Методическая статья

Сверхвысоких резолюции мышь оптическая когерентная томография помощи внутриглазных инъекций в исследованиях сетчатки генной терапии

DOI:

10.3791/55894

⸱

2 ноября 2018 г.

 , 
1Research Service, VA Western New York Healthcare System, 2Department of Ophthalmology, (Ross Eye Institute), Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 3Pharmacology/Toxicology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 4Physiology/Biophysics, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 5Neuroscience Program, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo- SUNY, 6The RNA Institute, University at Buffalo- SUNY, 7The SUNY Eye Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы продемонстрировать новаторский подход к использованию высокого разрешения спектральной области оптическая когерентная томография (HR-SD-Окт) для содействия доставке генной терапии агентов в пространство субретинальное, оценить его ареал освещение и характеризуют фоторецепторных жизнеспособность.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-OCT используется для контролировать прогрессирование фоторецепторных дегенерации в прямом мыши модели, оценить доставки терапевтических агентов в субретинальное пространство и для оценки токсичности и эффективность в естественных условиях. HR-SD-Окт использует около инфракрасного света (800-880 Нм) и имеет оптику специально разработан для уникальных оптики глаза мыши с суб-2-микрон осевой резолюции. Трансгенные мыши модели внешних сетчатки (фоторецепторных) вырождение и контроля были образы оценить прогрессирования заболевания. Вытащил стеклянной микроиглы были использованы для доставки суб сетчатки инъекции аденоассоциированный вирус (AAV) или наночастиц (NP) через транс склеры и транс хориоидеи подход. Тщательно позиционировать кончик иглы в пространство субретинальное требовалось до калиброванный инъекция, которая поставляет жидкость в суб сетчатки пространство. Реальном времени субретинальное хирургии было проведено на нашей сетчатки системы (RIS). HR-SD-Окт продемонстрировал прогрессивного единообразных дегенерации сетчатки вследствие выражение токсичных мутант человека мутантов родопсина (P347S) (РоP347S) трансген мышей. HR-SD-OCT позволяет строгой количественной оценки всех слоев сетчатки. Наружный слой ядерной (ONL) толщина и фоторецепторных измерения длины (OSL) наружный сегмент коррелируют с фоторецепторных жизнеспособность, дегенерация или спасения. Система доставки RIS позволяет в реальном времени визуализации субретинальное инъекции в неонатальной (~ P10-14) или взрослых мышей, HR-SD-Окт немедленно определяет успех доставки и карты и ареал степени. HR-SD-Окт является мощным инструментом, который можно оценить успех субретинальное хирургии в мышей, в дополнение к оценке жизнеспособности фоторецепторов в естественных условиях. HR-SD-Сен также может использоваться для определения единообразных животных когорты для оценки степени дегенерация сетчатки, токсичности и терапевтические спасения в доклинических гена терапии научных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследователи разрабатывают генной терапии для различных дегенеративных заболеваний сетчатки и сетчатки с надежды перевода Роман терапии в лечение для болезней человека1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. время домена или спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Окт) был использован для изучения аспектов внешних дегенерации сетчатки в конкретных мыши модели болезни12,13,14 . HR-SD-OCT не, однако, был широко используется в контексте оптимизации оценки моделей мыши для определения темпов и пространственной однородности дегенерации сетчатки, или в контексте доклинических оценки гена на основе терапии, например, к оценить спасения, токсичность или пространственные масштабы векторных доставки8,,1516. После того, как полностью характеризуется модель мыши, HR-SD-Окт данных может служить информативным и надежного ресурса для измерения влияния терапии приложить спасения или токсичности в моделях мыши дегенерации сетчатки17. Многие группы используют субретинальное инъекции как метод доставки векторных благодаря своей эффективности в преобразователя фоторецепторных клеток и клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС). Однако это остается сложным метод мастер, учитывая, что это обычно делается путем операции свободной рукой от поверхности роговицы и часто сопряжено с катарактой, кровотечение и непреднамеренные отслоения сетчатки происходит просто путем манипуляций задней стекловидного тела. Многие группы по-прежнему пытаются субретинальное инъекции слепо и доставить вирус с помощью ручного инъекции с относительно большого диаметра из нержавеющей стали иглы (34G)8,,1718,19 ,20,21,22и несколько использует оптическая когерентная томография (Окт) imaging для подтверждения надлежащего доставки вектора к сетчатке8,17, 20 , 22. Некоторые улучшения в методе недавно были описаны с помощью иглы микромасштабной, движимый микроманипулятор22.

Мы представляем комплексный подход, который помогает в позиционирования иглы, и инъекции способствуют пользовательских режиссер стерео офтальмоскоп, разработанный в лаборатории специально для визуализации внутри небольшой глаз мыши17, 23. Использование микро иглы вытащил стекла в сочетании с стереотаксического микроманипулятор обеспечивают лучшее управление иглы с не хирургическим сократить требуемый (т.е., через хлогексидином и соединительной ткани) до инъекции. Использование давления регулируется микро инжектор помогает доставить последовательного впрыска томов, и инъекции может быть сделано с гораздо большей стабильностью, точность и гораздо медленнее, чем ручной инъекций, выполняемых ручной шприц, снижая возникновение пузырь инъекции в глаз. Меньшие иглу помогает предотвратить утечки после вывода иглы, потому что путь самоуплотняющийся. Для оценки степени инъекция/доставки, многие следственные группы полагаются на поиске и оценке площадной степени расширение зеленый флуоресценции белков (EGFP) в сетчатке (построить выражение выступил вектор) в конце экспериментального точка (эвтаназия) для подтверждения успешного инъекции11,19,20,24. Этот подход (не используя OCT) чтобы убедиться, что хирургические успеха отходов огромное количество ресурсов в хирургической процедуры время и животных, так как все животные с (неизвестных) хирургические ошибки необходимо сохранить, затем с повторяющихся мер до урожай эвтаназии и глаз (когда измеряется EGFP). Подтверждение местоположения инъекций в сетчатке может быть улучшено с помощью HR-SD-Окт продемонстрировать, что инъекции расположен между правильным слоев сетчатки (т.е. субретинальное пространства). HR-SD-Окт может также использоваться для немедленно разграничить неудачных попыток (хирургические ошибки) для выявления соответствующих переменных в реальных хирургические время улучшить подход. Мы обнаружили, что HR-SD-OCT предоставляет многочисленные преимущества в доклинических ген исследования терапии, позволяя быстрое количественной оценки внешних дегенерация сетчатки, позволяя идентификации/забой животных исследования, которые не отвечают критериям экспериментальных ( Например, неправильный субретинальное инъекций) и для прямой последующей визуализации в регион глаза где вектор был доставлен (где доклинические эффект скорее), а также управления регионами, где вектор не было доставлено. С момента своего развития, использование SD-Окт продолжает быть приняты и использованы исследователями офтальмологии и в настоящее время считается стандартом сетчатки отображения сетчатки научных исследований в мышь или грызун модели13,25. HR-SD-OCT и его возможности программного обеспечения были использованы в уникальных комплексных способов достижения цели успешного количественный генной терапии в моделях мыши на каждом шагу в процессе, включая выбор Животные модели, характеристика дегенерации в выбранной модели заболеванием, терапевтические доставки, отображение вектора доставки, и токсичность/эффективность оценки. Использование HR-SD-OCT позволяет для более эффективных лекарственных препаратов на всех уровнях этого процесса. Здесь мы опишем эти подходы, которые используются в нашей программе РНК лекарственных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Животных протоколы были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование комитетами HCS ва площадей и университете Буффало-SUNY. Животные были использованы согласно положениям ассоциации исследований в зрения и офтальмологии (Арво) и Хельсинкской декларации.

1. мышь модели

  1. Определение модели мыши должны оцениваться в том числе элементов управления.
    Примечание: Визуализация была выполнена для C57BL/6(J), Нс1/Нс1/МВт/МВт, гомозиготных для человека мутантов РоP347S Нс1 аллелей на одичал типа (WT) модель дегенерации сетчатки частично гуманизированные мыши мыши Ро+/ + генотип26 , 27, Нс1 x BL/6(J), частично гуманизированные модель с одной копией аллеля мутанта человека РоP347S Нс1 на WT мыши Ро+/ + генотипа (Нс1 /-/ / МВт/МВт) (получены путем скрещивания Нс1/Нс1/МВт/МВт с (C57BL/6 J) мышах). Выше аутосомно-доминирующей пигментный ретинит (adRP) модели находятся на фоне C57BL/6(J). Модель мыши, гомозиготных по две копии гена человека WT Ро на мыши Ро нокаут фон был также используется28,29. Эта линия — на фоне 129Sv. Когда эта линия была пересекли с маскированием Ро мыши на заднем 129Sv, разовая доза человека Ро происходит на мыши фон Ро .
  2. Поддерживают следующие условия, касающиеся экспериментальный дизайн животных.
    Примечание: Животные были сохранены в ветеринарных медицинских подразделения (VMU) в ва площадей HCS. Мышей кормили стандартные лаборатории Чоу и вырос до 12 h:12 h света: Темный циклов с мягкой люминесцентные накладные белые огни с приблизительно 300 люкс на уровне клетки на приблизительно 72 ˚F.

2. Мышь глаз гель

  1. Подготовьте оптических гель используется для сетчатки изображений30 и хирургических процедур.
  2. Объединить 2 мг/мл w/v высокой молекулярной массой (4 x 10-6 г/моль карбомер в стерильных 1 x Buffered фосфатный (PBS).
  3. Перемешивают при комнатной температуре до тех пор, пока гель образует вязкой оптически прозрачный гель.
  4. Перевести геля в бутылочки стерильные и центрифуги в размахивая настольная центрифуга ведро на 350 x g для удаления пузырьков воздуха.
  5. Нанести гель непосредственно к роговицы для создания интерфейса между мыши роговицы и премиум покровным стеклом (18 x 18 мм).

3. HR-SD-Окт изображений

  1. Смотрите HR-SD-Окт устройство (рис. 1).
  2. Вес животного, чтобы определить правильное дозы анестетика. Затем анестезировать мыши, с использованием 25 мкл/г веса тела 2,5% раствора буферизации 2,2,2-tribromoethyl спирт (Avertin) решение через внутрибрюшинной инъекции (IP) и добавить что глазные капли расширяются зрачки, после того, как животное прикол.
  3. Убедитесь, что животное находится полностью под наркозом, щепотку мыс и быть уверенным, что животное не реагирует.
  4. Обрезать усы и поместите курсор мыши на HR-SD-Окт нарты.
  5. Расположите мышь глаз прямо перед объективом головной убор и манипулировать элементами управления стадии до тех пор, пока роговицей и радужкой расположены. Держите гидратированный, применяя искусственные слезы роговица.
    Примечание: Плавная регулировка микроманипуляторов на салазках HR-SD-Окт используются для позиции мыши, что ученик отверстие по центру и ориентированной. Оптических головной убор затем дополнительно до сетчатки становится видимым и животное далее корректируется, чтобы получить наилучшие возможные изображения.
  6. Во-первых откройте программу «Мышь» и нажмите «пациент/экзамен». Во-вторых, нажмите «Добавить пациент» и введите соответствующую информацию для идентификации животных в окне нового пациента и «сохранить и выйти». В-третьих нажмите «Добавить экзамен», следуют «начать экзамен». В-четвертых нажмите «Добавить настраиваемые сканирования» и выберите «прямоугольный объем», выбрать ОД или OS для глаз изображаемого, затем нажмите «Добавить экзамен». Наконец Начните направленный инструмент и позиционирования животное, чтобы получить области интереса. После того, как найти правильный регион, удалите любой избыток жидкости из глаза поверхности с помощью стерильных хлопок наконечником аппликатором до захвата изображений для дальнейшего повышения качества изображения, а затем нажмите кнопку «Старт моментального снимка», и если получается хорошее изображение, нажмите кнопку «Сохранить Проверка».
    Примечание: Типичные параметры для прямоугольных HR-SD-Окт изображения являются 900 а сканов/b скан и 90 б сканов/изображения. Полученные изображения являются 1.4 x 1,4 мм. Регионе сетчатки imaged зависит от конкретного эксперимента, но большинство изображений сосредоточены на голове зрительного нерва (БЕЙКЕ).

4. Оценка присутствия, скорость и единообразия модель внешнего дегенерации сетчатки

  1. Модель оценки внешних дегенерации сетчатки HR-SD-Окт
    1. Получите животных с широким спектром возрастов для управления и экспериментальной предметов оценки присутствия, скорость и единообразие внешнего дегенерации сетчатки.
    2. Выполните HR-SD-Окт изображений на нескольких животных в каждом возрасте от обеих когортах (болезни и нормальный). Используйте метод, описанный в 3.1.6 для получения изображений OCT.
      Примечание: Данные могут быть собраны из большой когорты животных все сразу, которые распространены дни рождения, охватывающих широкий период времени (1 год), или небольшой когорты животного может быть использован для сбора нескольких изображений в течение длительного периода времени (1 год), чтобы получить аналогичные результаты.
    3. Откройте записанные изображения прямоугольный объем HR-SD-Окт и определить первый b скан измеряться (в идеале будет включать БЕЙКЕ или другой личной вехой) от ансамбля изображений. Увеличьте изображение для заполнения экрана с помощью функции масштабирования в программном обеспечении.
    4. Откройте нужное количество суппортов, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении b скан и затем нажав на «Зажимов» и наконец нажав на столько суппортами нужным (они пронумерованы от 1 до 10). Убедитесь, что суппорта Показать в правом нижнем углу изображения. Используя функцию «Настроить суппорта», назначить их все как «вертикальной» на угол блока и включите «Места отображения суппорта», чтобы облегчить единый расстановки кадров через сетчатки и, наконец, нажмите Применить.
      Примечание: 1st суппорта должны находиться на левой стороне изображение, при обработке oculus dexter (OD) правый глаз и 1st суппорта следует находиться на правой стороне изображения при обработке изображений зловещий левый глаз (OS) oculus. Это приводит к носовой временной ориентации всех данных для левого и правого глаза при печати.
    5. С помощью компьютерной мыши, переместите каждый суппорта в нужное место (2,0 мм) через b скан, будучи уверенным, чтобы разместить один суппорта в центре головы зрительного нерва, b Скан изображений, которые включают его (этот штангенциркуль равным нулю). Затем с помощью мыши щелкните и перетащите суппорта длины для региона интерес. Произвольно установить суппорты, которые не overlay измеримые регионах b скан до максимальной длины и игнорировать в ходе анализа данных.
    6. Измерения толщины ONL, используя инструменты суппорта, путем размещения в верхней части суппорта на внешних ограничивающих мембраны (вяз) и нижней части суппорта в нижней части внешний сплетениевидный слой (ОБН). Повторите это для каждого суппорта через сетчатку с шагом 0,2 мм. Сохраните измерения.
    7. После того, как все суппорты были помещены и скорректировать размер, щелкните правой кнопкой мыши на изображение и нажмите кнопку «Сохранить данные суппорта».
    8. Повторите измерения на последующих б сканам (каждые 10й сканирования работает хорошо) от того же объема прямоугольного изображения OCT, охватывающих всю сетчатку от уступает Улучшенный регионов. Суппорты должны оставаться открытым и в том же месте по оси x. Отрегулируйте длину суппорта, не перемещая их в X-направлении.
    9. Откройте сохранить файлы данных, щелкнув значок рядом с обработанных b Скан небольшой файл изображения и нажмите кнопку «Перейти к данные». Нажмите кнопку «Дата изменения организовать файлы в порядке, основанном на экономию времени, и открыть все файлы для каждого b скан измеряется.
    10. Необработанные данные от каждого b скан Скомпилируйте в один файл в порядке от низшего к высоким основанные на номер кадра. Выберите столбцы данных, включая «Суппорта имя», «Длина» и «Центр X».
    11. Убедитесь, что центр X является одинаковым для всех б сканов, измеренная для каждого изображения OCT прямоугольный объем обработки. Удалить все данные из зажимов, которые не были использованы для записи измерения и установите суппорта, расположен в центре головы зрительного нерва до нуля.
    12. Печать данных для X против нескольких наборов данных Y чтобы получить функцию 3D печати для печати Общая толщина ONL или другой измеряется сетчатки слой.
    13. Сравните ONL измерений между элементом управления и экспериментальных животных с соответствующих возрастов, чтобы определить скорость и единообразия любых потенциальных дегенерации сетчатки.
    14. Повторите этот процесс для измерения OSL, используя те же б скан изображения. Следуйте той же методологии, используемые для измерения ONL, за исключением размещения суппорта между вяз и Бруха мембраны (BM).
      Примечание: Пример того, как поставить суппорт показано в разделе представитель результаты (рис. 3B). Это должно быть сделано на увеличенном в изображении для уменьшения ошибок.
    15. Повторите анализ данных для нескольких животных для каждый день рождения для обеих экспериментальных и управления когорты.
  2. Всеобъемлющей оценки и 3D отображение толщины ONL или OSL, используя средство суппортами программного обеспечения
    1. Обзор пост инъекции OCT изображений и запишите любой идентифицируемой достопримечательности, как БЕЙКЕ или кровеносных сосудов на сетчатке. Затем поместите указатель мыши для получения последующих SD-Окт из того же региона и не забудьте включить же идентифицируемой достопримечательности.
      Примечание: Обеспечения, выявления региона сетчатки образы и занимается отслойка в пост инъекции SD-Окт изображений. Запишите образ прямоугольный объем SD-OCT и сохраните его.
    2. Обрабатывать записанные изображения, как описано выше 4.1.3. к 4.1.14. Сохраните данные суппорта и сюжет, как описано выше.
      Примечание: Результирующий массив ONL измерений используется для создания 3D сюжет, изображающие ONL толщины. Положение суппорта вдоль оси позволяют replot граф, поместив зрительного нерва в начале координат (0) вдоль оси x. Ось y строится с использованием числа b скан и зрительного нерва используется для определения отправной точкой, что позволяет правильно позицию зрительного нерва в начале координат по оси y. Выявление зрительного нерва в каждом наборе данных позволяет последующие изображения надежно выровнены.
  3. Картирование масштабов укола на глазном дне изображение
    1. Выполняйте пост инъекции прямоугольный объем OCT для подтверждения успешного проведения инъекций. Выполните метод, описанный в 3.6.
    2. Используйте функцию суппорта в программное обеспечение определить точку перегиба на границе отслоенной сетчатки от ряда б сканов, охватывающих весь образ OCT. Используйте метод для открытия суппортов, описанных в 4.1.4.
    3. Запись изображений глазного дна с сопоставленного расположения OCT б скан и соответствующее положение суппорт на глазном дне изображение, которое соответствует расположению.
    4. Скомпилируйте все изображения глазного дна в составное изображение, включая суппорта позиции, что приводит к точную карту укола на глазном дне изображения (например, в разделе результаты представитель, рис. 5A).

5. внутриглазных инъекций

Примечание: Подробная информация об использовании RIS получили дальнейшее развитие в последние исследования23.

  1. Подготовка стекла инъекций иглами
    1. Автоклав капиллярные трубки с нитями небольшими порциями, с использованием сухого цикла.
    2. Использование пипетки съемник и настройки программы, которая будет производить кончик стекла с острым углом и диаметром в диапазоне от 2-5 мкм.
      Примечание: В таблице 1показан пример 5 шаг программы, которая производится эффективное иглы на нашей пипеткой съемник.
    3. Храните вытащил стекла иглы в сосуд иглы стерильные пипетки при комнатной температуре.
  2. Заполнить инъекционной иглы с желаемой раствор для инъекций
    1. Установите иглу в иглодержатель, оставив примерно 5/8" выступающие за пределами конца держателя.
      Примечание: А расстояние меньше чем 5/8" будет сделать его трудно достичь инъекционного раствора для заполнения иглы, потому что иглодержатель не легко вписываются в открытии 0,2 мл пробирок. Кроме того имея выступать более чем на 5/8" результаты в значительно больших колебаний или прецессии кончика, затрудняя визуализации реального времени так как кончик оставляет фокальной плоскости или поле зрения (FOV), при попытке прокол глаз иглы.
    2. Подготовьте инъекционного раствора в стерильных 0,2 мл трубку. Добавление 1:10 разрежения сульфат стерильный флюоресцеином (10 мг/мл в однократном ПБС) для инъекционного раствора для получения конечной концентрации флуоресцеин на 1 мг/мл.
      Примечание: Точное краситель, применяемый для пользователя и может быть что угодно, что не токсичен и видимым невооруженным глазом под белый свет освещение для облегчения точное размещение кончик иглы на уровне ПЭС и субретинальное пространства.
    3. Визуализируйте иглы через стерео Микроскоп при использовании ручки управления 3-оси микроманипулятор для позиционирования иглы, таким образом, чтобы он выравнивается с центром трубка, содержащая инъекционного раствора, который будет использоваться для заполнения иглы.
    4. Аккуратно водите кончик иглы в 0,2 мл трубку до тех пор, пока кончик иглы погруженным в жидкость. Составить желаемый объем впрыска жидкости (например 1 мкл) в необходимые для одной инъекции иглу. Поддерживать оставшийся раствор в трубки помещены в лед.
  3. Подготовка животного для инъекций
    Примечание:     Микроскоп RIS содержится в чистоте и это бесконтактная система. Нагревательная пластинка покрыта площадку чистые адсорбента и иглы газобетона до тянет. После того, как они тянут по самостоятельной стерилизации с подогревом металлической полосы, они хранятся в закрытой камере стерилизованные, предназначенный для хранения вытащил стеклянных иголок. Иглы только обрабатываются с помощью перчатках, и ухода используется для предотвращения прикосновения кончика иглы во время установки его в держатель. Вводят решения готовятся с использованием стерильных и тестируются для загрязнения мелирование образец вируса препаратов на плиты агара LB и инкубации их на ночь в 37 градусов.
    1. Вес животного (g) для определения соответствующей дозы обезболивающий обезболивающее.
    2. Администрировать анестезии (2,5% раствор спирта буферизации 2,2,2-tribromoethyl (Avertin)) через внутрибрюшинной инъекции (IP).
    3. Сразу же применить антихолинергические препараты (например, cyclopentylate) на оба глаза, чтобы разбавить учеников.
    4. Обрезать усы животного и число животных, с использованием штампа уха или другой метод.
    5. Промойте глаз и окрестности с разбавленным Бетадин.
      Примечание: Избегайте попадания любое решение вокруг носа, как это может привести к непреднамеренному утопления.
    6. Поместите курсор мыши на грелке, составляла 39 ° c, в предварительно формованного modeler глины мыши держатель с глазом для инъекций на иглу.
    7. Убедитесь, что мышь перестает отвечать на запросы, с помощью теста щепотку задние ноги.
  4. Выполнение субретинальное инъекций
    1. Используйте пару стерильных тупым Ирис щипцами осторожно побудить экзофтальм земного шара, поместив советы щипцы на 7 и 10 часов позиции на веки прижимая открытых и вниз в то же время.
    2. Используйте щипцы уговорить на веках под глаз шара, чтобы держать его из розетки во время процесса впрыска.
      Примечание: Животные 10-14 дней часто проведет глаз из розетки более легко, чем пожилых животных.
    3. Прямой наконечник иглы около 1-1,5 мм ниже края роговицы лимба и тщательно водить его в глаз через конъюнктивы, до тех пор, пока он создаёт склеры депрессии, как игла проникает в ткани склеры и позволяет манипулирование глаза.
    4. Поворот глаз вниз с микроманипулятор для визуализации склеральным депрессии через расширение зрачка с стерео Микроскоп RIS.
    5. Примените капли стерильные глаз гель или 1 x PBS решения и накрыть стерильные coverslip.
    6. Сосредоточиться на склеры депрессии, созданные кончик иглы (2-5 мкм) и диск иглу вперед до острый пик сетчатки форм в месте инъекции.
    7. Поверните иглу с помощью держателя до тех пор, пока кончик отверстия через склеры и флюоресцеином в иглу видна под сетчаткой в непосредственной близости от НПП монослоя клеток.
    8. Привод кончик иглы, так что это касательной к миру, а затем активировать ТНВД с ногой педали.
    9. После произнесения нужного тома (0.5-1 мкл) субретинальное пространства, снять иглу и проверить если пузырь является стабильным и что жидкость не вытекать из укола, который является первым критерии успешного внедрения.
      Примечание: Поддержание надлежащего наконечник диаметром (диаметр 2-5 мкм) имеет решающее значение, чтобы избежать утечки из места инъекции.
    10. Поместите животное на платформе изображений инструмента OCT. Следуйте инструкциям для HR-SD OCT Imaging для записи образа тома прямоугольной.
    11. Подтвердите, что закачиваемой жидкости находится в субретинальное пространстве и сохранить изображения для определения степени пузырь.
    12. Выньте из держателя животного и применить достаточное количество антибиотик мазь вводят глаз.
    13. Поместите животное на грелку, до тех пор, пока он полностью восстанавливается, а затем поместить его обратно в оригинальный Кейдж, откуда она взялась.
      Примечание: Наши животные обычно вводят до отъема, поэтому животные должны быть возвращены в клетке с матерью.
  5. Картирование масштабов субретинальное пузырь с помощью OCT инструмент программного обеспечения.
    1. Получать прямоугольный объем октября изображение, с помощью методов, описанных ранее, в пузырь и расположите его включить узнаваемые вехой в глаза как БЕЙКЕ.
      Примечание: Записи 90 б сканов работает хорошо для сопоставления пузырь, но могут быть использованы в зависимости от желаемого резолюции.
    2. Добавьте один суппорт на рисунке и поместите его в точке перегиба, где Сетчатка отсоединяется от НПП и сосудистое.
      Примечание: Программное обеспечение автоматически сопоставляет соответствующую точку линии на изображение глазного дна, представляющие суппорта и b скан оцениваются.
    3. Захват экрана, после размещения суппорта и скомпилируйте изображения для эффективного сопоставления границы инъекции пузырь на изображение глазного дна, который точно карты укола. Сохраните скомпилированный образ для справки, чтобы помочь в поиске областей интерес во время последующей обработки изображений.
      Примечание: Кроме того суппорта данные могут быть сохранены, выполнил и с помощью аналогичного метода для построения 3D наборов данных ONL толщины.
  6. Интравитреальные инъекций
    1. Место кончике иглы, используя аналогичный хирургический подход как sub сетчатки инъекции, за исключением того, что игла приводится полностью через склеры в pars plana около 0,25 мм позади роговицы лимба и в стекловидное тело.
    2. После иглы применять импульса впрыска с педали.
      Примечание: Наблюдается быстрое распространение краски флуоресцеин во всем стекловидного тела наглазник, заполнение расширенных ученик диафрагмы с флуоресценцией.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценка присутствия, скорость и единообразия модель внешнего дегенерации сетчатки
Измерения ONL были записаны от ОБН в ELM, определение границ ONL, с помощью средства суппорта в инструмент программного обеспечения. Цель заключалась в карте прогрессирование внешних дегенерации сетчатки в мышиной модели частично гуманизированные adRP. Сопоставимых изображения от управления C57BL/6(J) Мышь и Нс1/Нс1/МВт/модель мыши МВт, выражая двух копий генов опсин (РоP347S...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HR-SD-OCT предоставляет простой метод для определения характеристик потенциальных животных моделей болезней человека, чтобы определить их полезность в тестировании потенциальные терапии. Способность быстро и надежно характеризуют потенциальной модели животных болезней человека имеет решающее значение для процесса терапевтических лекарственных препаратов (например, замена генной терапии, рибозим или индуцируемый нокдаун генной терапии, комбинированных генной терапии). HR-SD-OCT предоставляет простой, быстрый и не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Коммерческие отношения: MCB: нет; JMS: нет. Сетчатки, визуализации системы (RIS)23 , используемые в данном исследовании — Роман устройство существенного использования какой-либо группе, желающих проводить исследования доставки терапии гена в мышей, грызунов и мелких животных. Хотя авторы имеют конфликты не объявить что касается это устройство в данный момент, университет в Буффало - SUNY и ветеранов администрации имеют права интеллектуальной собственности и могут стремиться к коммерциализации этого инструмента в будущем.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот материал основан на работе, в частности, поддерживается Департаментом по делам ветеранов (VA), ветеранов здравоохранения администрации, управления исследований и развития (биомедицинские лаборатории исследования и развития) (Грант заслуги ва 1I01BX000669). JMS используется, в частности, как врач-научный сотрудник, офтальмологии, ва площадей; MCB используется, в частности, ва площадей. Исследование было проведено на и частично поддерживается система здравоохранения ветеранов администрации Западной Нью-Йорка (Буффало, Нью-Йорк). Содержание не отражает мнения Департамента по делам ветеранов или правительства Соединенных Штатов. Также поддерживается, в основную часть, по NIH/НЭЙ R01 Грант EY013433 (PI: JMS), NIH/НЭЙ R24 Грант EY016662 (UB видение инфраструктуры центр, PI: M убоя, директор - биофотоники модуль: JMS), неограниченный Грант для кафедры офтальмологии/университета в Буффало от исследования, чтобы предотвратить слепоту (Нью-Йорк, Нью -Йорк) и Грант от Фонда Oishei (Буффало, Нью-Йорк). Мы признаем дар Нс1 трансгенных РоP347S линии и мыши экзона 1 Ро нокаут от д-р Янис Lem (медицинский центр Новой Англии Тафтса, Бостон, штат Массачусетс) и дар НПЧ-E трансген модель в состоянии гетерозиготных на мышь экзона 2 Ро нокаут фон от Drs. G. Джейн Фаррар и Питер Humphries (Тринити-колледж, Дублин, IRE).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
C57BL6 (J)Jackson Laboratories664
N129R-N/AN/A
2HRho 1T/1TN/AN/A
Envisu R-2200 Прибор для когерентной глазной томографии (ОКТ)Bioptigen90-R2200-U1-120.   
Система визуализации сетчатки глаза (РИС)СобственныйН/Д
Микроскоп Stemi 2000CZeiss000000-1106-133
P-97 Пылающий/коричневый пуллер микропипетокSutter Instrument Cop-97
MMN-33 микроманипулятор Narishige СШАMMN-33
PLI-100  микроинъекторHarvard Apparatus64-1736
Держатель микропипеток (вращающийся)Собственныйн/д
Емкость для хранения микропипетокWorld Precision Instruments Inc.E210
  Капиллярные трубки из боросиликатного стекла 1,5-1,8 Х 100 мм;Гарвардский аппарат30-0053
2,2,2-трибромэтанолSIGMA AldrichT48402-25G
Трет-амиловый спиртSIGMA Aldrich240486-100ML
Офтальмологический раствор сульфата атропина, USP 1%Akorn Inc.NDC 17478-215-05
GonioviscBioVision LimitedNDC 17238-610-15
Циклопентолата гидрохлорид офтальмологический раствор, USP  2%Akorn Inc.NDC 17478-097-10
Мазь сульфата гентамицина USP, 0,1%PerigoNDC 45802-046-35
Systane UltraAlcon Laboratories, Inc.9006619-1013
Тетракаина гидрохлоридBausch and LombNDC 24208-920-64
Офтальмологический раствор, USP 0,5%Bausch and LombNDC 24208-920-64
DPBSGibco Life Technologies14190-136
Вирусные препаратыViGene /UNCN/A
Gold nanorodsNANOPARTzD12M-850-1.75
Флуоресцеин сульфат АК-ФТОР 25%Akorn Inc.NDC 17478-250-20
Покровные стеклаFisher Scientific12-548-A
ЩипцыMilton18-825
Иглы 30 калибраBeckton Dickenson   W11604
ШприцыBeckton Dickenson   
Пакет программного обеспечения BioptigenN/A
Пропаракаина гидрохлорид офтальмологический раствор, USP 0.5%Akorn Inc.NDC 17478-263-12
Windows ExcelMicrosoftN/A
Adobe IllustratorAdobe 
ВесыMettler
НожницыWorld Precision Instruments
Ear PunchNat' l лента
CL 100 Источник светаWelch AllynCL100
Газообразный азотJackson Сварочный источникН/Д
Водяная баня с подогревомNeslabRTE-140
Нагревательная плитаВ домеН/Д
Нагревательный коврикCincinnatti Sub Zero273
Глиняный держатель для мышиPlast.i.clay Американская компания «Арт Клэй»Н/Д
БетадинМедЛайнNDC53329-938-06
Аппликаторы с ватным наконечникомАмериканская служба здравоохраненияCtag
EtOH 70%Fisher ScientificBP2818-100
Перчатки нитрилVWR89038-272
Diagnosys ERG Color Dome инструментDiagnosys Inc.Контактные линзы D125
Собственное
программное обеспечение для диагностикиDiagnosys Inc.Н/Д
Origin 6.1 программное обеспечениеOriginLab Corp.Н/Д
Электроды сравненияOcuscienceF-резьбовый электрод (DTL) 24"
309659

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Regus-Leidig, H., et al. In-vivo knockdown of Piccolino disrupts presynaptic ribbon morphology in mouse photoreceptor synapses. Front Cell Neurosci. 8 (259), 1-13 (2014).
  2. Jiang, L., Frederick, J. M., Baehr, W. RNA interference gene therapy in dominant retinitis pigmentosa and cone-rod dystrophy mouse models caused by GCAP1 mutations. Front Mol Neurosci. 7 (25), 1-8 (2014).
  3. Seo, S., et al. Subretinal gene therapy of mice with Bardet-Beidl Syndrome Type-1. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6118-6132 (2013).
  4. Molday, L. L., et al. RD3 gene delivery restores guanylate cyclase localization and rescues photoreceptors in the RD3 mouse model of Leber congenital amaurosis 12. Hum. Mol. Genet. 22 (19), 3894-3905 (2014).
  5. Pang, J. J., et al. AAV-mediated gene therapy in mouse models of recessive retinal degeneration. Curr. Mol. Med. (3), 316-330 (2012).
  6. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel adeno-associated viral vectors for retinal gene therapies. Gene Ther. 19 (2), 162-168 (2012).
  7. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Curr. Gene Ther. 3 (6), 545-565 (2003).
  8. Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach. J. Vis. Exp. (118), e54808(2016).
  9. Bainbridge, J. W. B., Mistry, A. R., Thrasher, A. J., Ali, R. R. Gene therapy for ocular angiogenesis. Clinical Science. 104, 561-575 (2003).
  10. Igarashi, T., Miyake, K., Asakawa, N., Miyake, N., Shimada, T., Takahashi, H. Direct comparison of administration routes for AAV-8 mediated ocular gene therapy. Curr. Eye Res. 38 (5), 569-577 (2013).
  11. Bennett, J., Duan, D., Engelhardt, J. F., Maguire, A. M. Real-time noninvasive in vivo.assessment of adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38, 2857-2863 (1997).
  12. Ruggeri, M., et al. In vivo three-dimensional high-resolution imaging of the rodent retinal with spectral-domain optical coherence tomography. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48 (4), 1808-1814 (2007).
  13. Berger, A., et al. Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494(2014).
  14. Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images. TVST. 4 (4), 9(2015).
  15. Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).
  16. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J. Vis. Exp. (69), e4286(2012).
  17. Berger, A., al,, et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoSOne. 9 (5), 96494(2014).
  18. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).
  19. Sarra, G. M., et al. Kinetics of transgene expression in mouse retina following subretinal injection of recombinant adeno-associated virus. Vision Res. 42, 541-549 (2002).
  20. Yan, Q. I., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  21. Park, S. W., Kim, J. H., Park, W. J., Kim, J. H. Limbal approach-subretinal injection of viral vectors for gene therapy in mice retinal pigment epithelium. J. Vis. Exp. (102), e53030(2015).
  22. Westenskow, P. D., et al. Performing subretinal injections in rodents to deliver retinal pigment epithelium cells in suspension. J. Vis. Exp. (95), e52247(2015).
  23. Butler, M. C., Sullivan, J. M. A novel, real-time, in vivo mouse retinal imaging system. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (12), 7159-7168 (2015).
  24. Rolling, F., et al. Evaluation of adeno-associated virus-mediated gene transfer into the rat retina by clinical fluorescence photography. Hum. Gene Ther. 10, 641-648 (1999).
  25. Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology. PLoS One. 9 (10), 111203(2014).
  26. Li, T., Snyder, W. K., Olsson, J. E., Dryja, T. P. Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S: evidence for defective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14176-14181 (1996).
  27. Brill, E., et al. A novel form of transducin-dependent retinal degeneration: accelerated retinal degeneration in the absence of rod transducing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48, 5445-5453 (2007).
  28. Olsson, J. E., et al. Transgenic mice with a rhodopsin mutation (Pro23His): a mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. Neuron. 9, 815-830 (1992).
  29. Humphries, M. M., et al. Retinopathy induced in mice by targeted disruption of the rhodopsin gene. Nat. Genet. 15, 216-219 (1997).
  30. Hruby, K. Clinical examination of the vitreous body. Proc. Roy. Soc. Med. 47, 163-170 (1953).
  31. Kolniak, T. A., Sullivan, J. M. cell-based toxicity screen of potentially therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Experimental Eye Research. 92, 328-337 (2011).
  32. Qi, Y., et al. Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina. PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).
  33. Timmers, A. M., Zhang, H., Squitieri, A., Gonzalez-Pola, C. Subretinal injections in rodent eyes: effects on electrophysiology and histology of rat retina. Mol. Vis. 7, 131-137 (2000).
  34. Johnson, C. J., Berglin, L., Chrenek, M. A., Redmond, T. M., Boatright, J. H., Nickerson, J. M. Technical brief: subretinal injection and electroporation into adult mouse eyes. Mol. Vis. 14, 2211-2226 (2008).
  35. Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents. Vision Res. 48, 453-469 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи