Методическая статья

3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

DOI:

10.3791/55982

⸱

4 октября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает изготовления упругих 3D Макропористые microcryogels путем интеграции микротехнологий с технологией cryogelation. После загрузки с клетками, создаются 3D microtissues, который может быть легко вводится в естественных условиях для содействия регенеративной терапии или собраны в массивы в пробирке скрининга наркотиков высокой пропускной способности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы обновить традиционные 2D клеточной культуры до 3D клеточной культуры, мы интегрировали микротехнологий с технологией cryogelation для производства Макропористые микромасштабной криогелей (microcryogels), который может быть загружен с различных типов клеток сформировать 3D microtissues. Здесь мы представляем протокол изготовить универсальный 3D microtissues и их применения в восстановительной терапии и наркотиков скрининг. Размер и форма управляемый microcryogels могут быть изготовлены на чипе массива, который может быть заготавливаемым от чип как отдельных клеток загруженных перевозчиков для инъекционного регенеративной терапии или далее собран на чип в 3D microtissue массивы для высокой пропускной способности скрининга наркотиков. Из-за высокой упругой характер этих микромасштабной криогелей 3D microtissues проявляют большой injectability для малоинвазивных клеточной терапии, защищая клетки от механической поперечной силы во время инъекции. Это гарантирует выживание расширенной клетки и терапевтический эффект в мышиной модели ишемии конечности. Тем временем Ассамблея 3D microtissue массивов в стандартном формате 384-multi ну облегчает использование общих лабораторных объектов и оборудования, позволяя высок объём наркотиков скрининг на этой платформе культуры универсальный 3D клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные клеточной культуры на плоского двумерного (2D) поверхностей, таких как культуры блюдо или несколькими хорошо пластины, вряд ли может вызывать поведение клеток недалеко от их собственного государства. Точное повторение родной сотовой микросреды, которые состоят из различных типов клеток, внеклеточной матрицы и биологически растворимых факторов в трехмерной (3D) архитектуры1,2,3 ,4, имеет важное значение для построения biomimicking тканей в пробирке для приложений в ткани инженерных, восстановительной медицины, биологии фундаментальных исследований и наркотиков обнаружения5,6,7 ,8,9.

Вместо 2D клеточной культуры 3D клеточной культуры широко используется для продвижения biomimetic микро архитектуры и функциональные особенности клетки культивировали в пробирке. Популярные 3D клетки культуры метод заключается в совокупных клетки в сфероидов7,8,9,10. Сотовый сфероидов может быть введен в поврежденных тканей с расширенной сотовой хранения и выживания, по сравнению с инъекции рассеянных клеток. Однако неоднородной сфероида размеров и неизбежных механических повреждений, введенной на клетки жидкости поперечной силы во время инъекции привести к плохой клеток терапевтические эффекты11,12,13. Аналогичным образом присущие неравномерность в ходе агрегирования сфероидов сделало их перевод в 3D на основе ячеек высок объём наркотиков скрининг сложной10.

Другой метод для 3D клеточной культуры достигается с помощью биоматериалов, который обычно инкапсулирует клетки в водный гидрогели или пористых строительных лесов. Это позволяет для большей гибкости в построении 3D архитектуры. Для терапии клетки, инкапсулированные в сыпучих строительных лесов, обычно доставляются тела животного через хирургической имплантации, который инвазивных и травматические, тем самым ограничивая его широкий перевод к постели. С другой стороны водный гидрогели включить минимально инвазивная терапия, клетки, приостановлено в растворе прекурсоров гидрогеля в тел животных, позволяя в situ гелеобразования через термо-, химические или ферментативный сшивки11. Однако как клетки доставляются хотя гидрогеля прекурсоров находятся все еще в состоянии водный, они также подвергаются механической сдвига во время инъекции. Не только так химических или ферментативный сшивки во время гелеобразования в situ гидрогеля также может наложить повреждения клеток внутри. Для скрининга наркотиков, при содействии биоматериала клеточных культур сталкиваются с проблемами с единообразия, управляемость и пропускную способность. С помощью гидрогели, клетки обычно участвуют во время гелеобразования, в которой процесс может повлиять на жизнеспособность клеток и функции. Гелеобразование во время заполнения ячейки также препятствует использование большинства высокопроизводительного оборудования, так как Гидрогель может потребоваться храниться на льду для предотвращения гелеобразования до заполнения ячейки, и гидрогеля возможно застревание дозирования советы, которые обычно очень тонкие, чтобы обеспечить точность для высокопроизводительного скрининга. Предварительно сформированных леса могут потенциально отдельных процедур изготовления биоматериала из клеточной культуры, однако большинство продуктов на основе эшафот доступны как сыпучих материалов с относительно низкой пропускной способности14.

Чтобы преодолеть некоторые из недостатков нынешних методов 3D культуры, мы разработали микротехнологий cryogelation интегрированные технологии для изготовления готовых и удобный microcryogel массив чип15. В этом протоколе желатин выбран иллюстрируют технология изготовления microcryogel как это биосовместимых, разложению, экономически эффективным, и никаких дальнейших изменений требуется для клеток вложения. Другие полимеры природные или синтетические источники также могут использоваться для изготовления, в зависимости от приложения. Через эту технологию мы можем изготовить миниатюрных и Высокоэластичный microcryogels с контролируемый размер, форму и структуру. При загрузке с различных типов клеток, 3D microtissues может быть сформирован для различных приложений. Эти уникальные особенности включить желаемый injectability, Защита ячеек и ориентированные на сайте удержания после инъекции в естественных условиях для расширения терапевтические эффекты. Это не только так microcryogels может быть дополнительно обработаны для формирования 3D microtissue массивов, которые совместимы с общей лабораторное оборудование и инструменты для реализации высокопроизводительных клеточной культуры для скрининга универсальный наркотиков и других клеточных анализов. Здесь мы будем подробно процесс изготовления microcryogels и ее после лечения как отдельные 3D microtissues или 3D microtissue массивы для двух важных приложений, клеточной терапии и наркотиков скрининг, соответственно10,15 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

эксперименты на животных следуют строгим протокол, утвержденных Комитетом по этике животное на центр биомедицинских анализ, Университет Цинхуа. Соответствии с одобрения Комитета по этике, жировых тканях человека была получена из Департамент пластической хирургии Peking союза больницы с информированного согласия от больных.

1. изготовление 3D Microcryogels

  1. , проектирование и изготовление чипов массив microstencil
    1. Использование коммерческого программного обеспечения дизайн массивы конкретных геометрий, таких как круги, эллипсы, треугольники или Клевер 14, в зависимости от последующих приложений.
      Примечание: Обратитесь к разделу 2 протокола для регенеративной медицины и статья 3 протокола для скрининга наркотиков для детали дизайна.
    2. Импортировать дизайн лазерной гравировки программного обеспечения, сопровождающих лазерный гравер. С помощью параметров лазерной согласно рекомендациям завода для лазерный гравер, лазер выгравировать импортированные дизайн на Поли (methymethacrylate) (PMMA) листы.
    3. Мыть microstencil массив фишки с дейонизированной воды для очистки мусора из лазерной гравировки. Сухой microstencil массив фишки на 60 ° C. магазине в запечатанном мешке при комнатной температуре для месяцев.
  2. Изготовление чипов массив microcryogel
    1. microstencil место 4 массива фишки на панели образцов и вставить в плазме чище. Закройте крышку пылесоса и включите вакуумный насос для 2 мин, затем повернуть на максимальной мощности (18 Вт) для лечения microstencil массив фишки в плазме пылесос за 3 мин при комнатной температуре для увеличения гидрофильность.
    2. Добавить 0,06 г желатина, 1 мл деионизированной воды до 6% (wt/vol) желатина прекурсоров раствор (достаточно, чтобы сделать 5 фишек). Тепло при 60 ° C на водяной бане, чтобы растворить адекватно. Инкубируйте на льду на 5 мин
    3. Добавить 3 мкл глютаральдегид в раствор желатина прекурсоров до конечной концентрации 0,3%. Тщательно перемешать.
    4. Пипетку 200 мкл прекурсоров раствор с глютаральдегид на верхней поверхности чипа массив microstencil.
      Примечание: 200 мкл достаточна для чипа 75 мм × 25 мм независимо от дизайна. Увеличить сумму пропорционально при увеличении площади поверхности чипа.
    5. Вручную решение равномерно распределить над обломоком соскабливания назад и вперед с жезлом гнутое стекло 2-3 раза.
      Примечание: Каждый микро Ну на чипе microstencil могут быть заполнены с прекурсорами решения из-за их гидрофильной природы после плазменной обработки.
    6. Сразу же место прекурсоров решение заполненный массив чип в морозильной камере-20 ° C для 16 h для cryogelation.
    7. Регулировка лиофилизатор до-40 ° C на 30 мин поместить фишки массива после cryogelation в лиофилизатор и lyophilize массива чипы для 2 h в вакууме.
      Примечание: Microcryogels желатин с взаимосвязанных macropores образуются потому что лед, образующийся в cryogelation sublimes в лиофилизатор.
    8. Перейти к разделу 2 для лечения ишемии нижних конечностей (CLI) и разделу 3 для наркотиков высокопроизводительного скрининга.

2. Заготовка отдельных Microcryogels инъекционные формы 3D Microtissues для лечения CLI

  1. заготовка отдельных microcryogels
    1. Дизайн массивов (75 мм × 25 мм) 600 кружков, каждый диаметром 400 мкм, в коммерческое программное обеспечение для строительства инъекционные 3D microtissue. Используйте ПММА толщиной 300 мкм для изготовления чипа microstencil массив как подробно говорится в разделе 1.1.
    2. Изготовить microcryogel массив фишки как раздел 1.2.
    3. Изготовить PDMS эжектор штырьковых выводов с тот же дизайн как и шаг 2.1.1 стандартной мягкой литографии 16 , 17.
    4. Наложения microcryogel массив чип на вершине PDMS эжектор-штырьковых, совместив каждый microcryogel с эжектором ПИН в массиве. Нажмите microcryogel массив чип к эжектор штырьковых нажать microcryogels из microwells с выступающими контактами на штырьковых PDMS эжектор для сбора индивидуальных microcryogels.
    5. Урожай microcryogel в воду и собирать их с помощью ячейки сита. Использовать один фильтр для сбора microcryogels от одного чипа (т.е., 600 microcryogels).
    6. Microcryogels мыть с 0,1 М NaBH 4 на льду для 20 минут утолить остатков uncross-связанных альдегид. Используйте 5 мл 0,1 М NaBH 4 на чип. Отменить NaBH 4 и мыть с 5 мл деионизированной воды 15 минут 3-5 раз, каждый раз,.
    7. Слейте воду из клеток ситечко и собирать microcryogels в один кластер в ячейке сетчатый фильтр и место одного кластера в одном 35-мм Петри с помощью Изогнутый пинцет. Добавьте 50-70 мкл деионизированной воды для каждого кластера и покрывают крышкой Петри. Аккуратно нажмите Петри блюдо на столе до уровня, все microcryogels, так что не microcryogels лежат поверх другой microcryogel сформировать монослоя microcryogels на поверхности Петри.
    8. Заморозить собранного microcryogels при-20 ° C для 4-16 h до лиофилизации их для 2 h (см. шаг 1.2.7). Магазин microcryogels в вакууме при комнатной температуре до дальнейшего использования.
  2. Характеристика microcryogels
    1. оценить поры microcryogels путем сканирования изображений электронная микроскопия (SEM).
      1. Обездвиживания собранного и лиофилизированные microcryogels на держатель образца двухсторонний скотч и пальто с золотом с распыления нанесения покрытий для 90 s, прежде чем изображений SEM 11. Оценивать и анализировать распределение диаметров пор в microcryogel от семи различных SEM изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
    2. Весят один кластер 600 лиофилизированные microcryogels в 35-мм Петри для веса сухих желатиновых microcryogels (GMs). Добавьте 60 мкл деионизированная вода кластер лиофилизированные microcryogels и ждать 30 s для microcryogels полностью поглощать воду и набухают. Весят опухшие microcryogels.
      1. Определить равновесие отек соотношение и пористость microcryogels, как отношение веса опухшие microcryogels сухих желатиновых microcryogels и соотношение веса провел воды в microcryogels что гидратированных microcryogels, соответственно 13.
    3. Меры injectability microcryogels с использованием программируемых шприцевый насос интегрирован с цифровой силой колеи 14.
      1. Пятно 600 штук microcryogels, Трипановый синий и приостановить в 600 мкл 15% раствор желатина для достижения однородной распределения. Загрузить microcryogel 1 мл суспензии в шприц 1 мл. Инъекционные смеси через 27-иглы прилагается к 1 мл шприц, с помощью программируемых шприц насоса при скорости потока 1 мл/мин
      2. Монитор реального времени впрыска силы цифровой силой калибровочных испытаний и участок кривой силы время. После инъекции, соблюдать целостность microcryogels под микроскопом.
        Примечание: GMs, приостановлено в 15% (wt/vol) раствор желатина можно плавно вводят и остались нетронутыми после инъекции.
    4. Характеризуют разлагаемость microcryogels.
      1. Во-первых, измерить вес одного кластера 600 лиофилизированные microcryogels в 35-мм Петри как сухого веса. Затем погрузите 600 лиофилизированные microcryogels в 2 мл 0,025% (vol/vol) трипсина/ЭДТА.
      2. Сбор microcryogels от решения с помощью стрейнер клеток в разных временных точках (т.е., 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 70 мин.). Фитиль от избыточного решения с ткани. Измерить вес microcryogels в разное время точках и рассчитать степень деградации, как отношение веса microcryogel в определенный момент времени, microcryogel в момент нулевой.
  3. Автоматическая загрузка клеток в microcryogels форме 3D microtissues
    1. простерилизовать microcryogels с шагом 2.1.8 системой стерилизации оксида этилена с 12 h газа экспозиции следуют 12 h дегазации в переменного токаUUM.
    2. Выбрать жировой производный Мезенхимальные стромальные клетки человека (использования) для лечения ишемического мыши задних конечностей. Изоляция клетки, следуя инструкциям как сообщалось ранее 18.
    3. Культура использования в росте носитель, содержащий 2% плода бычьим сывороточным (ФБС), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 10 нг/мл тромбоцитарный фактор роста bb (PDGF-bb), 1 X инсулина трансферрина селен (СТС), 10 -8 M дексаметазон, 10 -4 М аскорбиновая кислота 2-фосфат, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина в среде DMEM/F12. Проход клетки в соотношении 1:3 когда вырожденная. Используйте клетки прохода от 3 до 5 в следующих экспериментов.
    4. Урожай использования с трипсина и количественной оценки количества клеток с помощью Fuchs-Розенталь Счетной палаты и Ресуспензируйте к плотности 8 х 10 6 клеток/мл в среде рост использования.
    5. Пипетку 60 мкл использования подвеска на монослое 600 microcryogels с диаметром 400 мкм в 35-мм блюдо из раздела 2.1. Клетки автоматически поглощаются в пористых микро структуры microcryogels.
    6. Поддержания в камере увлажненные и инкубировать при 37 ° C 2 h разрешить клетки для присоединения. После 2 ч инкубации добавьте 2 мл питательной среды. Измените носитель каждые 2 дня. Культура использования загруженных microcryogels для 2 дней сформировать 3D microtissues.
    7. После 2 дней культивирования, Пипетка 100 загружен использования microcryogels в колодец на плиту 96-луночных, 120 мкл рабочего раствора резазурина, подготовленный согласно данным производителя ' s инструкция в каждой скважине. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
      1. Обнаружить флуоресценции резазурина метаболизируется путем жизнеспособных клеток в Считыватель микропланшетов с легкие волны возбуждения 560 Нм и выбросов легкие волны 590 нм. Создание стандартной кривой количества клеток против флуоресценции, с помощью использования интерполировать номер клетки от интенсивности флуоресценции для будущего эксперимента согласно комплект протокола 13.
    8. Оценить количество использования в microcryogels от дня 0 день 4 с помощью резазурина, как описано в разделе Шаг 2.3.7 от дня 0 день 4.
    9. Пятно клетки в microcryogels с Флуорексон утра разбавления 1: 500 и 1: 250 разрежения пропидий йодидом (известный как жить/мертвые окрашивание) в-фосфатный буфер (PBS) и наблюдать под флуоресцентным микроскопом или конфокальный флуоресцентным микроскопом.
  4. Для инъекций 3D microtissues в естественных условиях для лечения CLI в мышиной модели
    1. создать задних конечностей критической ишемии женского ню мышей BALB/c как сообщил 11 , 19 для определения терапевтический эффект 3D терапии на основе microtissue.
    2. Передачи microtissues из шага 2.3.6 с помощью пипетки 5-мл в ячейки сита и фильтр от культуры среднего.
    3. Ресуспензируйте загружен использования 3D microtissues в 15% раствор желатина, на плотности 100 microcryogels за 100 мкл раствора.
    4. До операции, стерилизовать хирургические инструменты в автоклаве и выполнять операции в операционной комнате животных в животных центр.
    5. Поместите курсор мыши в камеру индукции анестезии, содержащие 1-3% изофлюрановая в 100% кислорода со скоростью потока 1 Л/мин эритромицин применить на глазах мыши для предотвращения высыхания. Через разрез кожи длиной 1 см, перевязать бедренной артерии и ее ветвей с шелковыми швами 5-10 и акцизных 19.
    6. Придать indocyanine зеленый (ГСИ) (0,1 мл по 100 мкг/мл), через хвост вен инъекции, чтобы контролировать поток крови. Выполнять ГСИ флуоресценции изображений с помощью флуоресценции изображений системы (здесь, домашние системы) в отражательной геометрии 11.
    7. Внутримышечно ввести microtissues в три сайты gracilis мышцы вокруг разрез артерии, используя шприц 1 мл с иглой 23-калибруйте.
    8. После операции, согреться мыши с подогревом площадку в клетке восстановления. Вводить подкожно Мелоксикам, чтобы облегчить боль и мониторинга непрерывно, пока спит.
    9. После 28 дней, контролировать Терапевтическая эффективность 3D microtissue лечить конечности флуоресценции изображений 11.
      Примечание: Вводить подкожно Мелоксикам, чтобы облегчить боль, когда мышь показал ампутация конечностей спонтанно.
    10. Euthanize мышей с двуокиси углерода после завершения экспериментов.
      Примечание: Здесь, эвтаназия диоксидом углерода была выполнена согласно строгим протокол, утвержденных Комитетом по этике животное на центр биомедицинских анализ, Университет Цинхуа.

3. Собрание Microtissue массив чип для высокопроизводительного скрининга наркотиков

  1. Ассамблеи microcryogel массива для на чипе клеточной культуры
    1. изменить дизайн в разделе 1.1 согласно измерениям обычными мульти хорошо пластины, то есть, для формата 384-multi Ну, Дизайн массив 16 × 24 скважин (строки по столбцу), каждый 2 мм диаметром и 4,5 мм-центр интервал.
    2. Лазерной гравировки на 500 мкм толстый лист PMMA, как описано в разделе 1.1.
    3. Fabricate microcryogels, как описано в разделе 1.2 используя полученную 384-multi ну массив чип от шаг 3.1.2. Этот массив microcryogel содержащих обозначается как чип массив microcryogel.
    4. Мыть чип массива microcryogel с 50 мл 0,1 М NaBH 4 утолить любой остаточный альдегид uncross-связаны, затем неоднократно промойте с 50 мл деионизированной воды 2 h 3 раза, каждый раз.
    5. Слейте воду, заморозить чип массив microcryogel при-20 ° C для 4-16 h до лиофилизации согласно шагу 1.2.7.
    6. Изменить 384-multi ну массив дизайн в действии 3.1.1 содержит 16 × 24 скважин, каждый из 3 мм диаметром и 4,5 мм-центр интервалов.
    7. Удалить одну сторону минусовки из листа ультра-тонкий (10 мкм) биосовместимых двухсторонний скотч и вставьте его в одну сторону кусок лист PMMA толщиной 3 мм. Лазерной гравировки дизайн от шага 3.1.4 на этот лист PMMA толщиной 3 мм в соответствии со статьей 1.1. Этот массив обозначается как массив водохранилище.
    8. Выравнивание массива microcryogel чип с чипом массив водохранилища и следовать вместе плотно, чтобы собрать 3D microcryogel массив чип для на чипе клеточной культуры. Стерилизовать ультрафиолетового излучения на 1 ч.
    9. 3D microcryogel массив хранения щепы в вакууме при комнатной температуре для дальнейших экспериментов.
  2. Наркотиков скрининг на 3D microtissue массивы
    1. заполнить вверх мокрой коробку с 25 мл стерильного деионизированной водой в качестве камеры влажности для клеточной культуры. Подогрейте в увлажненные 5% CO 2 инкубатора 37 ° C.
    2. Урожай не небольшие клеток легких клетки рака (NCI-H460) и гепатоцеллюлярной карциномы клетки (HepG2) от культуры ткани пластины согласно стандартный протокол и вновь приостановить в культуре средств массовой информации к окончательной плотности 1,0 x 10 6 клеток/мл. Тщательно перемешать.
      Примечание: RPM1640 с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл используется для NCI-H460. Используйте DMEM с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл для HepG2.
    3. Удаление влажности камеры из инкубатора. Используйте пинцет тщательно место собраны 3D microcryogel массив чип из шага 3.1.9 в зале влажности. Соблюдайте осторожность, чтобы вода не попала в microcryogels с водой в камере.
    4. Перемешать суспензию клеток тщательно, затем аликвота 3 мкл суспензии клеток прямо на microcryogel в каждой скважине.
      Примечание: Наконечник пипетки следует слегка коснитесь поверхности microcryogel до высылки суспензию клеток. Клетки, автоматически загружаются в microcryogel путем поглощения. Не семян клеток в периферической Уэллс.
    5. Добавить 10 мкл средств массовой информации для каждой скважины после того, как клетки будут посеяны в microcryogel с помощью многоканальных пипетку, например жидких обработчик 96-канал. Средний также добавляется в периферийных скважин.
      Примечание: Использование RPM1640 СМИ с 10% FBS, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл streptomycin для H460 клеток. Используйте DMEM СМИ с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл для клеток HepaG2.
    6. Культура клеток загруженных microcryogel массив чип в камере 24 h в увлажненные 5% влажности CO 2 инкубатора при 37 ° C массив 3D microtissue.
    7. Растворяют доксорубицин и IMMLG-8439 9 в диметилсульфоксида (ДМСО) сформировать Стоковый раствор 10 мм. Разбавляют препараты с питательной среды для формирования градиента концентрации десятикратного разрежения от 2 Нм до 200 мкм.
    8. Добавить 10 мкл препарата решений в каждой скважины. Используйте 0,1% ДМСО (разбавленный в среде) в качестве элемента управления. Инкубировать массив загруженных 3D microtissue наркотиков в увлажненные 5% CO 2 инкубатора при 37 ° C за 24 ч.
    9. Добавить 4 мкл раствора резазурина запасов для каждой скважины. Инкубировать при 37 ° C 2 h. место 3D microtissue массива в Считыватель микропланшетов и обнаруживать флуоресценции резазурина метаболизируется путем жизнеспособных клеток в легкие волны возбуждения 560 Нм и выбросов легкие волны 590 нм.
    10. Вычесть резазурина базовый сигнал от всех скважин перед дальнейшей обработки данных. Рассчитать долю жизнеспособность клеток каждой скважины, разделив его флуоресценции сигнала средняя флуоресценции сигнал управления скважин.
    11. Участок кривой доза ответ в построения программного обеспечения с долей жизнеспособность клеток как десятичный логарифм концентрации наркотиков как по оси x и оси y. Интерполировать 50% инибиторной концентрации (IC50) на долю жизнеспособность клеток 0,5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изготовление и характеристика microcryogels для формирования 3D microtissue.

Согласно протоколу microcryogels были изготовлены формы 3D microtissues и отдельных microcryogels или microcryogel массивы и были применены к восстановительной терапии и наркотиков скрининг, соответственно (рис. 1). Microstencil массив фишки изготовлены из PMMA применялись как micromolds для microcryogel ма...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регенеративной медицины и в пробирке модели для скрининга наркотиков являются два важных приложений для ткани инженерных5,6,,78,9. Хотя эти два приложения имеют весьма различные потребности, точки соприкосновения между ними заключается в необходимости для более biomimetic культивирования условие для расширения функций клеток19....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была финансово поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (грантов: 81522022, 51461165302). Авторы хотели бы признать все члены лаборатории Du для помощи общего назначения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ЖелатинсигмаG7041Все остальные реактивы были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, штат Миссури), если не указано иное.
Глутаральдегид J& K902042Используется в качестве сшивающего агента при подготовке материала.
Стеклянная крышка накладка (24 x 50 мм)CITOGLASS, Китай10212450CДля соскребания раствора прекурсора на микротрафаретные микросхемы.
Натрий  борогидрид, NaBH4Beijing Chemical Works116-8Для смывания остатков глутарового альдегида после гелеобразования.
Вакуумная баночкаasperts, КитайVC8130Для сохранения микрогелей под вакуумом.
Листы полиметилметакрилата (ПММА Sunjin Electronics Co., Ltd, КитайОбычные листы ПММА.
Лазерная система RayjetRayjet, АвстралияRayjet 50 C30Для гравировки листов ПММА для формирования колодцев.
Очиститель плазмыMycro Technologies, СШАPDC-32GСделать ПММА гифофильным.
ЛиофилизаторBoyikang, КитайSC21CLДля лиофилизации материалов.
Раствор трипана синего цвета (0,4%)Zhongkekeao, КитайDA0065Для окрашивания микрогелей.
Доксорубицина гидрохлоридENERGY CHEMICAL, КитайA01E0801360010Для проверки лекарственной устойчивости клеток в 2D или 3D микрогели.
Анализ живых/мертвыхDojindo Molecular Technologies (Кумамото, Япония)CS01-10Для различения живых и мертвых клеток.
Cell Titer-BluePromega (Висконсин, США).G8080Для проверки жизнеспособности клеток.
Клеточный фильтрBD Biosciences, США352360Для сбора микрогелей.
D-люциферинSYNCHEM (Германия)s039Для прилипания клеток.
Сканирующий электронный микроскопFEI, СШАQuanta 200Для характеристики морфологии микрогелей.
  Машина для механических испытанийBose, США3230Для измерения механических характеристик.
Программируемый шприцевой насос World Precision Instruments, СШАALADINI 1000Для тестирования injactabiliy.
Цифровой силометрHBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., КитайH-50 Для тестирования инджактабилий.
Система стерилизации окисью этиленаAnprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NCAN74iДля стерилизации микрогелей газообразным окисью этилена.
Считыватель микропланшетовMolecular Devices, СШАM5Для измерения интенсивности флуоресценции в микрочипе.
Конфокальный микроскопNikon, ЯпонияA1RsiДля наблюдения за распределением клеток в 3D.
Ксеноген Система визуализации Lumina IICaliper Life Sciences, СШАIVISДля отслеживания клеток у животных.
Жидкая рабочая станцияАбрикосовый дизайн, СШАS-пипеткаДля высокой загрузки среды или суспензии клеток через высокую производительность.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179(2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141(2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O'Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581(2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056(2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D MicrotissuesMicrocryogel FabricationInjectable Regenerative TherapyHigh throughput Drug ScreeningCryogelation TechnologyGelatin MicrocryogelsCell loaded CarriersOn chip AssemblyMouse Limb IschemiaResazurin Assay

Похожие статьи