Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55904

⸱

26 мая 2017 г.

 ,  , 
1College of Pharmacy, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа описывает протокол на основе FACS, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц.

Аннотация

Перициты являются периваскулярными мультипотентными клетками, которые проявляют гетерогенность в разных органах или даже в пределах одной и той же ткани. В скелетных мышцах есть по крайней мере две субпопуляции перицитов (так называемые тип I и тип II), которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и обладают отличными возможностями дифференциации. С использованием двойных трансгенных мышей NG2-DsRed и Nestin-GFP успешно прошли выделение перициты типа I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) и типа II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Однако доступность этих двойных трансгенных мышей предотвращает широкое использование этого метода очистки. Эта работа описывает альтернативный протокол, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц. Этот протокол использует технологию сортировки с активированной флуоресценцией клеток (FACS) и нацелен на PDGFRβ, а не NG2 вместе с сигналом Nestin-GFP. После изоляции введите I и tyПерициты пе II обладают отчетливыми морфологиями. Кроме того, перициты I и II типа, выделенные этим новым методом, как, например, выделенные из двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно. Эти результаты позволяют предположить, что этот протокол может быть использован для выделения субпопуляций перицитов из скелетных мышц и, возможно, из других тканей.

Введение

Мышечная дистрофия - дегенеративное расстройство мышц, которое пока не имеет эффективных методов лечения. Развитие терапии, способствующей регенерации тканей, всегда вызывало большой интерес. Регенерация и восстановление тканей после повреждения зависят от резидентных стволовых клеток / клеток-предшественников 1 . Сателлитные клетки представляют собой миогенные клетки-предшественники, которые способствуют регенерации мышц 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Их клиническое применение, однако, затруднено их ограниченной миграцией и низкой выживаемостью после инъекции, а также их пониженной способностью к дифференцировке после амплификации in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . В дополнение к спутникамTe клетки, скелетные мышцы также содержат много других клеточных популяций с миогенным потенциалом 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , таких как тромбоцитарные рецепторы-бета (PDGFRβ) -положительные интерстициальные клетки. Имеются данные, свидетельствующие о том, что полученные из мышцы PDGFRβ + клетки способны дифференцироваться в миогенные клетки и улучшать мышечную патологию и функцию 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ преимущественно обозначает перициты 21 , которые являются периваскулярными клетками с плюрипотентностью 22 , 23 . В дополнение к PDGFRβ, многие другие маркеры, включая Neuron-Glial 2 (NG2) и CD146, также используются для iУточнить перициты 21 . Следует отметить, однако, что ни один из этих маркеров не зависит от перицитов. 21 . Недавние исследования выявили два подтипа перицитов мышц, называемых типом I и типом II, которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и выполняют различные функции 19 , 24 , 25 . Биохимически перициты I типа - NG2 + Nestin - , а перициты II типа - NG2 + Nestin + 19 , 24 . Функционально перициты I типа могут подвергаться адипогенной дифференцировке, способствуя накоплению жира и / или фиброзу, тогда как перициты II типа могут дифференцироваться вдоль миогенного пути, способствуя регенерации мышц 19 , 24 , 25 . Эти результаты показывают, что: (1) перициклы типа I могут bЕ, предназначенные для лечения жировых дегенеративных расстройств / фиброза, и (2) перициты II типа обладают большим терапевтическим потенциалом для мышечной дистрофии. Для дальнейшего изучения и характеристики этих популяций требуется протокол изоляции, который позволяет разделять перициты типа I и типа II с высоким уровнем чистоты.

В настоящее время выделение субпопуляций перицитов основано на двойных трансгенных мышах NG2-DsRed и Nestin-GFP 19 , 24 . Наличие мышей NG2-DsRed и качество большинства NG2-антител ограничивают широкое использование этого метода. Учитывая, что все NG2 + перициты также экспрессируют PDGFRβ в скелетных мышцах 19 , 20 , 24 , мы предполагаем, что NG2 можно заменить PDGFRβ для выделения перицитов и их субпопуляций. В этой работе описывается протокол на основе FACS, которыйИспользует окрашивание PDGFRβ и сигнал Nestin-GFP. Этот метод менее требователен для исследователей, поскольку: (1) он не требует фона NG2-DsRed и (2) он использует коммерчески доступные антитела PDGFRβ, которые хорошо охарактеризованы. Кроме того, он обеспечивает одновременную изоляцию перицитов типа I и типа II с высокой степенью чистоты, что позволяет провести дальнейшее изучение биологии и терапевтического потенциала этих субпопуляций перицитов. После очистки эти клетки можно выращивать в культуре, и их морфологии можно визуализировать. Эта работа также показывает, что перициты типа I и типа II, выделенные с использованием этого метода, подобно очищенным от двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Трансгенных мышей дикого типа и Nestin-GFP размещали на объекте для животных в Университете Миннесоты. Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Университете Миннесоты и были в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных NIH.

1. Мышечная диссекция и одноклеточная изоляция

  1. Усыпите взрослых мышей (6-10 недель, мужчин и женщин) трибромоэтанолом (250 мг / кг, внутрибрюшинно) и простерилизуйте их кожу живота 70% -ным этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромэтанол использовался здесь вместо кетамина для анестезии / эвтаназии, поскольку известно, что кетамин взаимодействует с NMDA-рецепторами, что потенциально может влиять на исследование.
  2. Поместите мышей в лежачем положении и используйте скальпель, чтобы сделать горизонтальный разрез на брюшной коже. Слезьте кожу рукой, потянув в противоположных направлениях, чтобы выставить мышцы задней конечности.
  3. пособ• мышцы обеих задних ног с помощью щипцов и ножниц. Хранить их в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS), дополненном 1% пенициллин-стрептомицином (P / S) на льду.
  4. Промойте рассеченные мускулы задней конечности в ледяном PBS, дополненном 1% P / S два раза и перенесите их на стерильную пластину 10 см.
  5. Тщательно рассекайте нервы, кровеносные сосуды и соединительную ткань из мышц с помощью щипцов и ножниц под рассекающим микроскопом при увеличении в 2 раза.
  6. Мелко нарезать и просушить мышцы на мелкие кусочки (1-2 мм 3 ), используя стерильные ножницы и лезвия. При необходимости добавьте небольшое количество модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), чтобы убедиться, что мышцы не высохли.
  7. Механически разрушайте ткань пипетированием вверх и вниз по 10 мл серологической пипетке 10 раз.
  8. Добавить к смеси свежеприготовленный раствор для пищеварения (DMEM с добавлением 0,2% коллагеназы типа 2). Инкубируйте при 37 ° С в течение 2 ч с gentlE при 35 оборотах / мин.
  9. Растирают в порошок с использованием иглы 18 G для гомогенизации смеси. Затем центрифугируют при 500 мкг в течение 5 мин. Отбросьте супернатант, а затем ресуспендируйте осадок в 0,25% трипсина / ЭДТА. Инкубируйте при 37 ° С в течение 10 мин. Повторите операцию центрифугирования еще два раза.
  10. Добавить 10 мл DMEM с добавлением 20% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) к раствору и центрифугировать при 500 xg в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в буфере лизиса эритроцитов (155 мМ NH 4 Cl, 10 мМ KHCO 3 и 0,1 мМ ЭДТА).
  11. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Отбрасывают супернатант и ресуспендируют осадок в буфере для сортировки (20 мМ HEPES, pH 7,0, 1 мМ EDTA и 1% BSA в Ca / Mg 2+ - без PBS, pH 7,0). Фильтруют смесь через сито для клеток размером 40 мкм, чтобы получить суспензию с одной клеткой.
  12. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и ресуспендируйте осадок в 1 мл буфера для сортировки.
  13. ПодсчитайтеКлетки с гемоцитометром и развести одноячеечную суспензию до 5 × 10 6 / мл в сортировочном буфере.

2. Окрашивание и сортировка клеток

  1. Подготовьте элементы управления и образец, как описано в таблице 1 . Окрашивают одноклеточную суспензию соответствующими антителами на льду в течение 30 мин, как описано в таблице 1 .
  2. Центрифугируйте при 500 xg в течение 5 минут и дважды вымойте гранулы буфером для сортировки.
  3. Добавьте DAPI к однокамерным растворам, как указано в таблице 1. Используйте DAPI (конечная концентрация) 5 мкг / мл для одноцветного контроля DAPI и 1 мкг / мл DAPI для контроля PDGFRβ-PE-FMO и образца. Храните все пробирки на льду в течение всего эксперимента.
  4. Включите сортировщик и программное обеспечение. Сканируйте и вставьте чип для сортировки размером 100 мкм, когда появится соответствующий запрос.
  5. Выполните автоматическую настройку ( то есть выравнивание микросхемы, калибровку капель, калибровку бокового потока и калибровку задержки сортировкиНа), загрузив шарики автоматической настройки при появлении запроса.
  6. Когда автоматическая настройка завершена, перейдите на вкладку «Эксперимент», нажмите «Создать» и выберите «Пустой шаблон» из «Публичных шаблонов».
  7. В разделе «Настройки измерения» введите «DAPI» для «FL1», «Nestin-GFP» для «FL2» и «PDGFRβ» для «FL3». Снимите флажки для «FL4» - «FL6».
  8. Установите флажки для активации лазеров 405, 488 и 561 и нажмите «Создать новый эксперимент».
  9. Выберите «Start Compensation Wizard» и следуйте указаниям программного обеспечения «Compensation Wizard», чтобы установить компенсацию.
    1. Загрузите необработанный элемент управления и нажмите «Пуск». Нажмите «Настройки детектора и порога срабатывания» и настройте чувствительность датчика FSC и BSC детектора, чтобы поместить население на шкале.
    2. ОбъявлениеТолько уровни усиления флуоресцентных каналов FL1-FL3, чтобы поместить отрицательные популяции на левой стороне гистограмм. Нажмите кнопку «Запись», чтобы записать данные.
    3. Когда появится запрос, загрузите одноцветные элементы управления один за другим. Нажмите «Пуск и запись», чтобы записать данные. Отрегулируйте ворота для положительных поселений на гистограммах. Нажмите "Далее."
    4. Перейдите к «Вычислить матрицу» на вкладке «Компенсация» и нажмите «Рассчитать» в панели «Вычислить параметры компенсации», чтобы выполнить компенсацию. Нажмите «Готово», чтобы выйти из «Мастера компенсации».
  10. Загрузите элемент управления PDGFRβ-PE-FMO и нажмите «Пуск». Нарисуйте полигональный затвор (Gate A) вокруг интересующих клеток в разделе «Все события».
  11. Дважды щелкните внутри Gate A, чтобы создать дочерний график. Измените ось Y на DAPI и нарисуйте полигон (Gate B) вокруг живых (DAPI low ) ячеек. Дважды нажмите iNside Gate B для создания дочернего сюжета. Измените ось X на FSC-H и ось Y на FSC-W и нарисуйте полигональный затвор (Gate C) вокруг синглетов, чтобы устранить дублеты.
  12. Дважды щелкните внутри Gate C, чтобы создать дочерний график. Измените ось X на Nestin-GFP и ось Y на PDGFRβ-PE. Нажмите кнопку «Запись», чтобы записать данные.
  13. Загрузите образец и повторите шаги 2.11-2.12. После записи нажмите «Пауза», чтобы сохранить образец.
  14. Определить границы стробирования для клеток PDGFRβ + и Nestin-GFP + на основе контроля PDGFRβ-PE-FMO. Нарисуйте ворота для популяций PDGFRβ + Nestin-GFP - и PDGFRβ + Nestin-GFP + .
  15. В разделе «Метод сортировки» выберите «2-way Tubes» и назначьте ячейки «PDGFRβ + Nestin-GFP» и «PDGFRβ + Nestin-GFP + » в левой и правой собирающих трубках, повторитесоответственно. Смонтируйте заполняющие буферы сортировочного буфера объемом 15 мл на этапе сбора и нажмите кнопку «Загрузить сборку».
  16. Нажмите кнопку «Продолжить», чтобы запустить образец. Нажмите «Начать сортировку», чтобы собрать PDGFRβ + Nestin-GFP - (перициты типа I) и PDGFRβ + Nestin-GFP + (тип II перицитов).

3. Анализ после сортировки

  1. Центрифуга отсортированные клетки в 500 xg в течение 5 мин, ресуспендируют осадок в 1 мл среды перицитов (см. Таблицу материалов ), и подсчитать плотность клеток с помощью гемоцитометра.
  2. Перициды семенного типа I и типа II на покровных стеклах, покрытых поли-D-лизином (PDL), при ~ 1 × 10 4 клеток / см 2 . Выращивают в среде перицикла в течение 3 дней при 37 ° С с 5% CO 2 .
  3. На третий день исследуют морфологию перицитов (под фазовым контрастом) и эндогенную экспрессию Nestin-GFP с использованием флуоресцентного микро(Лазер возбуждения: 488 нм, фильтр возбуждения: 470/40 нм и эмиссионный фильтр: 515/30 нм). Делайте снимки под объектив 20X (0,45 NA).
  4. Замените перицитную среду на адипогенную (базальная среда MSC мыши + адипогенная стимулирующая добавка) и миогенную (DMEM + 2% лошадиную сыворотку) среду для инициации адипогенной и миогенной дифференцировки, соответственно, как описано ранее 20 . Меняйте среду каждые 2-3 дня.
  5. Зафиксируйте клетки на 17-й день (14 дней после адипогенной / миогенной дифференцировки) в 4% параформальдегиде (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно, PFA является канцерогенным веществом.
  6. Выполните иммуноцитохимию против перилипина (маркер адипоцита) и S-миозина (зрелый маркер myotube / myofiber), как описано в предыдущих публикациях 19 , 20 .
    1. Промывают фиксированные клетки 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
    2. Добавить блокирующий буфер (PBS)С добавлением 5% сыворотки осла, 3% BSA и 0,3% Triton X-100) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
    3. Инкубируйте клетки с антителами против перилипина (2 мкг / мл) и / или анти-S-миозина (2 мкг / мл) при 4 ° С в течение ночи.
    4. Промывают клетки 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Инкубируйте клетки с антителами Alexa 555 осла анти-кролика (4 мкг / мл) и / или Alexa555 осла против мыши (4 мкг / мл) при комнатной температуре в течение 1 часа.
    6. Промывают клетки 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
    7. Смонтируйте иммуноокрашенные клетки с помощью монтажной среды, содержащей DAPI (см. Таблицу материалов). Изучить экспрессию перилипина и S-миозина с использованием флуоресцентного микроскопа (возбуждающий лазер: 543 нм, возбуждение 540/45 нм и эмиссию 600/50 нм) и получить изображения под объектив 40X (0,60 NA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Параметры FACS, включая интенсивность лазера и коррекцию канала, корректируются на основе результатов контроля без контроля и одноцветного управления. Управление PDGFRβ-PE-FMO используется для установки стробирования для популяции PDGFRβ-PE + ( рисунок 1A ). Среди клеток PDGFRβ-PE две популяции, представляющие клетки Nestin-GFP + и Nestin-GFP, четко разделены ( фиг. 1A ). Границы стробирования для популяций...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Перициты являются мультипотентными периваскулярными клетками 22 , 23 , расположенными на абляминальной поверхности капилляров 21 , 26 . В скелетных мышцах перициты способны дифференцироваться по адипогенным и / или миогенным путям 19 , 20 , 24 . Недавние исследования выявили две субпопуляции перицитов с различно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом Фонда-Фонда Фонда диетологии Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) и гранта на развитие науки от Американской кардиологической ассоциации (16SDG29320001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сортировщик ячеекSonySH800
Автоматическая настройка бусинSonyLE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin SigmaT48402
Среда для роста перицитовScienCell1201
MSC Базальная среда (мышь)Stemcell Technologies5501
Адиогенная стимулирующая добавка (мышь)Stemcell Technologies5503
Фетальная бычья сывороткаGibco16000
Лошадиная сывороткаSigmaH1270
Коллагеназа типа 2WorthingtonLS004176
0,25% трипсина/ЭДТА Gibco25200
Пенициллин/стрептомицинGibco15140
PDLSigmaP6407
PDGFRβ-PE антителаeBioscience12-1402
Антитела к перилипинуSigmaP1998
Антитела к S-миозинуDSHBMF-20
Alexa 555-антитела к кролику& НБСП;ThermoFisher ScientificA-31572
Alexa 555-антимышиное антителоThermoFisher ScientificA-31570
Монтажная среда с DAPIVector LaboratoriesH-1200
DAPIThermoFisher ScientificD1306
HEPESGibco15630
EDTAFisherBP120
BSASigmaA2058
NH4ClFisher ScientificA661
KHCO3Fisher ScientificP184
PBSGibco14190
18 G ИглыBD305196
10 мл серологическая пипеткаBD357551
OneComp eBeadseBioscience01-1111

Ссылки

  1. Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
  2. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  3. Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
  4. von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
  5. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  6. Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
  7. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  8. Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
  9. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  10. Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
  11. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  12. Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
  13. Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
  14. Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499(2011).
  15. Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
  16. Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
  17. Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
  18. Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
  19. Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
  20. Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415(2016).
  21. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  22. Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
  23. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
  24. Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
  25. Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).
  26. Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Изоляция перицитовметод FACSPDGFR-бетаNestin-GFPскелетная мышцаперициты I типасортировка клетокфлуоресцентная микроскопиядифференцировка клеток
Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.