Эта рукопись описывает метод для визуализации и количественно локализованное события субцеллюлярные отсеков. Подход, предложенный в этой рукописи требует базовой конфокальный тепловизионные системы и реагенты и быстрое и экономически эффективным.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Механизмы, регулирующие перевод мРНК участвуют в различных биологических процессах, например зародышевой линии развития, дифференцировки клеток и органогенез, а также в нескольких заболеваний. Многочисленные публикации убедительно показали, что конкретные механизмы плотно регулировать перевод мРНК. Повышенный интерес в перевод индуцированной регуляции экспрессии белков привело к разработке новых методов изучать и следовать de novo белка синтеза в cellulo. Однако большинство этих методов являются сложными, что делает их дорогостоящей и зачастую ограничивает количество мРНК-мишеней, которые могут быть изучены. Эта рукопись предлагает метод, который требует только основные реагенты и конфокальный флуоресценции тепловизионные системы измерения и визуализировать изменения в переводе мРНК, которые происходят в любой ячейке линии при различных условиях. Этот метод был недавно используется локализованный перевод в внутриклеточных структур адэрентных клеток за короткий период времени, таким образом предлагая возможность визуализации de novo перевода короткий период во время различных биологических процессы или проверка изменений переводческая деятельность в ответ на конкретные стимулы.
Введение
Правила перевода различных клеточных функций побудило многие исследовательские группы для разработки новых инструментов и методов для определения субцеллюлярные локализации перевод мРНК и регулируемых белка синтез1,2 ,3,4. Эти последние технологические достижения позволяют добиться более глубокого понимания механизмов, связанных с переводом upregulation или репрессий конкретные мРНК в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастазов5 ,6....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определение Puromycilation условия
Примечание: Этот метод описывается метод, используемый для оценки локализованный перевод во время процесса адгезии MRC-5 клеток 5. Как puromycilation может быть сделано в любой ячейке, важно оптимизировать puromycilation условий для конкретных клеточных линий, которые будут использоваться, потому что условия лечения не являются идентичными для каждой ячейки строки с точки зрения концентрации puromycin и желаемого Время инкубации. Чтобы показать, каким образом определяются эти условия, с увеличением концентрации puromycin для различных инкубации раз лечили три примера клеточных л....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Точно соблюдать перевод событий с помощью puromycin включения, важно, чтобы определить оптимальные условия для каждой ячейки строки, потому что каждый показывает различные puromycin включения кинетика (рис. 1)9,11 ,12,18. Таким образом, чтобы проверить включение puromycin, это необходимо для лечения линии нужной ячейки с стандартиз.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Последние технологические достижения позволили лучше понять механизмы, участвующие в трансляционной upregulation или репрессии в отношении конкретных mRNAs в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастаз. Экономически эффективные методологии, описанной здесь позволяет перевод событий для отображения в ячейках для изучения, как RNA-связывая протеинов регулировать метастатических процессов, таких как клеточной адгезии, миграции и вторжения.
Хотя были раз.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим д-р Рашид Mazroui (Университет Лаваля, Квебек, Канада) для критических чтении рукописи. Мы благодарим Imaging группа клеток научно-исследовательского центра для их технической помощи. М.-É. Хуот является младший 1 исследования ученый Fonds de Recherche дю Квебек-здоровью (FRQ-S). Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (номер КНИИЗ, СС-286437 к. м.-É гранта. Хуот).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM | wisent | 319-005-CL | |
| Trypsine | wisent | 325-043 EL | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Puroycin антитела 12D10 | EMD миллипоры | MABE343 | разведение вестерн-блоттинга 1:25 000 Иммунофлуоресцентное разведение 1:10 000 |
| Anti-mouse IgG, HRP-связанная | клеточная сигнализация антител технология | 7076 | западный блоттинг разведение 1:8,000 |
| Western Lightning Plus-ECL | Perkin Elmer | NEL104001EA | |
| Антимышиный IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate) | технология клеточной сигнализации | 4408 | иммунофлуоресценция разведение 1:400 |
| CF568 Фаллоидин | биотий | 00044 | иммунофлуоресценция разведение 1:400 |
| Циклогексмид | Sigma | C1988-1G | 50&микро; г/мл конечной концентрации |
| DAPI (4',6-Диамидино-2-Фенилиндол, Дигидрохлорид) | Инвитроген | D1306 | конечная концентрация 1&микро; г/мл |
| Puromycin | bio-Basic | PJ593 | 2.5&микро; г/мл до 10&микро; г/мл |
| Ibidi µ-Dish 35 мм, высокий, ibiTreat | Ibidi | 81156 | |
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| Huh-7 | cells от Dr. Mazroui (Université Laval) | ||
| Fv1000 | olympus | конфокальная система визуализации | |
| программное обеспечение | http://fiji.sc | ||
| PBS (фосфат баффекрасный физиологический раствор) | био-базовый | PD8117 | |
| формальдегид 37% раствор | био-базовый | C5300-1 | |
| Triton X-100 | био-базовый | TB0198 | |
| BSA | Биореагенты Fisher | BP9702-100 | |
| Tween20 | Биореагенты Fisher | BP337-500 |
Ссылки
- Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
- Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
