Методическая статья

Улучшение приложения высокомолекулярного декстрана биотинилированным Амин Thalamocortical проекции трассировки в крыса

DOI:

10.3791/55938

⸱

12 апреля 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем изысканные протокол эффективно раскрыть биотинилированным декстрана Амин (BDA) маркировки с флуоресцентных окрашивания метода через взаимные нейронные пути. Это подходит для анализа тонкой структуры из BDA маркировки и отличает его от других нервных элементов под конфокальный лазерный сканирующий микроскоп.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биотинилированным высокомолекулярного декстрана Амин (BDA) был использован как трассировщик высокочувствительный нейроанатомический на протяжении многих десятилетий. Поскольку качество его маркировки пострадал от различных факторов, здесь, мы предлагаем изысканный протокол для применения высокой молекулярной массой BDA для изучения оптимальных нейронных маркировки в центральной нервной системе. После стереотаксической инъекции АРП в вентральной задне ядро таламуса крыс через деликатные стеклянные пипетки (ВПМ) BDA витражи с флуоресцентные стрептавидина Alexa (AF) 594 и counterstained с флуоресцентные Ниссль пятно AF500/525. На фоне зеленых Ниссль окрашивание красный BDA маркировки, включая нейрональных клеток органов и аксональной терминалы, более отчетливо проявилось в соматосенсорной коры. Кроме того, двойной флуоресцентные пятная для BDA и кальция связывания белка Парвальбумин (PV) была проведена соблюдать соотношение BDA маркировки и PV-позитивных интернейронов корковых целевой, предоставляя возможность для изучения местных нейронных схемы и их химических характеристик. Таким образом этот изысканный метод подходит не только для визуализации высокого качества нейронных маркировки с высокой молекулярной массой BDA через взаимные нервные пути между таламус и коры головного мозга, но также позволит одновременной демонстрации другие нейронных маркеры с флуоресцентные гистохимии или иммунохимии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокомолекулярный BDA (10,000 молекулярный вес), высокочувствительный трассировщика, была использована для отслеживания нервные пути в центральной нервной системе для более чем 20 лет1. Хотя использование BDA является общей нейронных тракта, отслеживание техники, качество BDA маркировки могут быть затронуты в животных различных факторов1,2,3. Наши недавнее исследование показало, что оптимальная структура BDA маркировки не только связанные с надлежащей впрыск выживания время, но также коррелирует с окрашивание метод4. До сих пор, обычных авидин биотин пероксидаза комплекс (ABC), стрептавидина флуоресцеин Изотиоцианаты и AF594 стрептавидина пятная методы были использованы для выявления, маркировки АРП в предыдущих исследований2,3, 4,5. В сравнении флуоресцентный окрашивания для BDA могут легко выполняться.

Для того, чтобы распространить применение высокой молекулярной массой BDA, изысканный протокол был введен в настоящем исследовании. После инъекции АРП в VPM таламуса в мозге крыс BDA маркировки было выявлено регулярный метод окрашивания стандартной ABC, а также двойной флуоресцентные окрашивание, которая была проведена для наблюдения корреляции BDA маркировки и основные нервных элементов или интернейронов корковых целевой стрептавидина AF594 и флуоресцентные Ниссль гистохимии или PV-Иммунохимия, соответственно. Через взаимное нервные пути между ВПМ и первичной соматосенсорной коры (S1)6,7,8мы сосредоточили наши наблюдения на BDA маркировки в thalamocortical прогнозам аксонов и corticothalamic СОСМ прогнозируемые ячейки в строке S1. Этот процесс мы должны обеспечить не только подробный протокол для получения высокого качества нейронных маркировки с высокой молекулярной массой BDA, но и изысканный протокол на сочетание люминесцентные маркировки BDA и другие флуоресцентные нейронных маркеры с гистохимии или иммунохимии. Этот подход предпочтительнее изучить местные нейронных цепей и их химических характеристик под Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование был одобрен Комитетом по этике на Китай Академии медицинских наук (регистрационный номер 20160014). Все процедуры были проведены в соответствии с национальными институтами здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных (Национальная академия Press, Вашингтон, о.к., 1996). В этом исследовании были использованы четыре взрослых самцов крыс (вес 250-280 г). Все животные были размещены в цикле свет/темно 12 h с контролируемой температурой и влажностью и свободный доступ к продовольствию и воде. Инструменты и материалы, используемые в настоящем исследовании были показан на рисунке 1.  Перед операцией все инструменты, такие как стереотаксической рамы и стекла пипетку, были очищены с помощью 70% этиловом спирте.

1. хирургические процедуры

  1. Определение координат области интереса к ВПМ, с использованием стереотаксического Атлас9 (рис. 2A).
  2. Подготовить 1 мкл микро шприц с микропипеткой стекла (с наконечник диаметром приблизительно 10-20 мкм) (рис. 1 d) и проверить его с жидкий парафин.
  3. Анестезировать крыс с 7% хлораль гидрат (0,7 мл/100 г) внутрибрюшинной инъекцией.
  4. После подтверждения глубокий наркоз с хвостом щепотку и педаль вывода рефлекс, бриться верхней части головы животного с электрической бритвой и скраб хирургической сайта 3 раза с 10% повидон йод, следуют этанол 70% соответственно.
  5. Уложите стереотаксического устройство крыса, поместив тупым уха баров в уши и место крыса верхних резцов в рот держатель (Рисунок 1E), а затем применить глазная мазь на глазах.
  6. Очистите кожу головы хирургической сайта снова используя 70% этиловом спирте. Используйте стерильные хирургические перчатки и полотенца для поддержания операции в стерильных условиях.
  7. Сделайте Сагиттальный разрез в коже с помощью скальпеля вдоль Сагиттальный шов (рис. 1F).
  8. Скрип мышц и надкостницы от черепа с помощью стерильным ватным наконечником аппликаторы всей операции управления, кровотечение (Рисунок 1F).
  9. Использование предопределенных координат из атласа (рисунок 2A), определите местоположение (-3,3 мм Bregma точка, 2,6 мм право на срединной) Краниотомия (рис. 1 g).
  10. Выполните краниотомии с помощью сверла заусенцев с небольшим круглым кончиком (#106) (рис. 1 H) и продолжить бурение для о 1 мм глубина в течение нескольких минут до достижения мозговых оболочек (Рисунок 1I).
  11. Акцизный твердой мозговой оболочки с помощью microforceps для предоставления коры головного мозга через инъекции (Рисунок 1I).
  12. Изменить жидкий парафин в микро шприц с 10% BDA (10,000 молекулярный вес, в дистиллированной воде) раствор (Рисунок 1J).
  13. Смонтировать шприц в микроинъекции аппарат и соединиться с микро насос (рис. 1 K).
    Примечание: Объем инъекции зависит скорость микро насоса. Здесь он был скорректирован до 30 нл/мин (рис. 1 Л).
  14. Под стереомикроскопом Вставьте стекло микропипеткой вручную с аппаратом микроинъекции VPM через поверхности коры головного мозга на глубине 5,8 мм (рис. 1 M).
  15. Давление inject 100 nL 10% АРП в VPM в течение 3 мин (35 nL/мин) с микро насос (рис. 1 L, M).
  16. После инъекции держать пипетку в место для дополнительных 5 мин и затем вывести медленно.
  17. Шовные рану стерильную поток (Рисунок 1N). Следуйте рекомендациям Комитета ваших местных животных ухода для пред- и послеоперационная анальгезия.
  18. Место крыса в районе теплых восстановления до тех пор, пока он приходит в сознание и полностью выздоровел.
  19. Возвращение восстановленные крыса в своей клетке.

2. орошений и секции

  1. После времени выживания обычно 10 дней привнести животное с передозировкой 10% уретана (2 мл/100 г), внутрибрюшной инъекции, чтобы побудить эвтаназии.
  2. Perfuse экспериментальных крыс в капюшоне (Рисунок 1O).
    1. После того, как дыхание останавливается, используя ножницы, щипцы, откройте грудной полости крысы для доступа к сердце. Вставьте левый желудочек сторону аорты внутривенного катетера, а затем откройте правом предсердии.
    2. Сначала perfuse с 0,9% фосфат амортизированное saline (PBS) при физиологических температуре (37 ° C) около 1-2 мин до тех пор, пока кровь, удалились от сердца, очистить, а затем продолжить с 250-300 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (PB, рН 7,4).
  3. После перфузии надрезать кожу головы и открыть черепа и затем вскрыть вне мозга крысы. После исправления расчлененных мозга в параформальдегида 4% для 2 ч при комнатной температуре (26 ° C), затем cryoprotect в 30% сахарозы в ФБР (рН 7,4) 0,1 М для 3 дней при температуре 4 ° C до тех пор, пока мозг погружен в раствор (рис. 1 P).
  4. После того, как мозг погружен в раствор, делят на три блока в корональных направлении на мозг матрицы (рис 1 квартал) мозга. Центральный блок содержит ВПМ и S1.
  5. Вырежьте центрального блока мозга на 40 мкм на замораживание сцене, раздвижные системы микротом в корональных направлении. Собирайте эти разделы упорядоченной в 6-ну блюдо с 0,1 М PBS (рН 7,4) (цифры 1R, S).

3. стандартные ABC пятнать

Примечание: Бесплатные плавающей секции от каждого третьего корональных секции мозга были использованы для визуализации BDA маркировки с стандартной ABC процедуры10.

  1. Полоскания разделы в 0,1 М PBS для около 1 мин.
  2. Инкубировать в подразделах 1% раствор ABC в 0,1 М PB (рН 7,4), содержащие 0,3% Тритон X-100 за 1 ч при комнатной температуре.
  3. Мыть в разделах три раза в буфер Tris 50 мм (рН 7,4).
  4. Пятно разделы в раствор, содержащий 0,02% 3, 3'-диаминобензидин tetrahydrochloride (DAB) и 0,01% H2O2 в буфер Tris 50 мм для около 2-5 мин при комнатной температуре.
  5. Мыть в разделах три раза в буфер Tris 50 мм (рН 7,4).
  6. Смонтируйте разделы на скольжениях микроскопа с помощью стандартных гистохимические методы (Рисунок 1Т; см. Дополнительное видео файл III, перфузии и секции).
  7. Сухие разделы в воздухе на ночь при комнатной температуре.
  8. Обезвоживает разделах кратко в серии решений алкоголя (50%, 70%, 95%, 100%). Опускайте слайды в каждом решении для около 15 s. Не позволяйте слайды высохнуть между каждым шагом.
  9. Очистите разделы в ксилоле три раза, около 20 мин.
  10. Положите 2 или 3 капель бальзама на ломтики, а затем место coverslips на участках.

4. двойной флуоресцентные пятная для BDA и основных нервных элементов в коре

Примечание: В отличие от двойной флуоресцентной окраски была проведена для наблюдения корреляции BDA маркировки и основных нервных элементов на прилегающих участках выше используется с стрептавидина AF594 и counterstained с флуоресцентные Ниссль пятно AF500/525.

  1. Полоскания разделы в 0,1 М PBS для около 1 мин.
  2. Инкубировать в подразделах смешанного решения стрептавидина AF594 (1: 500) и AF500/525 Зеленый флуоресцентный Ниссль пятно (1:1, 000) в 0,1 М PBS (рН 7,4), содержащие 0,3% Тритон X-100 втечение 2 ч при комнатной температуре.
  3. Мыть в разделах три раза в 0,1 М PB (рН 7,4).
  4. Смонтируйте разделы на скольжениях микроскопа с помощью стандартных гистохимические методы. Сухие разделы в воздухе около 1 ч.
  5. Применить coverslips к флуоресцентные секции с 50% глицерина в дистиллированной воде до наблюдения.

5. двойной флуоресцентные пятная для BDA и интернейронов в коре

Примечание: Двойной флуоресцентной окраски была проведена для наблюдения корреляции BDA маркировки и интернейронов на представителя секции в целевой корковых стрептавидина AF594 и PV-Иммунохимия.

  1. Промойте представитель Секции в 0,1 М PBS (рН 7,4) около 1 мин.
  2. Инкубировать в подразделах блокирующий раствор, содержащий 3% нормальной козьего сыворотки и 0,3% Тритон X-100 в 0,1 М PBS на 30 мин.
  3. Перенести разделы в раствор мыши моноклонального анти PV IgG (1:1, 000) в 0,1 М PBS (рН 7,4) содержащий 1% нормальной козьего сыворотки и 0,3% Тритон X-100 за ночь при 4 ° C.
  4. На следующий день мыть в разделах три раза в 0,1 М PBS (рН 7,4).
  5. Разоблачить разделы для смешанного решения коза mouse-AF488 вторичное антитело (1: 500), стрептавидина AF594 (1: 500) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI, 1:40, 000) в сыворотке нормальный коза 0,1 М PBS (рН 7,4) содержащий 1% и 0,3% Тритон X-100 за 1 час.
  6. Повторите шаги с 4,3 до 4.5.

6. наблюдение

  1. Возьмите изображения ВПМ, аксоны thalamocortical и corticothalamic нейронов.
    1. Соблюдать флуоресцентные образцы с конфокальный съемочной системы оснащены целей линзы (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0,40; и 40 x, NA: 0,95). Используйте возбуждения и выбросах волн 405 (синий), 488 (зеленый) и 559 Нм (красный).
      Примечание: Здесь, конфокальная обскуры-152 мкм (4 x, 10 x) и 105 мкм (40 x). Пространственное разрешение изображений-1024 × 1024 пикселей (4 x, 10 x) и 640 × 640 пикселей (40 x).
    2. Принять двадцать изображения в последовательных кадров 2 мкм из каждого раздела на толщину 40 мкм (серии Z).
    3. Интегрировать изображения в одно изображение в фокус с обработки системы программного обеспечения для трехмерного анализа следующим конфокальный изображений: установить начало фокальной плоскости → окончания фокальной плоскости → задать шаг размер → выбрать глубину шаблон → изображения захвата → Z серии.
  2. Возьмите изображения brightfield, световой микроскоп, оснащенный цифровой камерой (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0,40; и 40 x, NA: 0,95 линзы). Используйте выдержка из 500 г-жа использования фото редактирования программного обеспечения для регулировки яркости и контрастности изображения и для добавления меток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выживание 10 дней поста инъекции АРП в VPM было достаточно для производства интенсивной нейронных маркировки на соответствующий корковых областях ипсилатеральные в сторону впрыска (рис. 2). Обычных ABC и люминесцентные пятнать процедуры для BDA показали аналогичные модели нейронных маркировки на автомагистрали S1, в том числе anterogradely помечены аксоны thalamocortical и retrogradely помечены corticothalamic нейронов (рис. 2 c<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выбор надлежащего трассирующими является важным шагом для успешной нейронных трассировки эксперимента. В семье BDA, высокой молекулярной массой BDA (10,000 молекулярный вес) было рекомендовано преференциально перевозиться через антероградная нейронные пути в отличие от низкомолекулярных BDA (3000 молекулярный вес)2,3 , 11 , 12 , 13. Однако многие исследования ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Национальный фонд Китая естественных наук (проект кодекса № 81373557, № 81403327).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Биотинилированный декстранамин (BDA)Молекулярные зондыD195610 000 молекулярная масса
стрептавидин-Alexa Fluor 594Молекулярные зондыS32356Защита от света
500/525 зеленый флуоресцентный краситель по НисслюМолекулярные зондыN21480Защита от света
Инструмент для стереотаксиса мозгаNarishigeSR-50
Замораживающий микротомThermoMicrom International GmbH
Конфокальная визуализацияOlympusFV1200
система
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Sprague DawleyInstitute of Laboratory Animal Sciences, Китайская академия медицинских наукSCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC KitVector LaboratoriesPK-4000
superfrost plus микроскоп слайдыThermo#4951PLUS-00125x75x1 мм
Photoshop and IllustrationAdobeCS5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
  2. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
  3. Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886(2012).
  4. Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
  5. Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
  6. Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
  7. Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
  8. Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
  10. Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
  11. Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
  12. Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
  13. Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
  14. DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
  15. Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
  16. Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
  17. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
  18. Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

High Molecular Weight Biotinylated Dextran AmineThalamocortical Projection TracingStereotactic InjectionVentral Posteromedial NucleusFluorescent Streptavidin Alexa 594Fluorescent Nissl StainParvalbumin ImmunostainingNeural Circuit AnalysisCentral Nervous SystemSomatosensory Cortex

Похожие статьи