Эта работа описывает протокол на основе FACS, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение перицитов типа I и типа II из мышечных скелетных мышц
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Перициты являются периваскулярными мультипотентными клетками, которые проявляют гетерогенность в разных органах или даже в пределах одной и той же ткани. В скелетных мышцах есть по крайней мере две субпопуляции перицитов (так называемые тип I и тип II), которые экспрессируют различные молекулярные маркеры и обладают отличными возможностями дифференциации. С использованием двойных трансгенных мышей NG2-DsRed и Nestin-GFP успешно прошли выделение перициты типа I (NG2-DsRed + Nestin-GFP - ) и типа II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ). Однако доступность этих двойных трансгенных мышей предотвращает широкое использование этого метода очистки. Эта работа описывает альтернативный протокол, который позволяет легко и одновременно изолировать перициты типа I и типа II от скелетных мышц. Этот протокол использует технологию сортировки с активированной флуоресценцией клеток (FACS) и нацелен на PDGFRβ, а не NG2 вместе с сигналом Nestin-GFP. После изоляции введите I и tyПерициты пе II обладают отчетливыми морфологиями. Кроме того, перициты I и II типа, выделенные этим новым методом, как, например, выделенные из двойных трансгенных мышей, являются адипогенными и миогенными соответственно. Эти результаты позволяют предположить, что этот протокол может быть использован для выделения субпопуляций перицитов из скелетных мышц и, возможно, из других тканей.
Введение
Мышечная дистрофия - дегенеративное расстройство мышц, которое пока не имеет эффективных методов лечения. Развитие терапии, способствующей регенерации тканей, всегда вызывало большой интерес. Регенерация и восстановление тканей после повреждения зависят от резидентных стволовых клеток / клеток-предшественников 1 . Сателлитные клетки представляют собой миогенные клетки-предшественники, которые способствуют регенерации мышц 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Их....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Трансгенных мышей дикого типа и Nestin-GFP размещали на объекте для животных в Университете Миннесоты. Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных при Университете Миннесоты и были в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных NIH.
1. Мышечная диссекция и одноклеточная изоляция
- Усыпите взрослых мышей (6-10 недель, мужчин и женщин) трибромоэтанолом (250 мг / кг, внутрибрюшинно) и простерилизуйте их кожу живота 70% -ным этанолом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромэтанол использовался здесь вместо кетамина для анестезии / эвтаназии, поскольку из....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Параметры FACS, включая интенсивность лазера и коррекцию канала, корректируются на основе результатов контроля без контроля и одноцветного управления. Управление PDGFRβ-PE-FMO используется для установки стробирования для популяции PDGFRβ-PE + ( рисунок 1A ). Среди клеток PDGFRβ-PE две популяции, представляющие клетки Nestin-GFP + и Nestin-GFP, четко разделены ( фиг. 1A ). Границы стробирования для популяций.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Перициты являются мультипотентными периваскулярными клетками 22 , 23 , расположенными на абляминальной поверхности капилляров 21 , 26 . В скелетных мышцах перициты способны дифференцироваться по адипогенным и / или миогенным путям 19 , 20 , 24 . Недавние исследования выявили две субпопуляции перицитов с различно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У всех авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантом Фонда-Фонда Фонда диетологии Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) и гранта на развитие науки от Американской кардиологической ассоциации (16SDG29320001).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Сортировщик ячеек | Sony | SH800 | |
| Автоматическая настройка бусин | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Среда для роста перицитов | ScienCell | 1201 | |
| MSC Базальная среда (мышь) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Адиогенная стимулирующая добавка (мышь) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Gibco | 16000 | |
| Лошадиная сыворотка | Sigma | H1270 | |
| Коллагеназа типа 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0,25% трипсина/ЭДТА | Gibco | 25200 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE антитела | eBioscience | 12-1402 | |
| Антитела к перилипину | Sigma | P1998 | |
| Антитела к S-миозину | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-антитела к кролику& НБСП; | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-антимышиное антитело | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Монтажная среда с DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18 G Иглы | BD | 305196 | |
| 10 мл серологическая пипетка | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
Ссылки
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispens....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
