Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток

7.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55919

⸱

28 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем протокол для общего геномирования сайтов интеграции вирусных ретровирусных векторов мышиной лейкемии Moloney в клетках человека.

Аннотация

Вирусные ретровирусные векторы вируса мышиной лейкемии Moloney (MLV) преимущественно интегрируются в ацетилированные энхансеры и промоторы. По этой причине сайты интеграции mlV могут использоваться как функциональные маркеры активных регуляторных элементов. Здесь мы представляем ретровирусный сканирующий инструмент, который позволяет идентифицировать клеточные энхансеры и промоторы по всему геному. Вкратце, популяция клеток-мишеней трансдуцирована вектором, полученным из mlV, и геномную ДНК расщепляют часто режущим ферментом рестрикции. После лигирования геномных фрагментов с совместимым ДНК-линкером, линкер-опосредованная полимеразная цепная реакция (LM-PCR) позволяет амплифицировать геномные соединения вирус-хозяин. Массивное секвенирование ампликонов используется для определения профиля интеграции mLV в геноме. Наконец, кластеры рекуррентной интеграции определены для идентификации специфичных к клеткам регуляторных областей, ответственных за активацию программ транскрипции, специфичных для клеточного типа.

например, соматических стволовых клеток), у которых отсутствуют надежные маркеры для предполагаемой изоляции.

Введение

Идентичность клетки определяется экспрессией определенных наборов генов. Роль цис-регуляторных элементов, таких как промоторы и энхансеры, имеет решающее значение для активации транскрипционных программ клеточного типа. Эти регуляторные области характеризуются специфическими хроматинными особенностями, такими как специфические модификации гистонов, факторы транскрипции и связывание кофакторов, а также доступность хроматина, которые широко используются для их идентификации по всему геному в нескольких типах клеток 1 , 2 , 3 . В частности, широкоформатный профиль ацетилирования гистона Н3-лизина 27 (H3K27ac) обычно используется для определения активных промоторов, энхансеров и суперусилителей 4 , 5 , 6 .

Вирус мышиной лейкемии Молони (MLV) является гамма-ретровирусом, который широко используется для генаПеренос в клетках млекопитающих. После заражения клетки-мишени ретровирусный РНК-геном ретро-транскрибируется в двухцепочечной молекуле ДНК, которая связывает вирусные и клеточные белки, чтобы собрать преинтегрирующий комплекс (PIC). ПИК входит в ядро ​​и связывает хроматин клетки-хозяина. Здесь, вирусная интеграза, ключевой компонент ПОС, опосредует интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина. Интеграция mLV в геномной ДНК не является случайной, но происходит в активных цис-регуляторных элементах, таких как промоторы и энхансеры, клеточно-специфическим способом 7 , 8 , 9 , 10 . Этот специфический профиль интеграции опосредуется прямым взаимодействием между mLV интегразой и клеточными бромдоменными и внетерминальными доменами (BET) белками 11 , 12 , 13 . BET белки (BRD2, BRD3 иBRD4) действуют как мостик между хроматином хозяина и mLV PIC: через их bromodomains они распознают высокоацетилированные цис-регуляторные области, в то время как внетерминальный домен взаимодействует с mLV интегразой 11 , 12 , 13 .

Здесь мы опишем ретровирусное сканирование, новый инструмент для отображения активных цис-регуляторных областей на основе интеграционных свойств mLV. Вкратце, клетки трансдуцированы с помощью полученного из MLV ретровирусного вектора, экспрессирующего репортерный ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP). После экстракции геномной ДНК соединения между длинным 3'-концевым повтором (LTR) вектора mLV и геномной ДНК амплифицируют с помощью линкер-опосредованной ПЦР (LM-PCR) и последовательно секвенируют. Сайты интеграции mLV отображаются на геном человека, а геномные области с высокой концентрацией митохондрий определяются как кластеры сайтов интеграции mLV.

Ретровирусное сканированиеNing был использован для определения клеточных специфических активных регуляторных элементов в нескольких первичных клетках человека 14 , 15 . MlV кластеров, совместно отображаемых с эпигенетически определенными промоторами и энхансерами, большинство из которых содержат активные гистоновые метки, такие как H3K27ac, и являются клеточно-специфичными. Ретровирусное сканирование позволяет проводить идентификацию регуляторных элементов ДНК в проспективно очищенных клеточных популяциях 7 , 14 , а также в ретроспективно определенных клеточных популяциях, таких как стволовые клетки кератиноцитов, которые не обладают эффективными маркерами для предполагаемой изоляции 15 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Трансдукция MLV клеток человека

  1. Изолируйте клетки-мишени и трансдуцируйте их с помощью ретровирусного вектора, содержащего MLV, несущего репортерный ген eGFP и псевдотипированного вирусом везикулярного стоматита G (VSV-G) или гликопротеина с амфотропной оболочкой 16 .
    1. Держите фиктивные трансдуцированные клетки как отрицательный контроль для следующих анализов. Поскольку основанные на млV ретровирусные векторы могут эффективно трансформировать делящиеся клетки, культивировать популяцию клеток-мишеней в условиях, которые стимулируют деление клеток. Условия трансдукции должны быть специально оптимизированы для каждого изучаемого типа клеток. Рост клеток и условия трансдукции для гемопоэтических предшественников человека, Т-клеток и эпидермальных клеток описаны в литературе 7, 14, 15 и 17.
  2. Через 48 часов после трансдукции ресуспендируют 100000 клеток в 300 мкл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), содержащего 2% фетальную бычью сыворотку, и измеряют экспрессию eGFP с помощью fНизкий цитометрический анализ (лазер возбуждения 488 нм). Используйте ложно-трансдуцированные клетки как отрицательный контроль. Для оптимального поиска сайтов интеграции очистите клетки GFP + с помощью сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
  3. Соберите от 0,5 до 5 миллионов клеток для подготовки геномной ДНК. Более длительный период культивирования (> 7 дней) предпочтителен для разбавления неинтегрированного провируса и необходим при анализе долгосрочного потомства добросовестных стволовых клеток (см. Раздел « Обсуждение» и ссылка 15 ). Осадки клеток можно замораживать и хранить при -80 ° C до использования.

2. Амплификация сайтов интеграции mLV с помощью линкер-опосредованной ПЦР (LM-PCR)

  1. Получение геномной ДНК (гДНК)
    1. Экстрагируют gDNA, используя набор для экстракции ДНК на колонке, и следуют протоколу для культивируемых клеток в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Рестрикционный фермент digestiна
    1. Установите 4 переваривания фермента рестрикции на образец в пробирках по 1,5 мл. Дайджест 0,1-1 мкг гДНК в каждой пробирке добавлением 1 мкл Tru9I (10U) и 1 мкл буфера М в конечном объеме 10 мкл. Инкубируйте реакции при 65 ° С в течение 6 ч или в течение ночи.
    2. Добавьте к каждой реакции 1 мкл PstI (10U), 1 мкл буфера H и 8 мкл воды. Инкубируйте реакции при 37 ° С в течение 6 ч или в течение ночи. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
  3. Лигирование линкера
    1. Подготовьте 100 мкМ основной раствор линкера Tru9I в 1,5-миллилитровой пробирке, смешав линкер плюс нить и линкер минус олигонуклеотиды нитей при концентрации 100 мкМ. Поместите трубку в воду, установленную при температуре 100 ° C, и дайте ей остыть при комнатной температуре. Массовый раствор Tru9I можно хранить при -20 ° C до использования.
    2. Настроить 8 линкеров лигирования реакций в 1,5 мл пробирки. Для каждой реакции добавьте следующий компонентС до 10 мкл ферментативного расщепления рестриктазой: 1,4 мкл 10X Т4 ДНК-лигазы, буфера реакции, 1 мкл 10 мкМ линкера Tru9I, 1 мкл (2000 ед.) ДНК-лигазы Т4 и 0,6 мкл воды. Инкубируйте при температуре 16 ° C в течение 3-6 часов. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
  4. Первая ПЦР
    1. Установите 48 реакций ПЦР (6 реакций из каждой лигирующей трубки) в 0,2 мл пробирки. Для каждой ПЦР добавьте следующие реагенты в 2 мкл реакции лигирования: 5 мкл 10X ПЦР-буфера, 2 мкл 50 мМ сульфата магния, 1 мкл 10 мМ дезоксинуклеотида (dNTP) Mix, 1 мкл 10 мкМ линкерного праймера, 1 Мкл 10 мкМ праймера mLV-3 'LTR, 0,3 мкл (1,5U) Taq ДНК-полимеразы и 37,7 мкл воды. Последовательности праймеров представлены в таблице 1.
    2. Выполните реакцию ПЦР в термоциклере с нагретой крышкой, как указано ниже: 95 ° С в течение 2 мин; 25 циклов при 95 ° С в течение 15 с, 55 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 1 мин; 72 °, C в течение 5 мин; Держите при 4 ° C. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
  5. Вторая ПЦР
    1. Настроить 48 реакций ПЦР (по 1 от каждой пробирки «первая ПЦР») в пробирках по 0,2 мл. Для каждой ПЦР добавьте следующие компоненты к 2 мкл первой реакции ПЦР: 5 мкл 10Х ПЦР-буфера, 2 мкл 50 мМ сульфата магния, 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 1 мкл 10 мкМ линкера, вложенного праймера, 1 Мкл 10 мкМ вложенного праймера MLV-3 'LTR, 0,3 мкл Taq ДНК-полимеразы (1,5 U) и 37,7 мкл воды. Используйте вложенные праймеры, разработанные для выбранной стратегии массивного секвенирования: (i) вложенный линкер-линкер и MLV-3 'LTR-вложенный праймер, совместимый с платформой Illumina; (Ii) линкерный вложенный праймер и вложенный праймер mLV-3 'LTR, совместимый с платформой Roche. Последовательности праймеров перечислены в таблице 1 .
    2. Выполните реакцию ПЦР в термоциклере с нагретой крышкой, как указано ниже: 95 ° С в течение 2 мин; 25Циклов 95 ° С в течение 15 с, 58 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 5 мин; Держите при 4 ° C. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
    3. Объединение 48 вложенных реакций ПЦР в 15 мл пробирке (конечный объем ~ 2,4 мл). Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
  6. Определить присутствие и размер продуктов LM-PCR электрофорезом в агарозном геле.
    1. Добавьте 4 мкл загрузочного буфера в 20 мкл продуктов LM-PCR и загрузите образец в 1% агарозный гель вместе с 100 п.о. ДНК-лестницей. Проведите гель при 5 В / см в течение 30-60 мин и визуализируйте продукты ПЦР окрашиванием этидиум-бромидом.
    2. Выполните реакцию LM-PCR из ложно-трансдуцированного образца как отрицательный контроль.
  7. Осаждают ампликоны добавлением 0,1 объемов раствора ацетата натрия (3 М, pH 5,2) и 2,5 объемов 100% этанола. Перемешивают и замораживают при -80 ° C в течение 20 мин.
    1. Спин на фуЛ в стандартной микроцентрифуге при 4 ° С в течение 20 мин. Отбросьте супернатант и вымойте гранулу с 70% этанола. Спин на полной скорости в стандартной микроцентрифуге при 4 ° С в течение 5 мин.
    2. Отбросьте супернатант и высушите осадок на воздухе. Добавьте 200 мкл воды ПЦР-класса и ресуспендируйте ДНК. Образцы можно хранить при температуре -20 ° C до использования.
  8. Добавьте 20 мкл загрузочного буфера в 100 мкл продуктов LM-PCR и загрузите образец в 1% агарозный гель вместе с 100 п.о. ДНК-лестницей.
    1. Проведите гель при 5 В / см в течение 30-60 мин и вырежьте часть геля, содержащего ампликоны с длительностью от 150 до 500 п.о.
    2. Очистите продукты LM-PCR с помощью набора для выделения геля на колонке и измерьте концентрацию с помощью УФ-спектрофотометра.
  9. Используйте 1 мкл библиотеки для оценки длины продуктов LM-PCR с использованием биоанализатора в соответствии с инструкциями производителя.
  10. Клонирование дробилки ампликонов
    1. Используйте 20 нг очищенных продуктов LM-PCR и клонируйте их в векторе pCR2.1-TOPO в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Выполните последовательности реакций с использованием универсального праймера M13 с последующим геномным картированием полученных последовательностей, чтобы выявить наличие соединений вирусного генома (включая вложенный праймер MLV-3 'LTR) в> 50% клонов для идентификации подходящих образцов Для массивного секвенирования. Пример соединения вирусного генома:
      figure-protocol-1
      MLV-3 'LTR-вложенный праймер 454 и линкер-вложенный праймер 454 ( таблица 1 ) выделены жирным шрифтом, а 3'-конец вирусного LTR - курсивом. Геномная последовательность человека выделена красным текстом (chr10: 6439408-6439509, hg19).

3. Массивное упорядочивание сайтов интеграции mLV

ПРИМЕЧАНИЕ: LM-PCR prodUcts могут быть секвенированы с использованием коммерческих платформ (выбор подходящей пары вложенных праймеров во второй реакции ПЦР, см. Подраздел 2.5.1). Для секвенирования с помощью пироэффектной платформы Roche GS-FLX обратитесь к предыдущим статьям 7 , 14 , 15 . В этом разделе описывается недавно оптимизированный протокол для платформы секвенирования Illumina.

  1. Подготовка библиотеки
    1. Настроить 1 индексацию реакции ПЦР на образец в пробирках по 0,2 мл. Для каждой ПЦР добавьте следующие реагенты в 5 мкл (150-170 нг) очищенного продукта LM-PCR: 5 мкл индексного праймера 1, 5 мкл индексного праймера 2, 25 мкл 2х основного микса и 10 мкл ПЦР- Сорт воды. Используйте разные комбинации индексов для каждого образца.
    2. Выполните реакции ПЦР в термоциклере с нагретой крышкой, как указано ниже: 95 ° С в течение 3 мин; 8 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 55 ° С в течение 30 с, 72 ° С в течение 30 с; 72 ° C для 5 мв; Держите при 4 ° C.
    3. Очистите ПЦР-продукты, используя твердофазный обратимый иммобилизационный протокол (SPRI): в новые пробирки объемом 1,5 мл добавьте 56 мкл шариков в каждый образец и следуйте инструкциям производителя. Элюируют в 25 мкл Трис-HCl 10 мМ. Библиотеки могут храниться при температуре -20 ° C до использования.
  2. Проверка библиотеки
    1. Используйте 1 мкл образца для оценки размера библиотеки с помощью биоанализатора.
    2. Используйте 1 мкл образца для количественной оценки молярности библиотеки с использованием флуоресцентного анализа ПЦР в реальном времени в соответствии с инструкциями производителя.
  3. Разведение и упорядочение библиотек
    1. Разбавьте библиотеки до 10 нМ, используя Tris-HCl 10 мМ. Для объединения библиотек передайте по 5 мкл каждой разбавленной библиотеки в новую 1,5 мл пробирку, а затем разбавьте пул до 4 нМ в 10 мМ трис-HCl.
    2. Смешайте 5 мкл разбавленной лунки с 5 мкл 0,2 N NaOH в новом 1,5 мL, кратковременно встряхивают, вращают и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре для денатурации библиотек.
    3. Помещают пробирки на лед и добавляют 990 мкл предварительно охлажденного гибридизационного буфера (HT1). Алиготе 300 мкл денатурированного пула в новой 1,5-миллилитровой пробирке и добавьте 300 мкл предварительно охлажденного НТ1, чтобы получить 10 мМ пула окончательной библиотеки.
    4. Параллельно смешивают 2 мкл библиотеки управления PhiX (10 нМ) с 3 мкл 10 мМ Tris-HCl в 1,5 мл пробирке. Добавить 5 мкл NaOH 0,2 N, кратковременно встряхнуть, отжать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре для денатурации разбавленного PhiX. Поместите пробирку на лед и добавьте 990 мкл предварительно охлажденного HT1.
    5. Алиготе 300 мкл денатурированного PhiX в новой 1,5 мл пробирке и добавьте 300 мкл предварительно охлажденного HT1, чтобы получить конечный PhiX на 10 пМ.
    6. В новой 1,5-миллилитровой пробирке смешайте 510 мкл денатурированного библиотечного пула с 90 мкл денатурированной библиотеки PhiX, таким образом получив окончательный пул 10 пМ с 15% контроля PhiX.
    7. Внесите эти 600 мкл образцаОбъема в резервуар для пробной пробы талого картриджа с реагентами и немедленно приступить к выполнению однократного прогона 150 циклов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Критические реагенты и последовательности праймеров, необходимые для этого протокола, перечислены в таблице 1 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рабочий процесс процедуры ретровирусного сканирования

Рабочий процесс процедуры ретровирусного сканирования схематизирован на рисунке 1 . Заселенность клеток-мишеней очищают и трансдуцируют с помощью полученного из mlV ретровирусного вектора, экспрессирующего репортерный ген eGFP. Трансген фланкирован двумя идентичными длинными терминальными повторами (5 'и 3' LTR), обеспечивающими синтез, об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описали протокол для геномного картирования сайтов интеграции mlV, ретровирус, который нацелен на участки хроматина, эпигенетически обозначенные как активные промоторы и энхансеры. Критические шаги и / или ограничения протокола включают в себя: (i) трансдукцию mlV популяции клеток-мишеней; (Ii) амплификация соединений вируса-хозяина с помощью LM-PCR; (Iii) извлечение высокой доли сайтов интеграции. MLV-ретровирусные векторы эффективно трансдуцируют делящиеся клетки. Низкая эффективность трансдукции не делящихся...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Европейского исследовательского совета (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), итальянского министерства образования, университетов и исследований (FIRB-Futuro в Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro в Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , Флагманский проект EPIGEN Epigenomics), Министерство здравоохранения Италии (Молодые исследователи Call 2011 GR-2011-02352026) и Фонд Imagine Institute (Париж, Франция).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031или эквивалент
Фетальная бычья сывороткаThermoScientific16000044или эквивалент
0,2 мл пробиркиобщего лабораторного поставщика
1,5 мл пробиркилабораторного поставщика
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306или эквивалент
Т4 ДНК-лигазы Новая Англия BioLabsM0202T
T4 ДНК-лигаза Реакционный буферНовая Англия BioLabsM0202T
Linker Plus Strand олигонуклеотидобщий лабораторный поставщик5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (Степень очистки: SDS-PAGE)
Линкер минус цепь олигонуклеотидаобщего лабораторного поставщика5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Степень очистки: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
буфер SuRE/Cut MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA Polimeraза высокой точности Invitrogen11304011
10 мМ dNTP MixInvitrogen18427013или эквивалентный
ПЦР-класс водаобщий лабораторный поставщик
96-луночный термоамплификатор (с подогреваемой крышкой)общий лабораторный поставщик
линкер праймеробщий лабораторный поставщик5'-GTAATACGACTATAGGGC-3' (Степень очистки: степень ПЦР)
МЛВ-3' LTR праймеробщий лабораторный поставщик5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Степень очистки: степень ПЦР)
линкер вложенный праймер 454общий лабораторный поставщик5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Степень очистки: SDS-PAGE)
MLV-3' LTR вложенный праймер 454общий лабораторный поставщик5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Степень очистки: SDS-PAGE)
линкер вложенный праймер Illuminaобщий лабораторный поставщик5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Степень очистки: SDS-PAGE)
MLV-3' LTR вложенный праймер Illuminaобщий лабораторный поставщик5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Класс очистки: SDS-PAGE)
Раствор ацетата натрия (3M) pH 5.2общий лабораторный поставщик
этанол (абсолют) для молекулярной биологииSigma-AldrichE7023или эквивалентный
набор для клонирования Topo TA (с вектором pCR2.1-POMO)InvitrogenK4500-01
QIAquick набор для экстракции гелемQIAGEN28704
АгарозаСигма-ОлдричA9539или эквивалент
бромида этидия Sigma-AldrichE1510или эквивалент
100.о. ДНК-лестницаInvitrogen15628019или эквивалент
6x Загрузочный буферThermoScientificR0611или эквивалент
NanoDrop 2000 UV-Vis спектрофотометрThermoScientificND-2000
Nextera XT Index kit IlluminaFC-131-1001 или FC-131-1002
2x KAPA HiFi Горячий старт Готовый микс KAPA BiosystemsKK2601
Dynal магнитная подставка для пробирок 2 млInvitrogen12321Dили аналог
Agencourt AMPure XP 60 мл наборBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 мМ, pH 8,5общий лабораторный поставщик
Agilent 2200 TapeStation системаAgilent TechnologiesG2964AAили аналогичная
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582или аналог
D1000 РеагентыAgilent Technologies5067-5583или аналог
KAPA Library Quantification Kit для платформ Illumina (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Быстрая система для ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемы4329003
NaOH 1.0 N, молекулярный поставщик для общейлабораторной
HT1 (буфер для гибридизации)Illumina Входит в состав MiSeq Reagent Kit
MiSeq Reagent Kit v3 (150 циклов)IlluminaMS-102-3001
MiSeq SystemIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
общего работы по биологии

Ссылки

  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 15 (4), 272-286 (2014).
  3. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  4. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  5. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  6. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  7. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites identifies active regulatory elements in human multipotent hematopoietic progenitors. Blood. 116 (25), 5507-5517 (2010).
  8. Biasco, L., et al. Integration profile of retroviral vector in gene therapy treated patients is cell-specific according to gene expression and chromatin conformation of target cell. EMBO Mol Med. 3 (2), 89-101 (2011).
  9. De Ravin, S. S., et al. Enhancers are major targets for murine leukemia virus vector integration. J Virol. 88 (8), 4504-4513 (2014).
  10. LaFave, M. C., et al. mLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters. Nucleic Acids Res. 42 (7), 4257-4269 (2014).
  11. Gupta, S. S., et al. Bromo- and extraterminal domain chromatin regulators serve as cofactors for murine leukemia virus integration. J Virol. 87 (23), 12721-12736 (2013).
  12. Sharma, A., et al. BET proteins promote efficient murine leukemia virus integration at transcription start sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 12036-12041 (2013).
  13. De Rijck, J., et al. The BET family of proteins targets moloney murine leukemia virus integration near transcription start sites. Cell reports. 5 (4), 886-894 (2013).
  14. Romano, O., et al. Transcriptional, epigenetic and retroviral signatures identify regulatory regions involved in hematopoietic lineage commitment. Sci Rep. 6, 24724(2016).
  15. Cavazza, A., et al. Dynamic Transcriptional and Epigenetic Regulation of Human Epidermal Keratinocyte Differentiation. Stem Cell Reports. 6 (4), 618-632 (2016).
  16. Miller, A. D., Law, M. F., Verma, I. M. Generation of helper-free amphotropic retroviruses that transduce a dominant-acting, methotrexate-resistant dihydrofolate reductase gene. Mol Cell Biol. 5 (3), 431-437 (1985).
  17. Cattoglio, C., et al. High-definition mapping of retroviral integration sites defines the fate of allogeneic T cells after donor lymphocyte infusion. PLoS One. 5 (12), e15688(2010).
  18. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151(2013).
  19. Biffi, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy benefits metachromatic leukodystrophy. Science. 341 (6148), 1233158(2013).
  20. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
  21. Gillet, N. A., et al. The host genomic environment of the provirus determines the abundance of HTLV-1-infected T-cell clones. Blood. 117 (11), 3113-3122 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ПЦР с использованием линкеровпереваривание геномной ДНКрестрикционное перевариваниеанализ методом проточной цитометрииэлектрофорез в агарозном гелеподготовка библиотекглубокое секвенирование
Ретровирусное сканирование: определение сайтов интеграции MLV для определения регуляторных областей, специфичных для клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.