Method Article

Оценка нарушения пространственной памяти в мышиной модели травматической травмы головного мозга с использованием лабиринта с радиальной водой

DOI:

10.3791/55986

⸱

July 17th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Washington, 2Department of Radiology, University of Utah, 3Geriatric Research Education and Clinical Center (GRECC), VA Puget Sound

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для специфического для мыши теста познания, который не требует плавания. Этот тест можно использовать для успешного распознавания контролируемых кортикальных травмированных мышей с травмой головного мозга от ложных контролей.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на недавнее увеличение использования моделей мыши в научных исследованиях, исследователи продолжают использовать когнитивные задачи, которые изначально были разработаны и подтверждены для использования крысами. Ранее было продемонстрировано испытание лабиринтом радиальной воды (RWT) пространственной памяти (разработанное специально для мышей и не требующее плавания), чтобы успешно провести различие между контролируемыми кортикальными мышами TBI, индуцированными кортикальными поражениями, и противозачаточным контролем. Здесь представлен подробный протокол для этой задачи. Лабиринт RWT основывается на естественной тенденции мышей избегать открытых площадок в пользу обнимания сторон аппарата (тигмотаксис). Стены лабиринта выложены девятью выходными отверстиями, расположенными над полом аппарата, и мышам обучают использовать визуальные сигналы, чтобы найти выходное отверстие, которое выходит из лабиринта. Лабиринт заполнен дюймом холодной воды, достаточным для того, чтобы мотивировать побег, но недостаточно глубоко, чтобы требовать, чтобы мышь плавала. Период приобретения занимает всего четыре тренингаДней, с испытанием сохранения памяти на пятый день и долгосрочным анализом памяти на 12-й день. Представленные здесь результаты показывают, что лабиринт RWT является возможной альтернативой проверенным крысам когнитивным тестам на плавании в оценке пространственных Дефицит памяти в мышиных моделях TBI.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нарушения памяти являются одними из наиболее распространенных симптомов, сообщаемых пациентами после травматической черепно-мозговой травмы (TBI) 1 , 2 . Поэтому точная идентификация и оценка аналогичного дефицита памяти на животных моделях TBI необходимы для нашего понимания этого состояния и его управления. Здесь мы представляем протокол для тестирования пространственной памяти в мышиной модели TBI с использованием лабиринта Radial Water Tread (RWT). Ранее было показано, что этот аппарат оценивает когнитивные дефициты в мышиных моделях контролируемого кортикального поражения (CCI) -индуцированного TBI 3 и представляет собой потенциальную альтернативу проверенным крысам, основанным на плавании тестам на познание.

Растущее разнообразие и доступность моделей трансгенных мышей привели к недавнему увеличению использования мышей над крысами в научных исследованиях 4 . Несмотря на этот сдвиг, исследователи продолжают полагаться наКогнитивные задачи, которые были первоначально разработаны и подтверждены для использования крысами. Наиболее распространенные тесты, используемые в настоящее время для оценки познания у мышей, Морского водного лабиринта (MWM) и кругового лабиринта Барнса, были специально разработаны, чтобы извлечь выгоду из инстинктивного поведения, обнаруженного у крыс 5 , 6 . Учитывая генетические, нейроэкологические и когнитивные различия, существующие между этими двумя видами 4 , неудивительно, что мыши последовательно отстают от этих задач 7 , 8 .

Видимые различия в способности к тестированию особенно важны для плавающих когнитивных тестов, таких как MWM. Хотя и крысы, и мыши являются опытными пловцами, исследователи выявили несколько штаммов мышц, которые заметно отличаются от когнитивных задач 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Даже у животных дикого типа крысы обычно превосходят мышей 7 , 8 . Хотя это можно было бы интерпретировать как видоспецифичную разницу в пространственной памяти, аналогичные последующие испытания с использованием лабиринта с сухим лесом выявили не зависящие от вида различия в когнитивных характеристиках 8 . Множество факторов, не связанных с познанием, могут объяснить это открытие, в том числе зависящие от вида различия в способности плавания или стратегии поиска. Действительно, факторный анализ стратегий поиска, специфичных для мыши в MWM, показывает, что некогнитивные факторы (в частности, тигомотаксис и пассивность ( т. Е. Плавающие)) могут играть более значительную роль в производительности MWM, чем пространственное обучение 14 .

Здесь мы демонстрируем использование когнитивного теста, предназначенного для использования вМышечное поведение мышей и которое не требует плавания, для измерения нарушения пространственной памяти в мышиной модели CCI-индуцированного TBI. В то время как лабиринт RWT ( рисунок 1 A-B ) был задуман как новый гибрид круглого лабиринта MWM и Barnes, он был специально разработан, чтобы использовать интуитивное поведение тигмотактического поведения для мышей 15 , 16 . Аппарат состоит из ванны из оцинкованной стали диаметром 32 дюйма, в которой скучно выровнены девять равномерно расположенных выходных отверстий. Отверстия центрированы на 2-1 / 4 дюйма над полом бака и имеют размеры, соответствующие обычно доступным 1-1 / 2-дюймовым адаптерам ABS DWV SPG x SJ. Восемь выходов закрыты снаружи и ослеплены до глубины 1 дюйма резиновыми пробками. Девятый соединен локтем 90 ° акрилонитрилбутадиенстирола (ABS) с непрозрачным пластиковым коробом, из которого мышь может быть легко удалена после тестирования. В течениеКороткий период сбора данных, мышь обучается использовать уникальные визуальные сигналы, выстраивающие лабиринт, чтобы найти эту экранирующую коробку. Во время тестирования лабиринт заполняется дюймом холодной воды (12-14 ° C), достаточно проворным, чтобы способствовать побегу, но недостаточно глубоко, чтобы мышь плавала.

Лабиринт RWT представляет собой недорогую альтернативу MWM с низким уровнем обслуживания и успешно используется у мышей с возрастными и трансгенными мышами 15 , 17 , 18 , 19 и CCI-индуцированных моделей TBI 3 . Протокол, представленный здесь, представляет собой простой и эффективный метод измерения нарушения пространственной памяти, не требующий предварительной подготовки к травме, и его можно легко модифицировать в соответствии с конкретными потребностями исследовательской лаборатории.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры и обработка животных проводились в соответствии с руководящими принципами ухода за животными, выпущенными Национальными институтами здравоохранения и Комитетом по уходу и использованию животных штата Вашингтон.

1. Хирургия

  1. Анестезируйте мышь при 5% изофлуране в индукционном боксе до бессознательного. Подтвердите анестезию уменьшением частоты дыхания и отсутствием рефлекса отмены после пальца.
  2. Поддерживайте анестезию через носовой конус на уровне 2-2,5% на протяжении всей операции. Контролируйте скорость дыхания во время операции, чтобы мышка оставалась без сознания.
  3. Наведите мышь на нагревательную подушку и поместите мышь в стереотаксическое устройство с помощью ушных стержней, гарантируя, что голова будет надежной и плоской.
  4. Удалите волосы с головы, используя крем для удаления волос. Тщательно промыть кожу головы физиологическим раствором.
  5. Очистите хирургический участок чередующимся йодом и 70% этанольной мойкой.
  6. AdministeRa подкожная инъекция лидокаина и бупивакаина (1 мг / кг) на кожу головы.
  7. С помощью хирургических ножниц сделайте продольный срединный разрез и оттяните кожу, чтобы открыть череп.
  8. Используя 5-миллиметровую трефную пилу, заготовку краниотомию по левую переднеподобную кору с центральной точкой на 2,5 мм позади брегмы и 2,5 мм слева от средней линии. Осторожно удалите круг кости, чтобы обнажить мозг.
  9. Установите ударное устройство со скоростью 6 м / с и временем ожидания 200 мс.
  10. Расположите устройство импактора до тех пор, пока 3 мм выпуклый ударный наконечник слегка не коснется поверхности мозга на 2,5 мм позади брегмы и на 2,55 мм слева от средней линии. Отведите ударный наконечник и опустите на 1 мм (глубина удара). Когда будете готовы, запустите устройство, создав желаемый эффект.
  11. Накройте краниотомию стерильным полипропиленовым диском, закрепленным на дерме с тканевым клеем, и заверните шов надрезами.
  12. Удалите мышь из анестезии и дайте IP-инъекцию BuprЭнорфин (0,5 мг / кг).
  13. Позвольте мыши восстановиться в чистой клетке, нагретой нагревательной подушкой. Мышь должна контролироваться для признаков боли или бедствия в течение следующих 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Элементы управления Sham должны получать идентичную обработку, как указано выше, с шагами 1,8-1,9.

2. Конструкция лабиринта с радиальной водой

  1. Отверстия для отверстий 9 отверстий, достаточно большие для размещения адаптеров ловушки ABS DWV SPG x SJ 1-1 / 2 дюйма с равными интервалами по периметру оцинкованной стальной ванны диаметром 32 дюйма. Центрируйте эти выходы примерно на 2-1 / 4 дюйма над полом бака.
  2. Установите в один из выходных отверстий адаптер 1/4 дюйма ABS DWV SPG x SJ и закрепите его с помощью прилагаемых кольцевых гаек.
  3. С резиновыми пробками закройте восемь из девяти выходов снаружи устройства. Окончательный, нераскрытый выход будет служить маршрутом эвакуации. Не имеет значения, какой выход обозначен как маршрут эвакуации.
  4. Прикрепите ABS на 90 °Локтем к внешнему концу оставшегося выхода. Изгиб 90 ° служит для того, чтобы испытуемые не могли визуально определить правильный путь эвакуации из лабиринта.
  5. Постройте спасательный ящик из любого непрозрачного ящика, способного к дезинфекции и размером примерно 30 см х 15 см х 15 см. Отрежьте отверстие на боковой стороне коробки, прямо над полом, достаточно большим, чтобы разместить локоть ABS на 90 °.
  6. Прикрепите эвакуатор к концевому концу колено ABS 90 °.
  7. Слегка поднимите спасательный ящик (менее одного дюйма) над поверхностью пола. Это позволяет достаточно места для электронагревательной подушки или другого источника нагрева для размещения под эвакуационной коробкой.
  8. Печатайте и ламинируйте как минимум 5 уникальных визуальных сигналов. Используйте простые, высококонтрастные изображения, которые можно легко распознать внутри устройства. Рекомендуется использовать черно-белые фигуры (треугольник, квадрат, круг).
  9. Используя магниты, привязывайте визуальные сигналы к внутренним стенкамустройство. Сигналы должны быть примерно одинаковыми на расстоянии друг от друга по окружности аппарата.

3. Радиальный лабиринт протектора воды

ПРИМЕЧАНИЕ. Испытание лабиринтов в воде должно начаться только после исцеления хирургического участка (примерно через неделю после операции).

  1. Подготовка к тестированию.
    1. Разрешить мышам акклиматизироваться в комнате для тестирования не менее 30 минут до начала тестирования.
    2. Санируйте аппарат, используя 70% -ный спрей этанола.
    3. Заполните аппарат примерно 1 дюймом холодной (12-14 ° C) воды.
    4. Поместите электрическую нагревательную подушку или другой источник нагрева непосредственно под спасательную коробку. Храните спасательный ящик темным и теплым в течение всего времени тестирования.
    5. Расположите яркий источник света над аппаратом.
      ПРИМЕЧАНИЕ. При использовании лампы, которая может быть видна для исследования животных из самого устройства, следите за тем, чтобы лампа была помещена в ту же полостьКаждый день. Сама лампа может представлять собой еще одну визуальную подсказку для мышей, которые будут использоваться, чтобы найти окно эвакуации, и его радикальное перемещение изо дня в день может усложнить результаты.
  2. Протокол тестирования
    1. Выньте мышь из клетки осторожно за хвост и поместите в центр устройства.
    2. Как только животное находится в аппарате, начните отсчет времени.
    3. Как только животное обнаружит правильный выход, оно также установило / ввело окно эвакуации, остановило синхронизацию и записало количество секунд, необходимое для поиска правильного пути.
    4. Если животное попытается залезть в конечное отверстие и не спонтанно войти в лабиринт через 10 секунд, направьте животное обратно в центр лабиринта вручную.
    5. Если животное не может найти правильный путь к экрану эвакуации в течение 3 минут (180 секунд), зачислите пробную версию как неудачу и запишите ее как 180 секунд. Тщательно направляйте животное к правильному пути вручную.
    6. РазрешитьМышь, чтобы оставаться в спасательной коробке в течение 1 мин, промежуточного отдыха.
    7. Как только 1 минута отдыха пройдет, удалите животное из спасательного ящика и вернитесь в его домашнюю клетку.
    8. Тщательно продезинфицируйте спасательный ящик и выйдите на 70% -ный спрей этанола, чтобы мышка не использовала обонятельные сигналы, чтобы найти правильный путь эвакуации. Этот шаг займет не более нескольких секунд.
    9. Верните мышь в лабиринт для следующего испытания.
    10. Повторите шаги 3.2.1-3.2.9 до тех пор, пока мышь не выполнит в общей сложности три испытания, и она либо находится, либо трижды выведена в эвакуационную панель.
    11. После заключительного 1-минутного отдыха верните мышь в свою домашнюю клетку.
    12. Слейте воду и замените воду в аппарате между животными, чтобы обеспечить постоянную температуру во время тестирования.
    13. Повторите шаги 3.2.1-3.2.12 для каждой тестируемой мыши.
    14. На следующий день повторите шаги подготовки 3.2.1-3.2.5. Будьте особенно внимательны, чтобы убедиться, что визуальные сигналы остаютсяВ согласованных позициях между днями тестирования.
    15. Испытуемые животные, используя вышеприведенный ежедневный протокол испытаний для трех испытаний в день в течение четырех дней (период обучения), с окончательным трех пробным тестом на сохранение памяти на пятый день. Шестой трехпробный тест (Долгосрочная сохранность памяти) может быть предоставлен на двенадцатый день.
    16. Не проводите никаких тестов между пятью и двенадцатью днями тестирования.
  3. Анализ
    1. Если мышь не может завершить лабиринт менее чем за 180 секунд в течение любого двухдневного периода ( т. Е. В общей сложности последовательных 6 испытаний, забитых за 180 секунд), рассмотрите мышь, недостаточно мотивированную условиями тестирования, и удалите из анализа.
    2. Рассчитайте среднюю задержку, чтобы завершить лабиринт для каждого испытуемого по дате тестирования, усредняя их три ежедневных испытания на этот день.
    3. Получите групповые различия в сохранении памяти с использованием стандартных t-тестов для сравнения групп в тесте на пятый день и дате тестирования на долговременную память. Если МРуды, чем две группы, сравнивают односторонний ANOVA, за которым следует соответствующий пост-hoc-анализ (например, тест Tukey) для отслеживания любого значимого результата.
    4. Получите групповые различия в периоде приобретения (дни 1-4) с помощью повторного анализа дисперсии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лабиринт RWT ( рис. 1 ) использовался для исследования дефицита пространственной памяти, связанного с повреждением, у мышей, случайно назначенных для приема либо контролируемой кортикальной ударной терапии, либо фиктивной хирургии. Ущерб был вызван с помощью соленоидного кортикального удара с выпуклым наконечником 3 мм и следующими параметрами травмирования: скорость удара 6 м / с, глубина проникновения 1 мм и время контакта 200 мс. Мыши получили когнитивное...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол лабиринта RWT, представленный здесь, успешно проводит различие между CCI-индуцированными мышами TBI и фиктивными контрольными элементами и представляет собой возможную, ориентированную на мышь, альтернативу круговому лабиринту MWM и Barnes. Хотя приведенные здесь результаты говорят только об использовании лабиринта RWT в модели мышиного типа TBI, этот аппарат был успешно использован в престарелых и трансгенных моделях, где вызванное стрессом несоблюдение, полученное в результате испытаний на плавание, выполненн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Фондом экспериментального проекта Института трансляционных медицинских наук (UL1TR000423), Университетом Вашингтона, Центром по развитию человека и инвалидности, а также Университетом Вашингтона по изучению поведения животных и ядром визуализации мозга. Мы хотели бы признать доктора Уоррена Ладигеса за его роль в разработке и распространении оригинального дизайна и протокола лабиринта «Радиальная вода», представленного здесь. Мы также благодарим Тоби Коула за его помощь в этом проекте.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 галлонов Горячая стальная круглая ваннаHome DepotИнтернет # 206638142Требуется: 1
1-1/2 дюйма. Адаптер для ловушек ABS DWV SPG x SJ HomeDepotИнтернет #100344703, магазин SKU #188956Требуется: 9
1-3/4 дюймов x 1-7/16 дюймов. Черная резиновая пробкаHome DepotИнтернет # 100114974 магазин Артикул # 755844Требуется: 8
1-1/2 дюймов. ABS DWV 90 градусов Hub x Hub ElbowHome DepotИнтернет #100346663 Магазин Артикул #188603Требуется: 1
HDX
10 галлонов Сумка для хранения		Home DepotИнтернет #202523587 Магазин SKU #258804 Магазин SO SKU #258804Требуется: 1
Impact One Stereotaxic Impactor для CCILeica Biosystems39463920Требуется: 1
Нониус Stereotaxic с ручным тонким приводом Стереотаксический инструмент для мелких животныхLeica Biosystems39463001Требуется: 1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levin, H. Neurobehavioral outcome of closed head injury: Implications for clinical trials. J. Neurotrauma. 12 (4), 601-610 (1995).
  2. Schretlen, D., Shapiro, A. A quantitative review of the effects of traumatic brain injury on cognitive functioning. Int Rev Psychiatry. 15 (4), 341-349 (2003).
  3. Cline, M. M., et al. Novel application of a radial water tread maze can distinguish cognitive deficits in mice with traumatic brain injury. Brain Res. 1657, 140-147 (2017).
  4. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: Is it a rat race? Dis. Model. Mech. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  5. Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci Methods. 11 (1), 47-60 (1984).
  6. Barnes, C. Memory deficits associated with senescence: A neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psych. 93 (1), 74-104 (1979).
  7. Frick, K., Stillner, E., Berger-Sweeney, J. Mice are not little rats: Species differences in a one-day water maze task. Neuroreport. 11 (16), 3461-3465 (2000).
  8. Whishaw, I., Tomie, J. Of Mice and Mazes: Similarities Between Mice and Rats on Dry Land But Not Water Mazes. Physiol Behav. 60 (5), 1191-1197 (1995).
  9. Francis, D., Zaharia, M., Shanks, N., Anisman, H. Stress-induced disturbances in Morris water-maze performance: Interstrain variability. Physiol Behav. 58 (1), 57-65 (1995).
  10. Wahlsten, D., Rustay, N., Metten, P., Crabbe, J. In search of a better mouse test. Trends Neurosci. 26 (3), 132-136 (2003).
  11. Crawley,, et al. Behavioral phenotypes of inbred mouse strains: implications and recommendations for molecular studies. Psychopharmacology. (Berl). 132 (2), 107-124 (1997).
  12. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. J. Neurobiol. 54 (1), 283-311 (2002).
  13. Rogers, D. C., et al. Use of SHIRPA and discriminant analysis to characterise marked differences in the behavioural phenotype of six inbred mouse strains. Behav Brain Res. 105 (2), 207-217 (1999).
  14. Wolfer, D. P., Stagljar-Bozicevic, M., Errington, M. L., Lipp, H. Spatial Memory and Learning in Transgenic Mice: Fact or Artifact? Physiology. 13 (3), 118-123 (1998).
  15. Koopmans, G., Blokland, A., Vannieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol Behav. 79 (4-5), 683-693 (2003).
  16. Deacon, R., Rawlins, N. Learning impairments of hippocampal-lesioned mice in a paddling pool. Behav Neurosci. 116 (3), 472-478 (2002).
  17. Pettan-Brewer, C., et al. A novel radial water tread maze tracks age-related cognitive decline in mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 3, 1-4 (2013).
  18. Wiley, J., Pettan-Brewer, C., Ladiges, W. Phenylbutyric acid reduces amyloid plaques and rescues cognitive behavior in AD transgenic mice. Aging Cell. 10 (3), 418-428 (2011).
  19. Enns, L., et al. Disruption of Protein Kinase A in Mice Enhances Healthy Aging. PLoS ONE. 4 (6), (2009).
  20. Ivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puolivali, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behav Brain Res. 141 (2), 207-213 (2003).
  21. Shultz, S. R., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor is neuroprotective in experimental traumatic brain injury. J Neurotrauma. 31 (10), 976-983 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radial Water Tread MazeSpatial Memory TestingTraumatic Brain Injury Mouse ModelControlled Cortical ImpactEscape Latency MeasurementVisual Cue ConsistencyWater Temperature ControlMemory Retention TestLong Term Memory AssessmentMouse Specific Cognitive Task

Related Articles