Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Summary

Представлен метод создания и живого изображения различных гуманизированных нитей костного мозга у мышей. Основываясь на поддерживающей нише, созданной человеческими мезенхимальными клетками, добавление эндотелиальных клеток человека индуцирует образование сосудов человека, в то время как добавление rhBMP-2 индуцирует образование мышино-мышиной химерной зрелой костной ткани.

Abstract

Человеческие гемопоэтические стволовые клетки (HSC) находятся в нише костного мозга (BM), сложной многофакторной сети компонентов, продуцирующих цитокины, факторы роста и внеклеточный матрикс. Способность HSC оставаться спокойным, самовосстанавливаться или дифференцироваться, приобретать мутации и становиться злокачественными, зависит от сложных взаимодействий, которые они устанавливают с различными стромальными компонентами. Чтобы наблюдать перекрестные помехи между человеческими HSC и человеческой нитью человека в физиологических и патологических состояниях, мы разработали протокол для эктопической модели и изображения гуманизированной ниши BM у иммунодефицитных мышей. Мы показываем, что использование различных клеточных компонентов позволяет формировать гуманизированные структуры и возможность поддерживать долгосрочное кроветворное кроветворение человека. Используя двухфотонную микроскопию, мы можем жить-изображать эти структуры in situ при разрешении одной ячейки, обеспечивая мощный новый инструмент для функциональной характеристики человеческого BM mМикроокружение и его роль в регуляции нормального и злокачественного гемопоэза.

Introduction

Решения о клеточной судьбе, наблюдаемые в отделениях стволовых клеток, жестко регулируются как внутренними, так и внешними факторами. В частности, в настоящее время широко признано, что микроокружение BM играет фундаментальную роль в контроле переключения в HSC от покоя до активного состояния, а также в решении ¹ самообновления или дифференциации. Более того, недавние данные показывают, что гематологические злокачественные опухоли влияют на функцию микроокружения BM, указывая на существование активных перекрестных помех между двумя отделениями ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Несмотря на недавние достижения, многие ключевые вопросы остаются в отношении того, как активность отдельных компонентов BM-ниши способствует поведению HSC и злокачественной трансформации.

Микроокружение BM является очень гетерогенным Энером и сложной смесью многих типов клеток, каждая со специальными функциями. Обильный эндотелий (EC) и сосудистый компонент регулируют оборот питательных веществ и метаболитов, вход и выход различных клеток в BM и из BM и несколько функций HSC ^{7 , 8} . Мезенхимальные стромальные клетки (MSC), гетерогенная популяция недифференцированных стволовых клеток и предшественников, выделенных тремя различными линиями ( то есть остеогенными, хондрогенными, адипогенными), являются еще одним фундаментальным компонентом ниши BM. Эти MSC локализуются как в центральных областях БМ, так и вблизи эндостиального региона. Они могут быть связаны с сосудистыми структурами и связаны с регуляцией функции HSC ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13 ,}"> 14 ^{, 15} .

Многие сообщения указывают на то, что HSC находятся на разных определенных участках мозга и что их функция может зависеть от их точной локализации. Большинство существующих знаний о HSC и их взаимодействии с микроокружением BM происходит из исследований на мышах ¹ . Использование моделей ксенотрансплантата распространило эти знания на нормальные и злокачественные HSC человека, приживаясь в мышином BM иммунодефицитных мышей ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} . Несмотря на то, что это представляет собой приемлемую модель, она по-прежнему представляет собой множество проблем, таких как необходимость усвоения мыши-реципиента в большинстве случаев для обеспечения самонаведения и приживления человеческого HSC или межвидового барьера и его слабо понимаемого влияния на взаимодействия клеток и клеток функции.

Использование нейтрализующих антител и генетически модифицированных мышей наряду с ксенотрансплантацией сыграло важную роль в освещении сложного диалога, который человеческие HSC устанавливают с их микросредами. Введение и развитие внутривидовой двухфотонной конфокальной микроскопии продвинуло эти исследования на шаг вперед, позволяя прямое, высокое разрешение и динамическое изображение костного мозга ^{19 , 20 , 21 , 22} и обеспечивает мощный инструмент для функционального Характеристика микроокружения BM и ее роль в регулировании функции HSC. Чтобы обойти некоторые проблемы, возникающие в классических моделях ксенотрансплантации, концепция интродукции гуманизированной структуры БМ была выдвинута на первый план. Слияние биоматериалов и концепций имплантации клеток, отчеты показали возможность подражания человеческой кости мArrow микроокружение в гетеротопических областях ^{23 , 24 , 25 , 26 , 27} . Это открывает возможность использования биоинженерии в моделях мыши для изучения нормального и злокачественного гемопоэза человека ^{28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39} , опухолеобразования и метастазов ^{40 , 41 , 42 , 43 , 44} .

Основываясь на предыдущем опыте в области инженерии костной ткани и визуализации in vivo ^{19 , 22 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52} , мы описываем протокол биоинженерии и жировых изображений органотипических человеческих BM-тканей. Эти структуры происходят от имплантации стромальных клеток, продуцируемых человеческим BM, в коллагеновые основы, подкожно привитые у иммунодефицитных мышей. В предыдущем докладе мы продемонстрировали, что человеческие MSC обеспечивают образование микроокружения человека, адекватного приживлению человеческих кроветворных клеток ⁴⁵ . Кроме того, здесь мы описываем, как совместная имплантация другого человеческого клеточного компонента BMS, такие как эндотелиальные клетки человека (hEC) и / или цитокины, важные для формирования костей ( например, hBMP2), сотрудничают с hMSC, чтобы генерировать различные гуманизированные микросреды, которые могут отображаться в реальном времени на месте .

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с PPL 70/8904, одобренными Министерством внутренних дел Великобритании и в соответствии с рекомендациями Cancer Research UK. Использование образцов человеческой пуповинной крови (UCB) и первичных образцов острой миелоидной лейкемии (AML) человека было одобрено Ист-Лондонским этическим комитетом после получения согласия и было проведено в соответствии с Хельсинкской декларацией.

1. Биоинженерные основы на основе коллагена с человеческими гемопоэтическими и стромальными клетками

ПРИМЕЧАНИЕ. Весь протокол должен выполняться в стерильных условиях и со стерильным материалом. Клеточная культуральная среда 1 соответствует hMSC-среде (MEM-α, P / S и 10% hMSC-FBS); Клеточная культуральная среда 2 соответствует среде ЕС (M199, 20% FBS, P / S, 10 мМ HEPES, 50 мкг / мл гепарина, 2 мМ глутамина и 50 мкг / мл ЭКГС), а клеточная культуральная среда 3 соответствует кроветворной среде (H5100 И P / S).

1. Подготовьте пуповинную кровь m(CB-MNCs) или первичный AML (костный мозг или MNC периферической крови) с использованием градиента плотности Ficoll-Paque в соответствии с хорошо установленными протоколами ⁵³ .
   1. Для AML истощают Т-клетки с использованием антитела OKT.3. Инкубируйте 4 мкг OKT.3 в 1 × 10 ⁶ AML MNC в течение 30 мин при комнатной температуре перед промыванием клеток в PBS. При необходимости криоконсервируют МНК в FBS с 10% ДМСО при 2 × 10 ⁸ клеток на мл.
2. Подготовьте культуры hMSC (культуральная среда 1) и EC (культура культуральной среды 2). Пластинчатые hMSC-клетки (см. Таблицу материалов ) на обычных колбах для культивирования клеток в среде hMSC. Пластины EC (см. Таблицу материалов ) на коллагеновых покрытиях с 1 покрытием в среде EC.
3. При 85-90% слияния клеток удаляют среду, дважды промывают PBS и добавляют раствор трипсина-ЭДТА (20 мкл на см ² ).
   1. Через 5 мин проверьте, что клетки отсоединены. Восстановите клетки путем разбавления 1:3 с клеточной культуральной средой. Центрифугируют при 300 × g в течение 5 мин и повторно суспендируют в соответствующей среде для каждого типа клеток и подсчитывают клетки с использованием камеры Нойбауэра.
   2. Используйте клетки при 2 × 10 ⁶ - 10 ⁷ клеток на мл. Если оба типа клеток необходимо использовать вместе, смешайте hMSC и EC суспензии в соотношении 1: 1.
4. Перенесите клеточную суспензию в шприц для инсулина.
5. Используя скальпель, вырежьте стерилизованную желатиновую губку ( например, gelfoam) начальные леса (20 мм x 60 мм x 7 мм) на 24 части одинакового размера (6,6 мм х 7,5 мм х 7 мм, рис. 1А и В ).
6. Восстановить желатиновые леса путем погружения в PBS (5 мин).
7. Один за другим осторожно помещайте лески в стерильную ткань, чтобы удалить избыток PBS. Перенесите леса в одну лунку 24-луночного планшета (сверхнизкая поверхность прикрепления) и используйте шприц для инъекции 50 мкл, содержащий 10 ⁵ - 10 ⁶ клеток (hMSC alОдин или в сочетании с hEC; Рисунок 1С ).
8. Повторите шаг 1,7 с каждым эшафотом, пока все необходимые леса не будут засеяны стромальными клетками.
9. Инкубируйте в течение 1 часа внутри инкубатора клеточной культуры (37 ° C и CO ₂ 5%).
10. Заполните каждую лунку 3 мл среды для культивирования клеток 1 ( рисунок 1D ) и верните строительные леса в инкубатор клеточной культуры (37 ° C и CO ₂ 5%) для инкубации в течение ночи. Используйте среду для культивирования клеток 2, если ECs используются в строительных лесах.
11. Thaw CB-MNC и изолировать клетки CD34 ⁺ от них согласно соответствующему протоколу комплекта CD34 ⁺ . Приостановите выбранные CD34 ⁺ клетки в среде 3 и подсчитайте их в камере Нойбауэра.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь клетки использовали при концентрации 2 × 10 ⁶ клеток на мл.
    1. Если используются первичные образцы, полученные из AML, оттаивают клетки, разбавляют их 1:10 в FBS, центрифугируют их в течение 5 мин при 300Xg, повторно суспендировать клетки в PBS-2% FBS, добавлять анти-человеческое антитело CD3 (2-4 мкг на 10 ⁶ клеток) и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин. Центрифугируют в течение 5 мин при 300 мкг и ресуспендируют в среде гематопоэтических клеток, дополненной цитокинами (20 нг / мл гранулоцитарно-колониестимулирующего фактора (G-CSF), 20 нг / мл IL-3 и 20 нг / мл тромбопоэтина (TPO)), ,
12. Повторите шаги 1,7 - 1,9, но в этом случае выделите 1 х 10 ⁵ человеческих гемопоэтических клеток вместо стромальных компонентов, как указано выше.
    1. Заполните лунку 3 мл клеточной культуральной среды 3 ( рис. 1D ) и верните строительные леса в инкубатор клеточной культуры (37 ° C и CO ₂ 5%) для инкубации в течение ночи. Используйте смесь 1: 1 клеточных культуральных сред 2 и 3 Если ECs используются в строительных лесах.
13. Для только рекомбинантных каркасных несущих каркасов кости-2 (rhBMP-2) человеческих костей осторожно помещайте лески один за другим на стерильную ткань для удаления избытка PBS. Перенесите леса в одну лунку на 96-луночный планшет ( рис. 1Е ) и добавьте 5 мкл rhBMP-2, тщательно покрывая эшафот.
    1. Добавьте 20 мкл тромбина, а затем 20 мкл фибриногена, тщательно покрывая каркас каждый раз ( рис. 1F ). Повторите процедуру для каждого леса, пока все необходимые леса не будут обработаны, а затем инкубируйте в течение 5-10 минут при 37 ° C. Проверьте, успешно ли сформирована коагуляция.

2. Хирургическая имплантация биоинженерных лесов

ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь использовались мышиные или женские, 6-12-недельные мыши NSG. Поскольку животные являются иммунодефицитными, все процедуры должны проводиться в стерильных условиях. Шаги 2.10 - 2.13 связаны с стратегиями выживания и послеоперационной опекой.

1. 60 - 120 мин до операции, подкожно назначают обезболивающее (carprofen, 5 мг / кг веса тела / мышь).
2. Вызывают анестезию в камере с 0,5% изофлураном и 2 л / мин O ₂ . Мышей следует постоянно контролировать во время процедуры. Перенесите животное в хирургическую зону в положении лежа, чтобы иметь легкий доступ к спине. Держите животное под наркозом, используя носовой конус, снабжающий 1,5% изофлурана и 2 л / мин O ₂ . Держите мышь под анестезией во время хирургической процедуры и часто проверяйте состояние животного.
3. Пока он находится под наркозом, используйте глазный гель на глазах мышей, чтобы предотвратить сухость, и держите мышь при 37 ° C.
4. Берегите хирургическую область на задней части мыши с помощью электрического триммера. Чтобы стерилизовать кожу, опустите наконечник хлопка в разбавленный клорексидин (разведенный 1:10 в PBS) и используйте этот наконечник для очистки поверхности кожи. Повторите эту процедуру дважды.
5. Используя стерильные щипцы и скальпель (или ножницы), сделайте от 0,5 до 0,7 см переднего и заднего полного разреза кожи. Использовать щипцыПод подкожной клетчаткой сделать карман.
6. Вставьте подкожную подставку, убедившись, что она находится глубоко внутри кармана ( рис. 1G и H ). Закройте разрез хирургическим клеем ( рис. 1I и J ).
7. Для лечения постхирургической боли подкожно вводить бупренорфин (0,1 мг / кг массы тела).
8. Во время восстановления поместите животное на бок в предварительно нагретую клетку и наблюдайте восстановление до нормального поведения.
9. Разбавьте обезболивающее средство в воде (карпрофен, 0,1 мг / мл воды) и предоставьте его животным в качестве питьевой воды в течение 4 дней после операции.
10. Часто проверяйте животное и рану в течение 48-часового послеоперационного периода для возможных побочных эффектов.

3. Мышцы, эвтаназия и выборка для визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ строительных лесов выполняется между8 и 24 недели после имплантации.

1. За 60 мин до визуализации держите имплантированную мышь в теплой коробке при 37 ° С и внутривенно вводите 100 мкл человеческого иммуноглобулина для блокирования неспецифических сайтов.
2. 30 мин до визуализации, внутривенно вводить 10 мкг (на мышь) специфических антител для маркировки интересующих клеток.
3. За 5 мин до визуализации внутривенно вводят 15 мкл (разведенный в 100 мкл PBS) меченого флуорофором, мешающего флуорофору, агента для объединения сосудов (655-VPA) для визуализации сосудистых структур.
4. Усыплять мышь через шейную дислокацию.
5. Используя острые ножницы, сделайте продольный разрез кожи на задней части мыши, рядом с исходным местом имплантации.
6. С помощью пинцета и ножниц аккуратно отделите кожу от подкожного кармана, где имплантирован эшафот.
7. Держите щит пинцетом и аккуратно эксплантируйте его с кожи, разрезая остаточную мембрану aИ ткани, окружающие леса, используя ножницы. См. Примеры строительных лесов, которые должны быть восстановлены на рисунке 2 .
8. Закрепите каркас быстродействующим адгезивным клеем на образной пластине (чашка Петри 35 мм × 10 мм) и заполните солевым раствором (PBS) при комнатной температуре.
9. Для лесов BMP, прежде чем заполнять пластину PBS, используйте хирургический микросверль для тонкой поверхности кости под микрохирургическим микроскопом; Это позволяет визуализировать флуороформу и захват изображения высокого разрешения. Используйте заусенцы 1,2 или 1,6 мм, в зависимости от размера леса.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Пользователь будет понимать, как много развернуть в зависимости от толщины кости. В целом, поскольку каркасы BMP васкуляризуются, кость слегка изменит цвет и станет более красной при приближении к правильной толщине изображения.
10. Вставьте пластину на стадию конфокального микроскопа.

4. Живое изображение с использованием двухфотонного микроскопаопировать

ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании неселективных детекторов (NDD) всегда используйте слайдер NDD для визуализации для направления флуоресценции на NDD. Конфигурация микроскопа представлена ​​на рисунке 3 .

1. Включите микроскоп и компьютер, запустите программное обеспечение, нажав «Запустить систему» ​​и перейдите в режим «Приобретение».
2. Отметьте поле «Показать ручные инструменты». В меню «Лазер» переключите «на» двухфотонный лазер и дайте ему прогреться и стабилизироваться.
3. В меню «Настройка изображения» одновременно активируйте «Режим канала» и «Переключить трек каждого кадра». В меню «Путь света» выберите «Non Descanned» и «Разделитель основного луча MBS 760+». Отметьте, чтобы активировать четыре NDD и установить конфигурацию, как показано на рисунке 3 .
   ПРИМЕЧАНИЕ. При такой конфигурации коллагеновый сигнал от костных структур (сек.Генерация гармонической гармоники, SHG) собирают при 380-448 нм, FITC-hCD31 + человеческие эндотелиальные клетки и AF488-hCD45 + человеческие гемопоэтические клетки при 500-550 нм и 655-VPA при 640-690 нм.
4. В меню «Channels» установите «длина волны лазера» до 890 нм и мощность до 50%. Установите «Gain (Master)» на 500-600, «Digital Offset» на 0 и «Digital Gain» на 15 для каждого канала. Отрегулируйте эти значения после начала приобретения.
5. В «режиме сбора данных» установите требуемые параметры для получения изображений с высоким разрешением без повреждения ткани и отбеливания флуорофоров. Установите «Режим сканирования» на «Рамка», «Размер рамки» на «x512 y512», «Шаг линии» до «1», «Скорость» до 9, «Усредняющее число» до 8, «Глубина бит» до «8 бит», Режим "на", "Направление" на "двунаправленный" и "Метод" означает "означает".
   1. Установите "ZoOm "до 1 для первоначального сканирования изображения и увеличить его, если требуется, чтобы сосредоточиться на определенных областях.
6. Поместите пластину, содержащую эшафот на ступень микроскопа, под линзу 20X, 1,0 NA с водой и опустите линзу, пока она не коснется солевого раствора. Установите фокус объектива на эшафот, используя окуляры микроскопа, используя лампу в качестве источника света.
7. Активируйте меню «Z-stack», выберите функцию «Первая / Последняя» и установите требуемый интервал между двумя субпоследовательными срезами ( например, 2-мкм Z-стек). Держите интервалы постоянными в Z-стеке.
8. Выберите «Live», чтобы отобразить живое сканирование образца и настроить «Цифровой коэффициент усиления» и «Цифровое смещение» для оптимальной экспозиции. Чтобы визуализировать несколько каналов одновременно, выберите функцию «Разделить».
9. В меню «Этап», находясь в режиме «Живой», отсканируйте изображения и «Отметьте» области интер-(ROI), таких как местоположение гемопоэтических клеток человека и сосудистых структур. Когда проверка образца завершена, перейдите к первому ROI, чтобы начать визуализацию.
10. В режиме «Живой» установите верхнюю и нижнюю части 3D-Z-стека вокруг интересующей области, используя функции «Установить первым» и «Установить последний». По завершении установите центр «C.». Начните приобретение ROI с помощью кнопки «начать эксперимент». См. Примеры изображений на рисунке 4 , рисунке 5 и рисунке 6 .
11. По завершении получения сохраните изображение в указанной папке. Перейдите к следующему ROI и повторите шаг 4.10. Как только эксперимент будет завершен, снимите пластину с микроскопом, аккуратно отделите образец от пластины и очистите остаточный клей.
12. Подготовьте образец для следующего метода анализа.

5. Образец процессаG для гистологии и иммуноокрашивания

ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы обрабатываются в соответствии с протоколом, описанным в общих лабораторных методах JoVE ^54, описывающих процессы фиксации, внедрения и секционирования образцов. Образующие кости образцы следует обрабатывать в течение 7 дней в декальцификаторе на основе EDTA между процессами фиксации и встраивания. Блокирующий / пермеабилизирующий раствор представляет собой 10 мМ буфера PBS pH 7,4 с 1% Triton X-100, 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 10% нормальной сыворотки коз (NGS).

1. Поместите кусочки в ксилоле в течение 10 мин), ксилол в течение 5 мин, 100% этанол в течение 5 мин, 70% этанола в течение 5 мин, 50% этанола в течение 5 мин и Н ₂ О в течение 5 мин.
2. Перенесите срезы на антиген, основанный на цитрате, разоблачающее рабочее решение.
3. Вскипятите ломтики в течение 15 минут и дайте им остыть до комнатной температуры.
4. Промойте срезы в 10 мМ раствора PBS pH 7,4 с 1% Triton X-100 (5 мин, 3 раза).
5. Передайте samК раствору для блокирования / пермеализации и инкубировать в течение 30 мин.
6. Добавить первичное антитело, разведенное в блокирующем / пермеабилизирующем растворе, и инкубировать в течение ночи при 4 ° С.
7. Промойте срезы в 10 мМ раствора PBS pH 7,4 с 1% Triton X-100 (5 мин, 3 раза).
8. Добавить вторичное антитело, разведенное в блокирующем / пермеабилизирующем растворе, в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре.
9. Промыть H ₂ O (5 мин, 3 раза).
10. Чтобы уменьшить фоновые флуоресценции, погрузите ломтики в рабочий раствор суданского черного раствора в течение 10 минут, в темноте и при комнатной температуре.
11. Вымойте ломтики в H ₂ O (5 мин, 3 раза).
12. Установите срезы с помощью флуоресцентной монтажной среды с DAPI (0,5 мкг / мл).
13. Храните ломтики при температуре 4 ° C и убедитесь, что монтажная среда сухая перед проведением флуоресцентной визуализации. См. Примеры изображений на рисунке 7 .

Results

На рисунке 1 показаны типичные изображения процессов посева и имплантации ячеистых клеток. На рисунке 1C обратите внимание, что клетки вводятся непосредственно в эшафот. На рисунке 1G обратите внимание, что надрез сделан в задней части мыши, где создается подкожный карман и имплантируется каркас. На рисунке 2 показана общая морфология различных лесов, имплантированных у мышей NSG и полученная через 8 недель. Обратите внимание на небольшую васкуляризацию в посевных лесах hMSC ( рисунок 2A ). Совместное поселение человеческих EC с hMSC на эшафоте позволяет формировать более значимую сосудистую сеть в лесах ( рис. 2B ). Наконец, присутствие rhBMP-2 вызывает образование костей. В этом случае извлекаемые строительные леса больше, и они состоят изКости, напоминающие твердые ткани.

На рисунке 3 показана настройка конфигурации канала на микроскопе для прямой видимости с помощью NDD (подробности в легенде). Рисунок 4 и Видео 1 показывают человеческие гемопоэтические клетки в hMSC-покрытых лесах. Леса были эксплантированы через 8 недель после имплантации и после внутривенной инокуляции антитела AF488-hCD45 и 655-VPA. Эта процедура позволяет визуализировать имплантированные гемопоэтические клетки человека и сосудистую структуру с помощью двухфотонной конфокальной микроскопии. В этом случае на изображениях показаны кровеносные сосуды (655-VPA) на каркасах и долгосрочное приживление гемопоэтических клеток человека (AF488-hCD45) в паренхиме лесов. Рисунок 5 и Видео 2 соответствуют человеческим каркасам, засеянным hECs и hMSC. Через 8 недель после операции, каркасы были эксплантированы после внутривенногоИнокуляция антитела FITC-hCD31 и 655-VPA, и изображения были получены с помощью двухфотонного конфокального микроскопа, как упоминалось ранее. Изображения показывают участие hECs в образовании сосудов в эшафоте, что приводит к химерной сосудистой сети мыши.

На фиг.6А показаны репрезентативные данные о подходе, используемом для стимуляции образования костей в каркасах MSC. Как и в предыдущих рисунках, через 8 недель после имплантации была проведена внутривенная инокуляция 655-VPA, были извлечены строительные леса, и изображения были получены с помощью двухфотонной конфокальной микроскопии. RhBMP-2-стимулированные леса вызывают образование костной ткани, которая может быть визуализирована из-за SHG (голубой цвет на изображениях), обеспечиваемый кальцием в кости. Представленные изображения также показывают образование полостей и васкуляризированной эндостиальной ткани, которые очень напоминают эндостеалярную ткань BM. На рисунке 6B Video 3 , hECs были совместно имплантированы hMSC. Леса извлекались после внутривенной инокуляции антитела FITC-hCD31 и 655-VPA, а изображения с двумя фотонными конфокальными микроскопами показывали участие hECs в неоваскуляризации в костно-формирующем лесу.

На рисунке 7 показаны репрезентативные изображения гистологии, процедура, выполняемая для подтверждения ранее описанных результатов. Иммунофлуоресцентные изображения показывают мышечную сосудистую сеть, hECs, hMSC и долгосрочные привитые человеческие гемопоэтические клетки в структурах лесов. Леса, полученные от мышей, фиксировали и использовали для иммунофлюоресценции. В каркасно-несущих каркасах rhBMP-2 ( рис. 7D- F ) обратите внимание на морфологию ткани, напоминающую зрелый костный мозг с жировой тканью. В этом костно-формирующем эшафоте мы показываем, что hMSC представляют собой фибробласты, которые указывают на tОни вносят вклад в новообразованную ткань в виде стромальных клеток. Мы также показываем экспрессию маркера человека adipocyte, что указывает на то, что hMSC также способствуют образованию жировой ткани.

Рисунок 1. Репрезентативные изображения процессов высева клеток и имплантации. A) Начальный эшафот и его метод резания с использованием скальпеля. B) 24 штуки, полученные на первоначальном эшафоте. C) Метод посева ячеистых клеток с использованием шприца. D) Ячеистые леса с культуральной средой, готовые к имплантации. EF). Конкретные шаги для костно-формирующих лесов: E) каркас переносится на 96-луночный планшет u-bottom и F) репрезентативное изображение метода, используемого для добавления rhchMP2, тромбина и фибриногена к эшафоту. GJ) Сурги Калорийную имплантацию под общей анестезией: G) рану, созданную при имплантации кожи и каркаса, метод имплантации H) и процедуру закрывания раны IJ с использованием хирургического клея. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Различные леса, полученные из мышей. Репрезентативные изображения лесов MSC (слева), лесов MSC + EC (средний) и лесов MSC + EC + BMP (справа). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4 / 55914fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Конфигурация канала. Отображается настройка фильтра микроскопа. A) Существует четыре блока детекторов NDD: в первом модуле имеется два куба фильтра; Второй и третий модули имеют по одному кубику фильтра; И последний модуль не имеет куба (не используется). Первая фотоумножитель (PMT) предназначена для дальнего красного канала (640-690 нм), отражающего более низкие длины волн; Следующие - 380 - 485 нм, 500 - 550 нм и 555 - 625 нм (порядок всегда от нижних до более высоких длин волн). B) Выбросы флуорофора, обнаруженные с помощью вышеуказанных конфигураций (с цветовой кодировкой). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. MSC Scaffold S Позволяют формировать нишу для гематопоэтических клеток человека. A) и B) 3D-реконструкции Z-стеков, взятых после эксплантации, после внутривенной инокуляции AF488-hCD45 (зеленый), для маркировки гемопоэтических клеток человека и 655-VPA (пурпурный) m для маркировки сосудистой сети. Шкалы шкалы представляют собой 20 мкм в A и B (верхние панели) и 5 ​​мкм в B (нижние панели). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1. Леса MSC позволяют формировать нишу для гемопоэтических клеток человека . 3D-реконструкция гемопоэтических клеток человека (AF488-hCD45), связанная с сосудистой сеткой (655-VPA) в каркасе MSC (структуры коллагена: SHG, голубой). Каждый стек имеет размер 140 x 140 мкм.Ef = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55914/55914video1.mov" target = "_ blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Рисунок 5. Участники ЕС участвуют в формировании гуманизированных сосудов в строительных лесах MSC. 3D-реконструкция сосудистой сети (655-VPA), выровненная EC человеческого происхождения (FITC-hCD31) в каркасах MSC + EC. Шкала шкалы составляет 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 2. EC-участники ЕС участвуют в формировании гуманизированных сосудов в строительных лесов MSC. 3D-реконструкция человеческих EC (FITC-hCD31), выровняющая va Sculature (655-VPA) в каркасах MSC + EC. Каждый стек имеет размер 240 x 240 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Рисунок 6. Несущие леса rhBMP-2 имеют костные поверхности и гуманизированную сосудистую систему, сходную с костным мозгом. A) 3D-реконструкция каркасов MSC + BMP, показывающих образование костных структур (SHG-голубой) и сосудистой системы (655-VPA). Шкала шкалы составляет 100 мкм (слева), 70 мкм (средняя) и 50 мкм (справа). B) 3D-реконструкция лесов MSC + EC + BMP, показывающих гуманизированные сосуды (655-VPA), выровненные с человеческими EC (FITC-hCD31). Шкала шкалы представляет собой 50 мкм (слева) и 30 мкм (средний и правый).14 / 55914fig6large.jpg «target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 3. У несущих каркасов rhBMP-2 есть костяные поверхности и гуманизированная сосудистая сеть, сходная с костным мозгом. 3D-реконструкция каркасов MSC + VERA + BMP (кость: SHG; сосуды: 655-VPA, человеческие EC: FITC-hCD31). Каждый стек имеет размер 600 x 600 мкм. Нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы загрузить.)

Рисунок 7. Представительные изображения иммунофлюоресценции, выполненные на неподвижных строительных лесов. AF) Исследования иммунофлуоресценции, проведенные для определения местоположения клеток человека, имплантированных iN строительных лесов. AC) Леса, имплантированные hECs, hMSC и hHSC. DF) Костообразующие леса, имплантированные hECs, hMSC и hHSC. Цветные каналы следующие: AD) человеческий EC (hCD31) и сосудистая структура мыши (эндомуцин, ENDOM), BE) hMSCs (hVimentin, hVIM) и сосудистые клетки мыши (эндомуцин, ENDOM), C) гемопоэтические клетки человека (hCD45) И мышечная сосудистая сеть (эндомуцин, ENDOM) и F) человеческий белок дифференцировки жировой ткани (hADRP) и мышечная сосудистая сеть (эндомуцин, ENDOM). Шкала шкалы представляет собой 10 мкм (A и C), 20 мкм (B и E) и 40 (D и F) мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Значение в отношении существующих методов:

В этом протоколе мы описали метод генерации различных гуманизированных микросреждений у мышей и визуализации их архитектуры с помощью двухфотонной микроскопии и гистологии. Представленные данные свидетельствуют о возможности подхода, используя различные стромальные клетки для создания гуманизированных тканей. Протокол имеет специфические применения для изучения гемопоэтических клеток человека и клеток, полученных из ниши, костного мозга в нормальных и патологических условиях. Эти приложения включают изучение эволюции клонов, скрининга лекарств и перекрестных помех между человеческими HSC и стромальными компонентами. В новой области тканевой инженерии было предложено несколько альтернативных подходов. Подходы к сведению включают разработку 3D гуманизированных структур BM in vitro ^{55 , 56 , 57 ,}S = «xref»> 58 ^{, 59 , 60 , 61 , 62 , 63} и ортотопический трансплантат гуманизированных каркасов BM у мышей ⁶⁴ . Преимущество нашего подхода заключается в сочетании как сложной системы in vivo, так и простой анатомической доступности гуманизированного тканевого трансплантата.

Модификации и устранение неполадок:

Источник изменчивости в этом протоколе можно найти в выборе ячеек, используемых для посева каркасов. В нашей работе мы использовали BMC-hMSC. Однако мезенхимные клетки могут быть получены из нескольких тканей, которые могут проявлять отличительные свойства в зависимости от происхождения. Поэтому можно рассматривать использование hMSC, полученных из разных органов. Однако их способность формировать костную ткань in vivo должна быть проверена до использования в этом pRotocol. В этом протоколе используется коммерчески доступный источник эндотелиальных клеток человека ( т.е. EUORF1-трансдуцированный HUVEC). Недавно было сообщено об использовании органоспецифических эндотелиальных клеток для различных целей ^{65 , 66} . Более того, использование первичных hEC, полученных из BM, может представлять интересное усовершенствование протокола. Поэтому использование различных источников эндотелиальных клеток может приводить к различным результатам in vivo .

Мы использовали мышей с иммунодефицитом NSG с иммунодефицитом, чтобы способствовать имплантации гуманизированных лесов и избежать отторжения тканей. Мы не исключаем возможности использования этого протокола для разработки эктопических тканей костного мозга в других штаммах мыши. Действительно, rhBMP-2 может индуцировать образование костей в разных моделях млекопитающих ^{47 , 48 , 49 , 50 , 52 . Однако различия в жизнеспособности клеток и длительной трансплантации, вероятно, будут наблюдаться с использованием разных штаммов / моделей.}

Время восстановления эшафотов также может быть гибким, в зависимости от конечной цели эксперимента. В представленном протоколе мы возвращаем образцы через 8-12 недель после имплантации для оценки долговременного гемопоэтического приживления. Для изучения ранних стадий формирования нитей человеческого BM ( например, образования остеохондральной ткани ⁴⁷ или развития сосудов) могут быть выбраны разные моменты времени.

Техника визуализации в реальном времени, описанная в этом протоколе, показана для краткосрочной визуализации эксплантов. Использование равновесной камеры для поддержания физиологической температуры, кислородного напряжения и концентрации CO ₂ следует рассматривать в случаях долгосрочной визуализации, например, для изучения поведения моторики.

КритическийEps в рамках Протокола:

Среди проблем, связанных с протоколом, мы хотели бы выделить технические навыки, необходимые для некоторых шагов. Мезенхимальные и эндотелиальные клетки следует использовать при низких числах проходов клеток; В противном случае они не смогут поддерживать приживление гемопоэтических клеток человека in vivo или участвовать в сосудистой сети de novo и формировании костей in vivo . Мы рекомендуем использовать hMSCs и hECs в проходах 1-5. Для подготовки и подготовки ячеек требуется базовые навыки клеточной культуры и знание свойств конкретных клеток, используемых в процедуре. Протокол хирургии довольно прост, но требует некоторой практики. Сохранение асептической среды во избежание заражения имплантированных каркасов у иммунодефицитных мышей имеет решающее значение для обеспечения успеха эксперимента. Эксплантат образца и живое изображение требуют хирургической практики (особенно для использования микротрещины) и знаний оМикроскоп. Наконец, обработка образцов и гистология требуют базового знания методов, которые будут использоваться.

Ограничения техники:

Подход, который мы описываем, позволяет визуализировать живые человеческие гемопоэтические клетки, высевающие гуманизированный микроокружение костного мозга, с эндотелиальными клетками человека, образующими сосудистые структуры и мезенхимальные клетки, образующие пространство кости / костного мозга. Поскольку ткань образуется in vivo , конечный инженерный эшафот по-прежнему будет химерическим (человеческим и мышиным). Следует учитывать эту проблему, поскольку химерная ткань не может полностью имитировать сложность и среду человеческого костного мозга.

Имплантируемые каркасы имеют ограниченный размер (мы пробовали максимум 6,6 х 7,5 х 7 мм), и поэтому они могут размещать ограниченное количество клеток для ксенотрансплантации. Абсолютное количество восстановленных клеток также будет ограничено; Таким образом, количество имплантированных лесов должноРассчитывается как функция количества клеток, необходимых для эксперимента.

Прикладное изображение, которое мы описали, особенно полезно для наблюдения больших площадей живых тканей на глубинах 150-200 мкм от поверхности без нарушения архитектуры и повреждения клеток. Поэтому он не позволяет визуализировать весь эшафот. Если требуется полное сканирование ткани, более подходящими являются стандартные подходы к иммунофлюоресценции.

Будущие приложения:

Будущее направление этой биоинженерной модели будет заключаться в увеличении сложности компонентов человека в ткани. Знания и характеристика человеческой ниши BM развивались в последние годы ⁶⁷ , и описанный протокол мог бы стать интересной платформой для изучения функции этих новых клеточных компонентов и растворимых факторов, а также их роли в поддержании нормального / злокачественногоAnt HSCs.

Кроме того, метод визуализации обеспечивает возможность визуализации изображений в каркасном состоянии в продольных исследованиях, что потребует технических улучшений при визуализации изображений на живых, обезболиваемых мышах, после восстановления после операции. Этот подход потребует дополнительных шагов и в настоящее время находится на стадии расследования в лаборатории.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque	Ge Healthcare	17-1440-03
Cd34 положительный отбор Kit Stemcell		18056	Store a 4°C.
Magnet	Stemcell	18000
Anti-human CD3 антитело, клон OKT-3	Bioxcell	BE0001-2	хранить при температуре 4°C. Используется для истощения Т-клеток в первичных образцах ОМЛ.
Цитокины (IL3, G-CSF и TPO)	PeproTech	200-03, 300-23 и 300-18	Для создания запаса: Разбавьте каждый из цитокинов в 100 мкм; Л воды и перемешайте их. Прибавьте 200 μ L, do alicuots of 45 μ L и хранить при -20 °C.
DMSO	Sigma	D4540
FBS	Life технологии	10270106	Термоинактивация при 56 °°; C в течение 30 мин сделать аликвоты и замерзнуть. Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед использованием.
MEM-α	Invitrogen	32571-028	Хранить при 4 °C. Согреть при 37 °°C C водяной баней перед использованием.
Myelocult H5100	corning	5100	Хранить при 4 °C. Теплый при 37 ° C водяной баней перед использованием.
199	Gibco	41150-020	Хранить при 4 °C. Тепло в 37 ° C водяной баней перед использованием.
hMSC-FBS, Термоинактивированный	Gibco	12662-029	Хранить при -20 °C. Теплый при 37 °°С; C водяной баней перед использованием.
P/S	Sigma-Aldrich	P0781	Хранить при -20 °°C. Тепло при 37 °° C водяной баней перед использованием.
ECGS	Millipore	02-102	Разведите в питательных средах и используйте фильтр 0,22 мм.
HEPES	Sigma-Aldrich	S1558-50ML	хранить при 4 °C.
Гепарин	Сигма-Олдрич	Н3149	хранить при 4°С.
Глутамин	Gibco	25030	хранить при температуре -20 °C.
Коллагеновая пластина для клеточной культуры с покрытием 1	354505
раствором трипсина-ЭДТА	Thermo-Fisher	25200056	хранить при температуре -20 °C. Подогреть при температуре 37 °°C; C водяной баней перед использованием.
hMSC	Lonza	PT-2501	В качестве альтернативы, hMSC мы также любезно предоставили доктором Доске (Университет Париж Дидро, Париж) из костного мозга человека, полученного во время ортопедической хирургии в соответствии с этическим одобрением 10-038 от IRB00006477.
Эндотелиальные клетки VeraVec HUVEC	Angiocrine bioscience	hVera101	В качестве альтернативы можно использовать другой источник эндотелиальных клеток человека.
Образцы гемопоэтических клеток			Пуповинная кровь или первичный острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) были получены из Королевской лондонской больницы (Лондон, Великобритания) после информированного согласия и протокола использования, одобренного Этическим комитетом Восточного Лондона, и проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией.
Гельпена, размер 12 - 7 мм	Pfizer	00009-0315-08	Альтернативный поставщик: Febelco
PBS	Thermo-Fisher	10010023
Хирургический материал	Множественные		стерильные щипцы, пинцет и острые ножницы.
Стерильные салфетки			Термическая стерилизация бумажных салфеток.
1 мл шприца с иглой 25G	Terumo	SS+01H25161
Ultra Low Attachment Multiple Well Plates		Corning 3473 или 3471
BMP2	Noricum	rhBMP-2	Разведите со скоростью 5 мг/мл в уксусной кислоте 50 мМ и храните при 4 °C.
Тромбин	Sigma	T8885	развести в CaCl2 2%, 500 мл на флакон и хранить при температуре 4°C.
Фибриноген	Sigma	F3879	разведите в дозе 4 мг/100 мл в PBS. Хранить при температуре -20 °C. Перед использованием согреть.
Чашки для тканевых культур 35 мм x 10 мм	Falcon	353001
U-Botton 96 луночная пластина	Falcon	353077
мыши NSG	Лаборатория Джексона	5557	NSG были любезным подарком от доктора Леонарда Шульца (Лаборатория Джексона).
Хлоргексидин	G9		Разведите 1:10 перед применением
Карпрофен	Pfizer	Римадил	5 мг/кг мышиного
Бупренорфин	Alstoe	Vetergesic	0,1 мг/кг массы тела мыши
Изофлуран	Abbott	B506	Индукция анестезии 2%, поддержание 1%
Триммер	Wella	Contura HS61
Хирургический клей	3М	Vetbond
карбомер (полиакриловая кислота) в виде офтальмологического геля	Novartis	Viscotears Liquid Gel
Human Normal Immunoglobulin	Gammaplex	10 г флакон	100 мл/мышь внутривенно, за 30 минут до инфузии специфического антитела.
NT-QTracker	Invitrogen	Q21021MP	агент для пулинга судов. Введите 15 мл/мышь внутривенно за 5 минут до визуализации.
AF488-hCD45	Biolegend	304017	100 мл/мышь внутривенно за 30 минут до визуализации.
FITC-hCD31	BD Pharmigen	555445	100 мл/мышь внутривенно, за 30 мин до визуализации.
Суперклей	Loctite	Super Glue
Micro-Drill Kit	IDEAL - Fisher Scientific	NC9010016
микрохирургический микроскоп			Не рекомендуется указывать конкретную марку/компанию.
LSM 710 NLO	Zeiss		Вертикальный конфокальный микроскоп с моторизованным предметным столиком, двухфотонным лазером и водно-иммерсионной линзой 20X 1.0 NA. В качестве альтернативы можно использовать микроскоп с аналогичными характеристиками.
МайТай» Высокая производительность» полностью автоматизированный 1-box 517 с синхронизацией режимов Ti:Sapphire лазер с компенсацией дисперсии DeepSee	Spectra-Physics
Раствор формалина, нейтральный буферизованный, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Этанол	Sigma-Aldrich	32294
Osteosoft	Millipore	1.01728.1000
Ломтики полизина	Thermo scientific	J2800AMNZ
Антиген демаскирующий раствор	Vector	H-3300	Хранить при 4 °C. Развести 1:100 в H2O для рабочего раствора.
Triton 100x	Sigma-Aldrich	T9284
Бычья сыворотка альбумина (BSA)	Sigma-Aldrich	A96470	Хранить при 4 °C.
Нормальная козья сыворотка (NGS)	Sigma-Aldrich	G9023	хранить при 4°C.
Антитело к эндомуцину	Santa Cruz	sc-65495	хранить при 4 °°C.
Антитело к виментину	Santa Cruz	sc-6260	хранить при 4 °C.
Антитело к hCD31	DAKO	M0823	хранить при 4 °C.
Антитело к hCD45	DAKO	M0701	хранить при 4 °C.
Антитела к ADRP (Perilipin2)	-онлайн	ABIN283918	Store at 4 °C.
Козьи мышиные вторичные антитела	Инвитроген	А11029 или А11005	Храните при 4°С.
Козьи против кролика вторичные антитела	Инвитроген	А11037 или А11008	хранить при 4°С.
Вторичные антитела козы против крысы	Инвитроген	А11007 или А21247	хранятся при 4°С.
Sudan Black		Sigma S2380	Подготовьте запас 1% суданского черного в этаноле 70%. Хранить при РТ. Приготовьте рабочий раствор 0,1% суданского черного в этаноле 70% и отфильтруйте с помощью фильтровальной бумаги перед использованием.
DAPI	Sigma	D8417	Приготовьте бульон в H20 в дозе 100 мг/мг. Храните при 4°C.
Флуоресцентный монтажный носитель	Dako	S3023	Добавьте DAPI перед использованием (1:400 со склада DAPI).
Защитное стекло	VWR	631-0147