения ДНК реагировать и ремонт генов (РДРР) в целевой молочной железы (но не в печени). Кроме того, Сброс суточного выражение генов Per2 и РДРР к нормальной с заметкой режим питания L-метил-Селеноцистеин (MSC) снижению заболеваемости опухоли на 63%. Эти выводы были первыми, чтобы показать механистический связь между Циркадный ритм, химического канцерогенеза и химиопрофилактики7,8. Воздействия других экологических токсикантов, показано сорвать суточного ген выражение в естественных условиях , также связаны с повышенным риском экологических болезней9,10. Понимание механизмов, которые связывают суточного нарушения экологических токсикантов и патогенез может привести к механически-подходов к профилактике заболеваний. Однако, исследования, направленные на определение взаимодействий между воздействия и суточный ритм обычно выполняются в vivo. Типичная в естественных условиях эксперимента расследование влияние на суточный ритм требует большого количества животных, как контролировать тканей из по меньшей мере три и три подвергаются животные должны быть собраны каждые 3-4 ч в течение 24 или 48 часов. Разработка проверенных в vitro системы, которая резюмирует наблюдений в естественных условиях и механизмов будет поэтому не только уменьшить количество животных, необходимых, но также значительно сократить расходы на экспериментальной и требование, Исследователи работают непрерывно в течение 24-48 ч. Кроме того проверенных в vitro система может использоваться для проверки высокой пропускной способности соединений и/или генетические изменения, которые влияют на суточный ритм, или его ответ на экологических стрессоров или ядовитых веществ. Поэтому стратегическое сочетание in vitro и in vivo моделей и экспериментов необходимы для получения различных идеи с другой фокус.

В млекопитающих суточного осцилляторов существуют не только в специализированных нейронов ППП, но и в самые периферийные типы клеток. Эти молекулярные часы аналогичны в установленных фибробластов клеточных линий и в первичной фибробласты из зародышей или взрослых животных; Однако есть потребность тканей конкретного типа сотовой модели11. Следовательно традиционные исследования двигательной активности в естественных условиях, SCN эксплантах ex vivo, и на основе ячеек в vitro анализов в увековечен фибробластов клетки широко используются для изучения клеток автономная суточного дефектов. Однако нет никаких свидетельств, указывающих, что в vitro фибробластов на основе ячеек assay может резюмировать суточного механизмов и ответы присутствует в клетках других периферийных органов в естественных условиях. Различных типов клеток могут иметь различные шаблоны экспрессии генов, метаболизма ксенобиотиков и РДРР, и связей между токсичности и суточного ген выражение может быть типа клеток специфического и/или модулированный в различных физиологических параметров. Кроме того суточного осцилляторов в системах на базе фибробластов еще не были полностью оценены для ответов на экологических токсикантов, стресс и превентивной агентов, которые связывают воздействия механизмы развития заболевания и профилактика. Таким образом существует необходимость для конкретных снисходительный, одобренного типа клеток, в пробирке биолюминесценции анализов для изучения конкретных экологических суточного Разрушители орган. Хотя целый ряд моделей сотовых будильник (например, в печени, кератиноциты и жировых клеток, а также линия клетки остеосаркома) были разработаны в последние годы12,13,14, 15, проба, описанные здесь это первая модель сотовой будильник в эпителиальных клеток молочной железы и первой демонстрации резюмировать в vivo ответы на экологических стрессоров, ядовитых веществ, наркотиков и заметкой агентов.

Renilla Люцифераза (rLuc) и Светлячок Люцифераза являются 30-61 кДа мономерных белков, которые не требуют Посттрансляционная обработки для ферментативной активности и может функционировать в качестве репортера генетических сразу же после перевода. После того, как субстрат связывает с Люцифераза фермента, биохимические реакции катализированные генерирует вспышка света. Таким образом Люцифераза конструкции широко используются как ген выражение репортер системы в пробирке и в естественных условиях. Однако, в исследованиях Циркадный ритм, Утилита Люцифераза репортер ограничивается относительно долгий период полураспада Люцифераза белка (T1/2 = 3,68 h) по сравнению с периодом (особенно в короткий период) для изменения в суточный гена выражение; Однако многочисленные исследования с годами успешно использовали Люцифераза гена в pGL3 вектор, указывающий, что быстро разлагаются Люцифераза не может быть необходимым для отчетности циркадные ритмы, особенно для ритмы с более длительного периода, такие как 24 ч. Поэтому репортер плазмида с использованием вектора дестабилизировали Люцифераза, pGL [Luc2P/Neo], который содержит hPEST (последовательность дестабилизации белка) был разработан, позволяя нам использовать его как вектор суточного репортер для наших текущих в пробирке пробирного биолюминесценции. Белков, кодируемых Luc2P имеет более короткий период полураспада (T1/2 = 0,84 h) и следовательно, реагирует быстрее и с большей величины изменения в транскрипционный анализ активности, чем одичал тип, яndicating, что он может быть использован для мониторинга ритмические выражения Люцифераза, регулируется PER2 промоутер точно в режиме реального времени16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Строительство PER2 промоутер Driven дестабилизировали Люцифераза репортер вектора

  1. приобрести индивидуальные pLS [hPER2P / rLuc / Puro] вектор, содержащий cDNA кодировки rLuc и человека Фрагмент PER2 промоутер (hPER2P, 941 bp) на участке между мешка I и Хинд III в несколько клонирования региона 17.
  2. Вырезать фрагмент промоутер человеческого PER2 (hPER2P, 941 bp) вне от вектора.
    1. Добавить 2,5 мкл буфера энзима ограничения, 10 мкл (180 нг) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] вектор и 1 мкл энзимов ограничения, Sac I (10 блок/мкл) и III Хинд (10 блок/мкл), в ДНК/РНК/нуклеотидные бесплатно Microcentrifuge трубки. Добавьте ультрачистая вода (10.5 мкл) до 25 мкл и перемешать аккуратно, закупорить.
    2. Инкубировать при 37 ° C 90 мин в блоке Отопление.
    3. Выполнить весь объем (25 мкл) реакции энзима ограничения на 0,7% агарозном геле, содержащие бромид ethidium 0,0001% (бромистый этидий), чтобы отделить hPER2P от вектора.
      Примечание: Бромистый этидий, 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium бромид (регистрационный номер КАС: 1239-45-8), является красная жидкость без запаха. Это интеркалирующего агента, который часто используется как флуоресцентные метки (нуклеиновых кислот пятна) в электрофорезе геля агарозы и видно, как оранжевый цвет под ультрафиолетовым светом. Возможные риски необратимых мутагенных эффектов произошли в экспериментальных животных, хотя ни одно из нормативных учреждений классифицировать его как канцероген 18. Таким образом, мы собрали используется агарозы гель и электрофорез буфер, содержащий бромистый этидий как отходы химической опасности и просил Ратджерс санитарной & безопасности (REHS) забрать и безопасно распоряжаться.
    4. Вырезать кусок геля агарозы, содержащих бромистый этидий флуоресценции band в 941 bp и очистить hPER2P фрагменты от геля с комплектом экстракции ДНК гель, следуют количественная оценка на спектрофотометре путем измерения поглощения плотность (OD) на длине волны 260 Нм.
  3. Линеаризации 1.0 мкл (1 мкг) Люцифераза вектора выражения дестабилизировали Светлячок, pGL [Luc2P / Neo] с тем же методом, как описано в шагах 1.2.1-1.2.2. Экстракт вектор с комплектом очистке ДНК, следуют количественной оценки, как описано выше с помощью спектрофотометра.
  4. Перевязать hPER2P в pGL линеаризованного вектора [Luc2P / Neo].
    Примечание: за производителя ' s инструкция, идеальный молярное соотношение вставки и вектор-2:1. Для 50 ng вектора, идеальное количество Вставка рассчитывается как 23,6 нг с вектором КБ формула, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242] x (2/1) = 23,6 ng вставки]. Основанный на концентрации hPER2P (7,26 нг/мкл) и pGL [Luc2P / Neo] (50 нг/мкл), объемы 50 нг pGL [Luc2P / Neo] и 23,6 нг hPER2P рассчитывается как 1 мкл и 3.26 мкл, соответственно.
    1. Добавить 2 мкл T4 ДНК лигаза реакции буфера (10 X) (50 мм трис-HCl, 10 мм MgCl 2, 1 мм СПС и 10 мм DTT), 3.26 мкл (23,6 нг) hPER2P, 1 мкл (50 нг) pGL [Luc2P / Neo], и 13.74 мкл воды до 20 мкл , осторожно перемешать.
    2. Добавление T4 ДНК лигаза 1 мкл (400 блок/мкл), осторожно перемешать и Инкубируйте на 16 ° C ночь в Термоциклер и затем охладить перевязаны вектора на льду за производителя ' s инструкция.
  5. Превратить pGL перевязаны вектор [hPer2P / Luc2P / Neo] для химически сведущее Escherichia coli 19.
    1. Установить водяной бане при 42 ° C, подогревают супер оптимального бульон с catabolite репрессий (S.O.C.) средний (2% Триптон, 0,5%, экстракт дрожжей, 10 мм NaCl, 2,5 мм KCl, 10 мм MgCl 2, 10 мм MgSO 4 и глюкозы 20 мм) при комнатной температуре , разогреть Бертани Лурия (LB) агар пластины (содержащий ампициллина 100 мкг/мл, 80 мкг/мл X-Гал и 0,5 мкм IPTG) в инкубаторе 37 ° C и оттаивания на льду один флакон сведущее Escherichia coli клетки для каждого преобразования.
    2. Добавить 6 мкл (21 нг) лигируют вектор или 1 мкл (30 нг) пустой вектор (отрицательный контроль) в одной из труб химически сведущее Escherichia coli (50 мкл) и затем осторожно перевернуть трубку смешивать. Инкубируйте на льду на 30 мин
    3. Тепловой шок в ванну воды 42 ° C за 30 s без встряхивания и затем вернуться к ice.
  6. Выберите E. coli колония преобразовано с вектором перевязаны с помощью скрининга синий/белый.
    1. Добавить 250 мкл S.O.C. среды в преобразованной кишечной трубки и проинкубируйте 1 ч при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
      2. 10-50 мкл преобразованные E. coli на поверхности плиты агара LB равномерно
    2. . Положите пластину вниз в инкубаторе 37 ° C ночь.
      Примечание: Эффективное клонирования реакции следует производить несколько сотен колоний. Покрытие двух различных томов рекомендуется обеспечить по крайней мере одна пластина будет ясно большой, белый или синий цвет и хорошо расположенные колоний. С помощью микроскопа (10 X или 50 X) полезно, когда колонии слишком малы, и цвет не различимы,.
    3. Выбрать 3-6 белых колоний от пластины палочками стерилизованные зуб и выпуск каждой колонии в одной культуре трубка, содержащая 4 мл LB питательной среды с 50 мкг/мл ампициллин.
    4. Инкубировать трубы при 37 ° C ночь встряхивании в 200 об/мин. Извлечь ДНК, используя 2 мл 4 мл культивированный E. coli с плазмида ДНК извлечения мини-приготовительная комплект за производителя ' s инструкция.
  7. Проверить и проанализировать insert (hPER2P, 941 bp)
    1. дайджест плазмида ДНК с энзимами ограничения и запустите электрофореза, как описано в 1.2.1-1.2.3 шаги для подтверждения, если есть вставки.
      Примечание: Положительный контроль (hPER2P, очищенная на шаге 1.2.4) отрицательный контроль (E. coli преобразована с пустой вектор) были включены и.
    2. Последовательность отдельных плазмида ДНК, используя M13 вперед и обратного M13 Праймеры для подтверждения ориентацию и последовательности вставки в плазмиду 19.
      Примечание: Была выбрана только одна колония, который имел инструкции insert с правильным размером hPER2P электрофореза и правильной ориентации и последовательность в результате секвенирования.
    3. Анализ фрагмента промоутер человеческого PER2 (hPER2P, 941 bp) последовательности для суточного регулирования элементов, включая E-бокс мотив (Bmal1 привязки сайта, CAT/ГКГТ), CCAATC, GC коробка и транскрипции начать сайта (CAGCGG) 20.
  8. Amplify выбранного E. coli, добавляя оставшиеся 2 мл культивированный E. coli в 200 мл LB питательной среды, содержащей 50 мкг/мл Ампициллин и затем инкубации на ночь при 37 ° C при встряхивании в 200 об/мин.
  9. Извлечь ДНК с макси бесплатно эндотоксина плазмидные Подготовьте комплект на Производитель ' s Инструкция и затем количественно измеряя ОД на 260 Нм длины волны с спектрофотометром. Алиготе и хранить плазмида ДНК, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], в морозильной камере-80 ° C для использования в будущем.

2. Переходных Transfection

  1. покупки и культура клетки MCF10A
    1. закупки строку увековечена, -трансформированных нормального человека молочной эпителиальных клеток (MCF10A) от коммерческого банк клеток, где клетки являются cytogenetically испытания и проверку подлинности с короткие тандемные повторить анализ перед замораживанием. Оттепель и поддерживать каждый флакон замороженных клеток в культуре для максимум 8 недель и.
      Примечание: В отличие от других клеток, эти клетки имеют контакт торможение, как только они добираются до места впадения ~ 70%. Он требует, что субкультуры проводится на ~ 70%.
    2. Культура клетки с средний рост эпителиальных клеток молочной железы (MEGM), содержащий молочной эпителиальных базальной среднего (MEBM), роста добавки и токсинного холеры в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2.
      Примечание: Покупка готовых к использованию факторы роста предусмотрено в SingleQuot (SQ) и получить токсин холеры отдельно. Окончательный концентрации добавки роста являются говядину гипофиза экстракт 0,4%, 0.1% инсулина, гидрокортизона 0,1%, 0.1% человеческого эпидермиса факторы роста, 100 нг/мл холеры токсин и 0,05% гентамицина сульфат и 0,05% амфотерицин B.
    3. Разбить ячейки в 10 см культуры блюдо по инкубации с 10 мл трипсина/ЭДТА для ~ 20 мин и затем нейтрализовать трипсина, добавив 10 мл трипсина, нейтрализуя решения. Собрать все клетки с HEPES буфер солевой раствор (HBSS).
    4. Подсчитать ячейки с Горяева под инвертированным микроскопом и рассчитать концентрацию подвеска одну ячейку, затем семена определенное количество клеток, при необходимости. Вихрем пластины тщательно, чтобы получить равномерное распределение ячеек в каждой плиты. Инкубировать клетки в инкубатор культуры клеток при 37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2.
      Примечание: Приобрести пакет реагент субкультуры, содержащих трипсина/ЭДТА, нейтрализуя раствор трипсина и HBSS использовать.
  2. Переходных transfection клеток с суточного вектор построен.
    1. Семян 2 x 10 5 MCF10A ячейки равномерно в 35 мм культуры блюдо с MEGM и расти до 20-30% слияния (на следующий день).
    2. Теплый вверх сокращение сыворотке СМИ (например, Opti-MEM) в 37 ° C водой ванны и трансфекции реагента при комнатной температуре за 30 мин разбавить плазмидной ДНК построена (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) для 30 нг/мкл с Эндо токсин бесплатно Буфер Tris-ЭДТА (TE) и держать при комнатной температуре.
    3. Подготовить смесь трансфекции плазмида в пробки microcentrifuge 1,5 мл, сначала добавляя 63.6 мкл теплой сокращение сыворотке СМИ, а затем Добавление 33.4 мкл (0,1 мкг) плазмидной ДНК и осторожно перемешать, дозирование, а затем наконец добавляя 3 мкл трансфекции Реагент непосредственно в центр трубки не касаясь стены. После перемешивания аккуратно, дозирование, держать при комнатной температуре за 30 мин
    4. Падение всего плазмида смесь (100 мкл) непосредственно на поверхность центр среды в пластине и затем осторожно перемешать путем встряхивания блюдо. Культура клетки в CO 2 инкубатора для дополнительных 48-72 ч.
      Примечание: Он предсказал, что высокая эффективность трансфекции будет при впадении в 40-70% этих клеток за счет ингибирования их контакта на ~ 70%. Таким образом, transfection работает лучший начиная с ~ 20% и остановка на ~ 70% слияния.

3. Создание Assay биолюминесценции В пробирке в временно Transfected клеток MCF10A

  1. голодать культивируемых клеток при впадении ~ 70% (после трансфекции для 48-72 ч) в MEBM без факторов роста для 24 h.
  2. Лечения клетки с агентом синхронизации (например, 50% лошадь сыворотки (HS)) в MEBM для 1,5 h в инкубатор CO 2.
    Примечание: Для подбора идеальной синхронизации агент, форсколин 10 мкм, 1 Нм мелатонина, дексаметазона 0,1 мкм, 50% HS и 100% SQ были сопоставлены с точки зрения суточного амплитуда и период в суточный вектор transfected клеток. Пустой вектор transfected клеток относятся с 100% SQ как отрицательный контроль.
  3. Pre-prepare 20 мл носитель (для 10 блюд культуры 30-мм), добавив 5 мл MEGM, 15 мл MEBM, 150 мкл рабочего раствора бикарбоната натрия, 200 мкл HEPES и 40 мкл люциферин складе раствор (50 мм) в 50 мл стерилизации пластиковых пробирок.
    Примечание: Окончательный концентрации каждого компонентов: 20% SQ и 20 нг/мл холеры токсин, 0,06% бикарбоната натрия, 1% пенициллина/стрептомицина и 10 мм HEPES. Разогреть в заранее подготовленные записи средних и стерилизовать ПБС 30 мин на водяной бане 37 ° C. Добавить 100 мкм люциферин непосредственно перед употреблением.
  4. Мыть клетки с теплой 1 x Дульбекко ' s, физиологический Phosphate-Buffered (D-PBS) для 3 раза после инкубации с агентом синхронизации, а затем добавьте 2 мл записи среднего.
  5. Уплотнение блюдо с классом стерилизованные покрытия с использованием силиконовой смазкой для предотвращения испарения и затем ярлык на стороне.
  6. Место в место внутри Люминометр запечатанном блюдо и включите опцию для сохранения местоположение файла в папке (подробно см. раздел 6).

4. Выбор стабильно Transfected клеток

  1. оптимизировать идеально G418 концентрация (800 мкг/мл) с кривой assay убить по заявлению производителя ' s Инструкция для выбора стабильно transfected клеток.
  2. После переходных трансфекции за 48 ч или 72 ч, субкультуры и семян клетки с MEGM в больших блюда в 5000 клеток/блюдо (100 мм). После 24 часов культуры в инкубатор культуры клеток (37 ° C, влажность 95% и 5% CO 2), лечить клетки с 800 мкг/мл G418, заменив старый среднего новый носитель, содержащий 800 мкг/мл G418 каждые 3-4 дня за 2 недели.
  3. Субкультуры, выжившие стабильно transfected колоний для 1-3 места с MEGM, содержащих 500µg/мл G418 для поддержания стабильной выражение hPer2P/Luc2P и замораживание в жидком азоте для будущего использования.
  4. Лечения 500µg/мл G418 после общего субкультура повторно выбрать населения стабильно transfected клеток, если интенсивность биолюминесценции в результате в vitro биолюминесценции пробирного постепенно снижается после использования в многих отрывках.

5. Обращения с химическими веществами

  1. на 48 ч или 72 ч после трансфекции, голодать клетки от факторов роста в MEBM за 24 ч.
  2. После синхронизации с 50% HS 2 h, лечить клетки с 0,25 мм или 0,5 мм nitrosomethylurea (НГУ), 20 Нм EX527 или 1 мкм cambinol за 1 ч в MEBM, содержащих 20% пл
  3. После мытья с 1 x D-PBS, добавьте записи средних содержащий 12,5 мкм MSC отдельно или в сочетании с 20 Нм EX527 или 1 мкм cambinol, чтобы клетки. Мониторинг биолюминесценции с люминометра.
  4. Лечения стабильно transfected MCF10A / PER2-dLuc клеток с Мичиганского университета в 0,5, 1 или 2 мм, EX527 на 40 Нм, или Cambinol на 2,0 мкм, за 1 ч после синхронизации с 50% HS и затем инкубации клеток в записи средних содержащий 12,5 мкм MSC или различных доз (5, 10 или 20 мкм) n ацетилцистеин (NAC). Поместите пластины в Люминометр, запись и сохраните биолюминесценции, Люминометр для 4-8 дней, как описано в разделе 3.6.
    Примечание: НМУ-метилированной Нитрозомочевина соединение с канцерогенными, мутагенными и тератогенными свойствами. НМУ алкилирующий агент прямого действия и имеет короткий период полураспада (T 1/2 = ~ 30 мин). Он стабилен в кислой условие (pH 4-5), но нестабильной в щелочной (рН 9-10) и при температурах за 20 ° C. Таким образом Блич 10% может использоваться как эффективный отключение агента для очистки поверхности скамьи и лаборатории изделия, потенциально загрязненных НМУ решенио. Оставшийся раствор вывезены и безопасно утилизировать, REHS. Основываясь на действия химических веществ, синхронизированных клеток может рассматриваться для короче раз прежде чем культивирование в носителе. Клетки могут также рассматриваться в средстве записи на более длительное время (несколько дней).

6. Сбор данных, анализ и презентация

Примечание: жизнеспособность клеток должна определяться с помощью стандартных методов (например, МТТ проба) после лечения клеток в том же концентрациях же раз указано. Все концентрации лечения, используемых в assay биолюминесценции в vitro были ниже, чем 30% летальная концентрация (LC30). Все эксперименты проводились в трех экземплярах и были представлены представителем результаты.

  1. После запечатывания блюдо (шаг 3.5), загрузить блюда на места в Люминометр, который хранится внутри инкубатор набор при 37 ° C без H 2 O и CO 2 и подключен к компьютеру.
  2. Нажмите " сохранить " и введите имена для папок и файлов, где будет сохранен записанный люминесценции сигнал от соответствующего блюдо.
    Примечание: Система обнаруживает сигнал люминесценции в режиме реального времени из клетки в блюдо на отдельных позиций. Сигналы переданы на компьютер с помощью 4-Фотон подсчет фотоэлектронный умножитель трубы и сохраняются и отображаются в компьютер, программное обеспечение сбора данных.
  3. Анализировать сигналы после записи для 4-7 дней, которые могут сопровождаться среднего изменения и непрерывной записи для второй недели при необходимости.
    Примечание: Для получения суточного параметров, включая этап, длина периода, амплитуда ритма и демпфирования курс, мы использовали Люминометр анализ программного обеспечения для анализа данных о биолюминесценции.
  4. Бестрендовости необработанных данных с работающей в среднем и анализировать лучшие подходит к синусоидальной волны, чтобы получить период, фаза, амплитуда и демпфирования ставка 21 , 22.
  5. Из-за высокой временной биолюминесценции после лечения и среднего изменения, исключить из анализа первого цикла данных.
  6. Для представления данных, участок необработанных данных (биолюминесценции, / s) против время (день или h). При необходимости, вычитается базовые данные могут быть отображены для сравнения амплитуды и фазы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Суточный биолюминесценции репортер вектор: человеческого PER2 промоутер driven выражение дестабилизировали Люцифераза вариант

Последовательности ДНК, включающий фрагмент 941 bp производного от человека промоутер PER2 , используется для построения вектор суточного репортер, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, впервые было проанализировано на наличие нормативных элементов, известных для регулирования суточный г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В клетках млекопитающих периодичности суточного часов регулируется взаимосвязанных транскрипционный анализ/трансляционная обратной связи. Гетеродимерами Bmal1 и часы или Npas2 регулирования суточного транскрипции путем привязки к элементам E-бокс в промоутеров ядра СГС, включая Per2 и плакатьи многочисленные CCGs4. Как они накапливаются в ячейке, гетеродимерами из за: Крик post-translationally изменения и перевезены в ядре для подавления будильник: Bmal1 транскрипционный анализ а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана 2012 общество токсикологии (ГНС)-компании Colgate Palmolive Грант для укрепляющий исследований (м. клык) и исследования международного сотрудничества Фонда животных и растений карантина агентства, Республика Корея (м. клык), и Грант NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжэн Чэнь (Макговерн медицинская школа при университете центра науки здоровья Техас в Хьюстон) за его полезные обсуждения, г-н Хуан Shao-An для его экспериментальной помощи и г-жа Кими наката для ее доказательство чтения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] векторSwitchGear GenomicsS700000кастомизированный вектор
pGL4.18[Luc2P/Neo] векторPromega9PIE673дестабилизированный вектор экспрессии люциферазы
T4 ДНК-лигазаInvitrogen15224041Для субклонирования
набора для клонирования TOPO TAInvitrogenK4500-02with One Shot TOP10 Химически компетентная кишечная палочка
Sac INew England BioLabsR0156SФермент рестрикции
Hind III-HFNew England BioLabsR3104SФермент рестрикции
CutSmart bufferNew England BioLabsB7204SБуфер фермента рестрикции
Набор для экстракции геля ДНКQiagen28704Очистка фрагментов ДНК из агарозного геля
Набор для очистки ПЦРQiagen28104Очистка ДНК
LB МодификацияМиллера TEKNOVAL8600Для трансформированной культуры E. Coli
LB Агаровая пластинаTEKNOVAL1902Для белого/синего отбора
QIAprep spin miniprep KitQiagen27104Для экстракции плазмидной ДНК
EndoFree plasmid maxi prep KitQiagen12362Для экстракции плазмидной ДНК
FuGene HDPromegaE2311Реагент для трансфекции
Opti-MEM восстановленная среда сывороткиInvitrogen31985-062Для трансфекции
MCF10A клеточная линияAmerican Type Culture CollectionCRL-10317Эпителиальные клетки молочной железы
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Среда для роста эпителия молочной железы
MEBMLonzaCC-3151Эпителиальный базальный
молочной железы MEGM SingleQuot KitLonzaCC-4136Поставки и Факторы роста
РеагентPackLonzaCC-5034Реагент для субкультур
D-PBS (10X)SigmaD1408Промывка клеток в чашках для культивирования
Ультрачистая дистиллированная водаInvitrogen10977Разбавить 10X D-PBS
Чашка для культуры тканей (35 мм)BD/Falcon353001чашка для клеточной культуры, подходящая для LumiCycle
Силиконовая смазкаFisherNC9044707Для запайки чашки с носителем информации
Круглое покровное стеклоHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Для запайки чашки с носителем
Токсин холерыSigmaC8052Добавка для питательной среды
G418 сульфат (Генитицин)Инвитроген10131035Антибиотик для отбора установленных трансфицированных клеток
АмпициллинSigmaA9393Для селекции колоний
ФорсколинSigmaF6886Синхронизирующий агент
МелатонинSigmaM5250Синхронизирующий агент
ДексаметазонSigmaD4902Синхронизирующий агент
Лошадиная сывороткаSigmaH1138Синхронизирующий агент
d-люциферин, натриевая сольИнвитрогенL2912Субстрат люциферазы
IC261Sigma10658Положительный контроль для разрушителя циркадных ритмов
Метилнитрозомочевина (NMU)SigmaN1517Специфический канцероген молочной железы
Метилселеноцистеин (МСК)SigmaM6680Органический селен (химиопрофилактическое средство)
EX527SigmaE7034Специфический ингибитор SIRT1
КамбинолSigmaC0494SIRT1 & Ингибитор SIRT2
Спектрофотометр NanoDropThermo ScientificNanoDrop 8000Quantify нуклеотид
GeneAmp PCR System 9700Applied BiosystemsN805-0200Для молекулярно-биологического эксперимента
CO2 ИнкубаторNAPCOSeries 8000 DHДля клеточной культуры при 5% CO2 при 37 &dg; C
Настольная центрифуга с рефозераторомEppendorf5430RДля эксперимента по молекулярной биологии
Центрифуга с качающимся ведромEppendorf5810 RДля клеточных культур
Инвертированный микроскопNikon80124Фазовый контраст опционально
Вытяжка для культуры тканейLabconcoClass II A2BSL-2 сертифицированная
LumiCycle 32ActimetricsНедоступныйдетектор люминесценции
медиум информации

Ссылки

  1. Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127(2015).
  2. Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
  3. Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
  4. Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
  5. Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
  6. IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
  7. Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
  8. Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
  9. Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson's disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
  10. Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson's disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
  11. Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
  12. Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244(2014).
  13. Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
  14. Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
  15. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  16. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
  17. Genomics, S. Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
  18. Scientific, F. Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
  19. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).
  20. Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
  21. Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
  22. Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
  23. Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
  24. Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
  25. Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
  26. von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
  27. Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
  28. Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
  29. Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
  30. Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
  31. Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
  32. Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
  33. Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405(2015).
  34. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234(2012).
  35. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Анализ циркадных ритмоврепортер промотора PER2измерение экспрессии люциферазыскрининг химических деструкторовпротокол синхронизации клетокпрограммное обеспечение для анализа LumiCycleсредовые модуляторы циркадных ритмовколичественное определение интенсивности биолюминесценции
В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.