Методическая статья

Количественные иммунофлюоресценции для измерения глобального локализованный перевод

DOI:

10.3791/55909

⸱

22 августа 2017 г.

 , 
1Centre de Recherche sur le Cancer de l’Université Laval, Faculté de Médecine, Département de Biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Université Laval, 2CRCHU de Québec: L’Hôtel-Dieu de Québec

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись описывает метод для визуализации и количественно локализованное события субцеллюлярные отсеков. Подход, предложенный в этой рукописи требует базовой конфокальный тепловизионные системы и реагенты и быстрое и экономически эффективным.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Механизмы, регулирующие перевод мРНК участвуют в различных биологических процессах, например зародышевой линии развития, дифференцировки клеток и органогенез, а также в нескольких заболеваний. Многочисленные публикации убедительно показали, что конкретные механизмы плотно регулировать перевод мРНК. Повышенный интерес в перевод индуцированной регуляции экспрессии белков привело к разработке новых методов изучать и следовать de novo белка синтеза в cellulo. Однако большинство этих методов являются сложными, что делает их дорогостоящей и зачастую ограничивает количество мРНК-мишеней, которые могут быть изучены. Эта рукопись предлагает метод, который требует только основные реагенты и конфокальный флуоресценции тепловизионные системы измерения и визуализировать изменения в переводе мРНК, которые происходят в любой ячейке линии при различных условиях. Этот метод был недавно используется локализованный перевод в внутриклеточных структур адэрентных клеток за короткий период времени, таким образом предлагая возможность визуализации de novo перевода короткий период во время различных биологических процессы или проверка изменений переводческая деятельность в ответ на конкретные стимулы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Правила перевода различных клеточных функций побудило многие исследовательские группы для разработки новых инструментов и методов для определения субцеллюлярные локализации перевод мРНК и регулируемых белка синтез1,2 ,3,4. Эти последние технологические достижения позволяют добиться более глубокого понимания механизмов, связанных с переводом upregulation или репрессий конкретные мРНК в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастазов5 ,6,,78. Однако большинство из этих методов требуют дорогих или опасных реагентов и специального оборудования, которые не могут быть доступны для большинства лабораторий. Таким образом был разработан эффективный метод для быстрой оценки перевод событий специально обойти эти потенциальные проблемы. Этот метод обнаруживает острый трансляционная модуляций, которые происходят во время конкретных клеточных процессов, а также позволяет для локализации перевода с помощью конфокальной микроскопии.

Описанные здесь методы были использованы для мониторинга локализованный перевод в течение субцеллюлярные отсеков под названием распространяя возбуждение центров (SIC)5. Шиц являются переходных структур, обнаруженных в сеяный клеток, которые локализуются на вершине зарождающейся адгезии комплексов. Хотя Шиц и адгезии комплексы отличаются друг от друга, их судьбы тесно связаны. Действительно SICs известны постепенно исчезают после фокуса адгезии комплекс созревания в сайт адгезии на начальном этапе адгезии. Мы обнаружили, что RNA-связывая протеинов, известный специально контролировать мРНК перевода (например, Sam68, FMRP и G3BP1) и polyadenylated, РНК обогатились в рамках этих структур5. С помощью методов, описанных здесь, мы показали, что регулирование SIC-связанные мРНК, перевод действует как КПП позволяет посеян клетки для консолидации клеточной адгезии. Этот метод, основанный на puromycin включения, можно считать адаптированную версию поверхности зондирования перевод пробирного (закат). Первоначально разработанный для измерения скорости синтеза глобального белка с помощью радиоактивно обозначенные аминокислоты, протеин puromycilation предлагает эффективный способ визуализации белка de novo синтеза9. Этот метод полагается на внутренние поведение puromycin, антибиотик, который блокирует перевод через прекращение преждевременной цепи в рибосома10. Действительно puromycin структурно аналогичен тирозил тРНК, который позволяет для включения в удлинения пептидные цепи через образование пептидных связей. Однако puromycin привязки к растущей цепи пептида предотвращает формируется с следующей аминоацил тРНК, так как puromycin не hydrolysable Амид облигаций вместо hydrolysable Эстер Бонд в tRNAs нового Бонда пептид. Таким образом включение puromycin в удлинения полипептиды приводит к преждевременной выпуска многочисленных усеченная puromycilated полипептиды, соответствующий активно переводится мРНК9,11,12 .

С помощью этого метода, можно было оценить активный перевод в течение короткого времени вдова (например, 5 минут) во время клеточной адгезии с использованием специфического антитела, направленные против puromycin на клетки, которые были дополнены антибиотика для периодов 5-мин в точках в разное время в ходе процесса адгезии клеток5. Точность этот assay полагается на весьма специфические антитела, направленные против puromycilated группу. Immunofluorescent обнаружения puromycilated полипептида обеспечивает общий субцеллюлярные передел недавно переведенные мРНК, которые также могут быть количественно с большой точностью с помощью конфокальной систем тепловидения.

Следовательно этот метод предлагает соответствующую опцию для большого числа лабораторий, изучая трансляционная регулирующих механизмов, участвующих в процессах таких нейронов грануляции6,13,14, 15, morphogen мРНК локализации и перевода во время развития16,17. Это также хорошо подходит для изучения локализованных или разобщенным перевод во время быстрого биологических событий, например миграции клеток, адгезии или вторжения, или просто оценить медикаментозного лечения, которые могли бы побудить поступательные изменения5, 7 , 18. в целом, этот метод позволяет для визуализации событий локализованных или контролируемых перевод в быстрый, точный и экономически эффективным способом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Определение Puromycilation условия

Примечание: Этот метод описывается метод, используемый для оценки локализованный перевод во время процесса адгезии MRC-5 клеток 5. Как puromycilation может быть сделано в любой ячейке, важно оптимизировать puromycilation условий для конкретных клеточных линий, которые будут использоваться, потому что условия лечения не являются идентичными для каждой ячейки строки с точки зрения концентрации puromycin и желаемого Время инкубации. Чтобы показать, каким образом определяются эти условия, с увеличением концентрации puromycin для различных инкубации раз лечили три примера клеточных линий (т.е., HeLa, MRC-5 и да-7) ( рис. 1).

  1. Растут идентичные количество клеток в 24-ну пластины в 0,5 мл соответствующий полный культуры среднего 16 h до испытания. Семян 30000 MRC-5 клеток, 50000 НеЬа клетки или 50000 ха-7 ячеек на хорошо. Убедитесь в том избежать превышения 60-70% слияния (рис. 1A).
  2. Подготовка 6 трубок с 1,5 мл полного ячейки питательной среды с увеличением концентрации puromycin (0, 5, 10, 15, 20 и 30 мкг/мл). Предварительно теплой температуре 37 ° C.
  3. Для каждой концентрации puromycin среды (подготовленные в шаге 1.2), передачи 0,5 мл от каждой трубки в 6 новых труб и добавьте циклогексимида в конечной концентрации 50 мкг/мл все 6 новой трубы. Предварительно теплой температуре 37 ° C.
  4. Изменения в среду с 0,5 мл полной питательной среды (строки 1 и 2). Для третьей строки, добавить 0,5 мл полной питательной среды, дополнена 50 мкг/мл циклогексимида ( рис. 1B).
    Примечание: Циклогексимида лечения был создан как лучший отрицательный контроль для белка puromycilation из-за его способность блокировать перевод удлинения. Потому что puromycin включения требует перевода удлинение, циклогексимида лечения приводит к потере puromycilated белка сигналов 5 , 18.
  5. Инкубируйте 15 мин при 37 ° C (5% CO 2).
  6. Добавить 0,5 мл puromycin среды в шаге 1.2 на второй строке готовы получить окончательный концентрации 0, 2.5, 5, 7,5, 10 и 15 мкг/мл, соответственно, в колонках A, B, C, D, E и F. В то же время, добавить 0,5 мл puromycin дополнены циклогексимида средний (шаг 1.3) в третьей строке ( рис. 1 c).
  7. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C (5% CO 2).
  8. Добавить 0,5 мл среды puromycin, подготовленный на шаге 1.2 в первой строке для получения окончательного концентрации 0.0, 2.5, 5, 7,5, 10 и 15 мкг/мл ( рис. 1 c).
  9. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C (5% CO 2).
  10. Мыть каждый хорошо от строки 1-3 с 1 мл ледяной 1 X фосфат амортизированное солевой раствор (PBS) 5 мин после того из puromycin скважин первой строки (мыть дважды). 75 мкл буфера 1 X Laemmli (4% лаурилсульфат натрия (SDS), 4% 2-меркаптоэтанол, 0.120 Tris-HCl M pH 6.8, 0,004% бромфеноловый синий и 10% глицерина) для получения всего-lysates клетки для каждого условия.
  11. Запуск 10% SDS-Полиакриламид гель-электрофорез (SDS-PAGE) с использованием 1/3 подготовленных образцов для оценки puromycin включения.
    1. Определяют уровень puromycin включение на Вестерн-блот анализ с использованием анти puromycin антитела (12 D 10) разводят в соотношении 1: 25000 в основное антитело инкубации буфер (2% бычьим сывороточным альбумином (БСА)) и 430 мм NaCl, 10 мм трис рН 7,4, 0.01% Азид натрия).
      Примечание: Представитель изображения, соответствующие линии различных клеточных экстрактов, как описано в шаге 1 приведены в качестве примера на рис. 2.

2. В Cellulo Локализованный перевод визуализации

Примечание: метод, описанный здесь была использована для оценки локализованный перевод в пределах SICs MRC-5 клеток во время процесса адгезии 5. Хотя здесь используются MRC-5 клетки, другие клеточные линии может использоваться с той же методологии, описанной в шаге 2.1.

  1. Клетки подготовки.
    1. Отсоединить MRC-5 клеток с использованием 0,25% трипсина/2.21 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в Хэнк ' s сбалансированный соли раствора (HBSS). Пелле клетки центрифугированием (5 мин на 200 x g) в 15 мл конические пластиковых пробирок и приостановить их в Дульбекко ' s Modified Eagle среднего (DMEM) дополнены 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) на 40 000 клеток/мл после подсчета с Счетной палатой.
    2. Инкубировать подвесной клетки при 37 ° C под нежным вращения с помощью трубки ротатор для 20 мин для поддержания их во взвешенном.
      Примечание: Этот шаг очень важен для полной диссоциации фокуса адгезии комплексов.
    3. Плита 2 мл взвешенных MRC-5 клеток (40 000 клеток/мл) в два 35-мм стекло дно блюда. Используйте первое блюдо 35-мм стекло дно для puromycilation анализа (см. шаг 2.1.5) и использовать второй как отрицательный контроль (см. шаг 2.1.6).
    4. Сохранить клетки при 37 ° C (5% CO 2) 55 мин для клеточной адгезии и формирования SIC.
    5. Puromycin добавить на носитель в 35-мм стекло дно блюда (проба) с использованием концентрации, ранее определенных в разделе 1. Для лечения MRC-5 ячеек, используйте 10 мкг/мл puromycin 5 минут при 37 ° C (5% CO 2).
    6. Как отрицательный контроль, добавить циклогексимида второе блюдо 35-мм стекло дно 40 мин после посева клетки предварительно относиться к ним с 50 мкг/мл циклогексимида ( рис. 2B). Затем, 15 мин после добавления циклогексимида, добавить puromycin на носитель, используя то же концентрации и инкубации время как шаг 2.1.5 (например, использование 10 мкг/мл puromycin 5 минут при 37 ° C (5% CO 2) для MRC-5).
    7. Мыть каждой пластины дважды с 2 мл ледяной 1 X PBS и исправить клетки с 1 мл 4% формальдегида (разводят в 1 X PBS) 15 мин при комнатной температуре (RT).
      Предупреждение: Параформальдегида должен использоваться строго в химической Худ.
  2. Иммуноокрашивания.
    1. После фиксации параформальдегида, мыть три раза с 2 мл ПБС и проинкубируйте 20 мин на RT для разрушения клеток в 500 мкл PBS-TritonX-100 (0,5%).
    2. Для предотвращения неспецифических антитела связывая, блокировать образца с 500 мкл PBS – BSA (1%), 20 мин на RT.
    3. Вымойте три раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%) и проинкубируйте с 300 мкл 1:12,500 анти puromycin антитела (12 D 10) разводят в 1 X PBS для 1 h на RT.
    4. Мыть 3 раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%) и проинкубируйте с 300 мкл анти мыши IgG проспряганное Флюорофор (здесь, 488 нм) разводят в PBS для визуализации puromycilated полипептиды и с конъюгированных Фаллоидин в другой Флюорофор (здесь, 555 Нм) чтобы визуализировать F-миозина. Инкубировать 1 час на RT.
    5. Мыть три раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%) и затем Инкубируйте 5 мин на RT в 300 мкл PBS-Tween20 (0.1%) дополнены 1 мкг/мл 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    6. Мыть в три раза с 2 мл PBS-Tween20 (0.1%), а затем вымыть с 2 мл ПБС. Предотвратить клетки от высыхания, сохраняя образца в 2 мл ПБС во время захвата изображений в.

3. Immunofluorescent получение изображения

Примечание: следующая методология может использоваться с любой коммерчески доступных конфокальный съемочной системы.

  1. Определить соответствующие параметры для каждой Флюорофор увеличить динамический диапазон для квантификации.
    Примечание: Представитель количественной оценки могут быть получены только если избегать насыщения пикселей и порог сигнала регулируется должным образом. Эти настройки могут быть достигнуты путем тщательно регулировки мощности лазера, высокого напряжения (ВН), получить, и смещение.
    1. Отрегулируйте масштаб фактор (5 X) и количество пикселей (512 x 512) оптимизировать размер пикселя.
      Примечание: Это должно быть по крайней мере в 2.3 - раз меньше, чем оптическое разрешение, в соответствии с теоремой Найквиста.
    2. Снизить скорость сканирования (12,5-20 µs/пиксель) и использовать усреднения (2 - 3 раза) для улучшения соотношения сигнал шум согласно настройкам, упомянутых выше.
  2. Вручную определить соответствующий верхней и нижней фокальной плоскости вдоль оси z с размером оптимальный шаг (0,4 мкм/ломтик).
    Примечание: Шаг размер плоскости определяется осевой резолюции, разделенных 2.3, в соответствии с теоремой Найквиста. Как правило, 20-25 слоев необходимо покрыть всю ячейку глубина адэрентных клеток.
  3. Получить конфокальное изображение всего одну ячейку с 60 X плана АПО масло погружения цель (1,42 числовая апертура).

4. Immunofluorescent изображение количественной оценки

  1. Определение обогащения.
    1. Открыть изображение, соответствующее z плоскости слоя интерес из файла данных приобретенных ячейки, используя ImageJ программное обеспечение (freeware доступны на http://fiji.sc).
    2. Нарисовать линию с помощью инструмента рисования линии (панель инструментов → прямой) через регионы ячейки, где пожелана количественной оценки. Изменить ширину линии, дважды щелкнув на " прямо; " значения интенсивности будет среднем через ширина линии (8 на рис. 3).
      Примечание: Тонкие линии предпочтительнее избежать дублирования сигналов от разных структур.
    3. После линии правильно установлен, профиль сигнала плотность вдоль оси определяется (меню → анализ → участок профиля).
      Примечание: Будет открыто новое окно который показывает профиль соответствует интенсивности сигнала для каждого пикселя выбранного канала (конкретные Флюорофор) вдоль линии для выбранного раздела z самолет.
      1. Повторите процесс для каждого канала, соответствующее Флюорофор используется (то есть, один квантификации для 488, один для 568 и один для 405).
        Примечание: Значение интенсивности сигнала будет всегда быть заказаны после ориентацию линии нарисованные.
    4. Для получения численных значений серым для каждого пикселя профиля соответствующей количественной выбранного слоя z самолет, скопируйте данные профиля (меню в окне изображения → копию) и вставьте его в любое программное обеспечение электронной таблицы.
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. повторите шаги для каждой плоскости z раздел приобретенных конфокальное изображение и каждый канал, где пожелана квантификации.
      Примечание: Количественная оценка различных слоев в плоскости z можно объединить для получения общей оценки специальных обогащения сигнала путем расчета суммы значение каждого пикселя вдоль линии для каждого слоя z самолет. Этот тип объединения может быть достигнуто только в том случае, если линия идентичен для каждого слоя z самолет, включены в средние значения.
    6. Качестве альтернативного метода для количественной оценки поклеточного различных каналов с большим количеством слоев, используйте макрос называется StackprofileData (см. Дополнительный файл).
      Примечание: Этот макрос доступен свободно на https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt и могут быть использованы следующим образом:
      1. Вставить макрос в текстовый файл и сохраните его.
      2. Открыть файл изображения, который включает все конфокальный слои клеток.
      3. Нарисовать линию, как описано в шаге 4.1.2, откройте новое окно для импорта макрос (меню → плагины → макросы → запустить), выберите ранее сохраненный текстовый файл, соответствующий макрос StackprofileData и нажмите " открыть. "
        Примечание: После ввоза макрос, новое окно с именем " результаты " откроет все и количественной вдоль оси определяется для каждого слоя в плоскости z, будут перечислены канал присутствует в файлах изображений.
      4. Копирования данных для каждого канала (меню → редактировать → копия) для получения представления графический профиль, соответствующий сигнал количественной. Вставьте его в любое программное обеспечение электронной таблицы. Рассчитайте сумму значение каждого канала для каждого пикселя вдоль линии для каждого слоя в плоскости z. Использовать эти значения для создания графическое представление аналогично представленному на рисунке 3.
  2. Количественная оценка сигнала сотовой участком или объем.
    1. Открыть файл изображения с программным обеспечением ImageJ.
    2. Нарисовать область для обозначения области интересов, используя функцию геометрической формы (панель инструментов → " прямоугольник, " " овал, " или " полигона ").
      Примечание: Значение количественной оценки будет определяться для области соответствующим обращается форме.
    3. Настроить уровень порог чтобы избежать любого фонового сигнала (меню → настроить изображение → порог); представлять интенсивности пикселей в форме гистограммы появится новое окно. Измените значения для включения/исключения пикселей в количественной оценке с помощью ползунка. Выберите порог, который устраняет красные пиксели вне клетки, как пикселей, выделены красным цветом будут включены в квантификации.
    4. Определить параметры измерения для количественного определения пиксела сигнала внутри выделенной области, без фонового сигнала (меню → анализ → набор измерений) и не забудьте проверить " предел порогового значения " и " интегрированных плотность " коробки.
    5. Измерения количественных значений для выбранной области (меню → анализ → мера).
      Примечание: Количественная оценка интенсивности сигнала будет представлена в новом окне под " IntDen " идентификации, который представляет собой продукт средние значения серого и количество пикселей в выбранной области.
    6. Нарисовать область, которая включает в себя всю ячейку с помощью геометрической формы (панель инструментов → " прямоугольник, " " овал, " или " полигона ") и приступить к 4.2.3-4.2.5 шаги, чтобы получить значение, соответствующее общего сигнала. Рассчитать отношение сигнала в пределах выбранной области за весь сигнал для получения процентов сигнала в пределах области интересов.
    7. 4.2.2-4.2.6 повторить шаги для получения количественной оценки объема клетки для каждой плоскости z. Адаптировать геометрической формы, при необходимости.
    8. Скопируйте данные получены из " результаты " windows для каждого слоя плоскости z в электронную таблицу для графическое изображение и найти среднее значение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точно соблюдать перевод событий с помощью puromycin включения, важно, чтобы определить оптимальные условия для каждой ячейки строки, потому что каждый показывает различные puromycin включения кинетика (рис. 1)9,11 ,12,18. Таким образом, чтобы проверить включение puromycin, это необходимо для лечения линии нужной ячейки с стандартиз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Последние технологические достижения позволили лучше понять механизмы, участвующие в трансляционной upregulation или репрессии в отношении конкретных mRNAs в биологических процессах, например развития нервной системы, ответ наркотиков и метастаз. Экономически эффективные методологии, описанной здесь позволяет перевод событий для отображения в ячейках для изучения, как RNA-связывая протеинов регулировать метастатических процессов, таких как клеточной адгезии, миграции и вторжения.

Хотя были раз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-р Рашид Mazroui (Университет Лаваля, Квебек, Канада) для критических чтении рукописи. Мы благодарим Imaging группа клеток научно-исследовательского центра для их технической помощи. М.-É. Хуот является младший 1 исследования ученый Fonds de Recherche дю Квебек-здоровью (FRQ-S). Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (номер КНИИЗ, СС-286437 к. м.-É гранта. Хуот).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMwisent319-005-CL
Trypsinewisent325-043 EL
FBSThermo Fisher Scientific12483020
Puroycin антитела 12D10EMD миллипорыMABE343разведение вестерн-блоттинга 1:25 000
Иммунофлуоресцентное разведение 1:10 000
Anti-mouse IgG, HRP-связаннаяклеточная сигнализация антител технология7076западный блоттинг разведение 1:8,000
Western Lightning Plus-ECLPerkin ElmerNEL104001EA
Антимышиный IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)технология клеточной сигнализации4408иммунофлуоресценция разведение 1:400
CF568 Фаллоидинбиотий00044иммунофлуоресценция разведение 1:400
ЦиклогексмидSigmaC1988-1G50&микро; г/мл конечной концентрации
DAPI (4',6-Диамидино-2-Фенилиндол, Дигидрохлорид)ИнвитрогенD1306конечная концентрация 1&микро; г/мл
Puromycinbio-BasicPJ5932.5&микро; г/мл до 10&микро; г/мл
Ibidi µ-Dish 35 мм, высокий, ibiTreatIbidi81156
MRC-5 cellsATCCCCL-171
HeLa cellsATCCCCL-2
Huh-7cells от Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000olympusконфокальная система визуализации
программное обеспечениеhttp://fiji.sc
PBS (фосфат баффекрасный физиологический раствор)био-базовыйPD8117
формальдегид 37% растворбио-базовыйC5300-1
Triton X-100био-базовыйTB0198
BSAБиореагенты FisherBP9702-100
Tween20Биореагенты FisherBP337-500
Фиджи

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192(2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. nS. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968(2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MRC 5

Похожие статьи