Методическая статья

Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

11.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55994

⸱

25 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

Рассматриваются методы для доставки генов широкомасштабной центральной нервной системы, крыса. В этом примере предназначен для имитации заболевание, которое влияет на весь спинной. Широко трансдукции может использоваться для доставки терапевтических белков ЦНС от одноразовых, периферических администрации.

Аннотация

Аденоассоциированный вирус (AAV) векторы являются ключевым реагента в нейробиологии кластерного регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ), Оптогенетика, КРР lox ориентации и т.д. Цель этой рукописи заключается в помощи следователь, попытки переноса генов экспансивного центральной нервной системы (ЦНС) крыс через хвост инъекции Вену AAV. Масштабное выражение имеет важное значение для условий с широко распространенной патологией, а крысы модель является значительным из-за его большего размера и физиологического сходства для людей, по сравнению с мышей. В этом примере приложения широкомасштабные нейрональных трансдукции используется для имитировать нейродегенеративные болезни, которая затрагивает весь спинного мозга, боковой амиотрофический склероз (ALS). Эффективное широкомасштабное ЦНС трансдукции также может использоваться для доставки терапевтических белков факторов в доклинических исследований. После интервала впрыска выражение несколько недель оцениваются последствия трансдукции. Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) управления вектора количество GFP в мозжечке оценивается быстро и надежно базовой программы обработки изображений. Для мотор болезни фенотипов, которые индуцированных ALS связанных с белком transactive ответ ДНК связывающих белков 43 кДа (TDP-43), дефицит забил побег рефлекс и rotarod. Помимо моделирования заболевания и генной терапии есть различных потенциальных приложений для ориентации масштабе гена, описанных здесь. Расширенное использование этого метода будет помощь в ускорении гипотез в нейробиологии и нейрогенетики.

Введение

Рекомбинантных аденоассоциированный вирус (AAV) векторы являются незаменимыми инструментами для исследования ЦНС, потому что они настолько эффективны для преобразователя нейронов в естественных условиях. Векторы AAV очень универсальны для изучения различных трансгенов и изоформ белка, различных тканей, различными видами и различные маршруты администрации. Например Аав может управляться мышей периферических, относительно неинвазивный, внутривенные инъекции передавать нейронов в ЦНС, впервые описаны в Фоаст et al. и Дуке и др. (см. JOVE документ, Gombash и др. (2014)). 1 , 2 , 3 этот ген доставки подход используется в крыс эффективно выражать либо Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) или ALS связанные белком, transactive ответ ДНК связывающих белков 43 кДа (TDP-43) в ЦНС. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 работа крыс важна потому, что крыса физиологических и метаболических параметров ближе к людям по сравнению с мышей и есть поведенческих и токсикологические анализы, разработанный специально для крыс. Кроме того, более трансгенных крыс линии становятся доступными, могут быть использованы в AAV гена передачи исследований.

Методы подробно для экспансивного переноса генов ЦНС в крыса и быстрой, надежной количественной оценки результатов. Широкомасштабные ЦНС трансдукции используется для имитации симптоматика ALS крыс, выразив TDP-43 во всем спинного. Этот метод является инъекции Вену хвост TDP-43 вектора для молодых взрослых крыс используется в Джексон и др. 6 , 8 , 9 после нескольких недель, TDP-43-индуцированной моторного дефицита забил двумя методами: побег рефлекс и rotarod, используемый в Дейтоне et al. и Джексон и др. 5 , 6 , 7 , 9 для управления GFP вектор, в посмертный анализ, флуоресцентный области мозжечка рассчитывается как индекс электромеханической эффективности, используемые в Джексон и др. 6 , 8 анализ мозжечка оказался быстрый и надежный индекс степени трансдукции ЦНС после родов периферийных гена и должен быть применим к целый ряд подходов, попытки переноса генов периферической и Центральной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

все процедуры, соответствующие руководящие принципы НИЗ. Все процедуры за животных протоколы, которые были утверждены животное уход и использование Комитетом на LSU медицинских наук центр в Шревепорте. Sprague-Dawley, самок в возрасте 6 недель были использованы для выполнения этой процедуры.

1. определить дозы/томов вектора необходимо

  1. взвешивание крыс вводиться и определить количество вирусных вектора, необходимые для каждого животного, основанный на титр (концентрация) вектор подготовки. Использование векторных доз, которые ранее были успешными для эффективного выражения в крыса ЦНС (см. Джексон и др. 6).
    Примечание: для AAV9 TDP-43 или AAV9 GFP, Типичная доза составляет 3 x 10 13 - 1 x 10 14 вектор геномов/кг. Молодых взрослых крыс в возрасте 6 недель весят около 150 г.
  2. Сделать эквивалентных доз / кг у всех животных для систематического сопоставления. Убедитесь, что громкость не превышает стандартный рекомендуется инъекции томов (250-500 мкл для крысы 250 g). Типичная инъекции объем-200 мкл для молодых взрослых крыс.

2. Подготовка рабочей станции

  1. собрать все необходимые принадлежности: один фильм парафин площадь (около 5 х 5 см) на животное, один алкоголя подготовка площадки за животных, марлевые подушечки (2-3 на животных), накапайте советы и микропипеткой.
  2. Подготовка рабочей поверхности путем очистки поверхности с 70% этиловом спирте. Место грелку вниз с температурой, значение низкий (~ 37 ° C). Место скамейке площадку на вершине электрогрелки.
  3. Подготовки газа анестезии (изофлюрановая). Обеспечение достаточного количества кислорода и газа анестезии для процедуры. Очистить индукции камеры и анестезии маска с 70% этиловом спирте и место анестезии маску на скамейке pad.

3. Подготовьте вектор

  1. оттепель вектор при комнатной температуре и пометьте один стерильные microcentrifuge пробирку для каждого животного.
  2. Объем AAV установлено в Пипетка шаг 1.1 в соответствующую трубку и доводят объем до желаемого инъекции объем (здесь, 200 мкл) с лактат Рингера ' s решения или физиологическим.
  3. Пульс вихря образца для 1-2 секунд и затем пульс центрифуги для 5 s принести образец в нижней части трубки.
  4. Пипетки объем всего инъекции для крыс из трубки и на площади парафина фильма.
  5. Место 30 иглы на 1 мл шприц.
  6. Место иглы с наклона вниз в вектор на пленке парафина. Тяните обратно на поршень шприца, до тех пор, пока вирус находится в игл и шприцев. Будьте осторожны, чтобы избежать появления пузырьков воздуха в иглу, которая становится легче с практикой.

4. Подготовьте крыса

  1. поверните кислорода до 1 Л/мин и установите изофлюрановая анестезии до 5%. Убедитесь, что анестезии газ течет к палате индукции путем проверки всех соединительных шлангов и ориентации запорный.
  2. Место крыса в газовой камере индукции анестезии около 3 минут, пока крыса безответный.
  3. Обеспечить адекватной глубины анестезии, защемления ног. Движение в ногу или ноги не должно быть после мыс щипок.
  4. Сократить изофлюрановая анестезии до 2% для поддержания анестезии и настроить краном, так, что течет анестезия анестезии маске.
  5. Место крыса ' s нос в маске анестезии и отрегулировать крыса, таким образом, чтобы она лежала на своей стороне.
  6. Определить боковые хвост вен.
    Примечание: Боковые хвост вен лежат на примерно 10 и 2 o ' часы с спинной верхней части хвоста 12 o ' часы. С крысы, лежа на боку, боковые хвост вен должны быть обращены вверх
  7. Инъекция протрите спиртом салфеткой подготовки. Место инъекции составляет две трети по длине хвоста.

5. Придать вектор

  1. твердо держать хвост слегка выше области инъекции с одним пальцем прямо над боковой хвост вен; это будет расширяются вены.
  2. С наклонной вверх, выровнять иглой с видимой хвост вен в том же направлении.
  3. Проколоть кожу над хвост вен во время принимая большую осторожность, чтобы избежать с другой стороны, держа хвост и нажав на хвост вен.
  4. Давление из Вены хвост для нормального кровотока.
  5. Перемещения иглы в Вену. Чтобы убедиться, что игла прокола Вены хвост, потяните слегка на поршень. Если игла находится в том ключе, в иглу прольется кровь.
    1. Репозиция иглы при необходимости. Затем, для стабилизации иглы, переместить руку выше место инъекции для ниже укола и прижмите хвост конце шприца.
  6. Медленно вдохнуть вектор в хвост (примерно 20 мкл/s).
    Примечание: Вен может потерять цвет вектора потоков через него. Признаки того, что решение было впрыснуто вне Вены включают блеббинг, побледнение кожи, или сопротивление при внутривенном введении вектор. С практикой, могут быть минимизированы экстра сосудистой экспозиции.
  7. После того, как под вектор удалите иглу из крыса и нажмите марлевой против укола, чтобы помочь остановить кровотечение для 30-60 s.

6. Очистка

  1. выключить изофлюрановая анестезии и кислорода. Контролировать крыс до тех пор, пока он приходит в сознание и затем вернуть его к своей клетке.
  2. Тщательно место все иглы в Шарпс контейнер. Утилизация всех других одноразовых материалов, которые являются потенциально загрязненных AAV в контейнер соответствующей биологической. Очистите рабочие станции с 70% этанол.

7. Оценивать задних конечностей побег рефлекс

Примечание: задних конечностей дефициты обычно возникают 2-6 недель после переноса генов TDP-43, в зависимости от дозы вектора.

  1. На плоской поверхности очищают от мусора, с двумя пальцами захватить крыса ' s хвост примерно 2 см от тела. Поднимите крысы аккуратно Передние конечности висят во время просмотра вентральной нижней крысы.
    1. Выполнять процедуру раз в неделю на протяжении экспериментальной время-после переноса генов (например, до 12 недель после переноса генов).
      Примечание: Также оценка дефицита передних конечностей таким образом, но дефицит задних конечностей чаще встречаются в этой модели, в зависимости от дозы вектора используется.
  2. Наблюдать гомотерия за 10 с. Примечание, если один или оба гомотерия сжимал к срединной линии в течение 10 s.
    3. S
  3. повторите этот тест для в общей сложности три раза с 30 между испытаниями. Если один или оба гомотерия сжал для каждого из трех процессов, крыса показывает моторные дисфункции. Запись данных (вручную в примечаниях) как либо нынешнего дефицита односторонние или двусторонние задних конечностей, если есть последовательно сжимая через все три судебных процесса.

8. Оценивать моторную функцию на rotarod

  1. для настройки rotarod, разместите площадку скамейке под rotarod и установите ускорение в 4-40 оборотов в минуту (об/мин) в течение 2 мин (ставка увеличивается на ~0.3 об/мин/s). Для 12-недельный курс, запустить субъектов в 2, 4, 8 и 12 недель после гена передачи.
  2. Позволяют крысы акклиматизироваться к тестирования номер на 20 мин
  3. Обучить крыса использовать rotarod для в первый раз, сначала запустите rotarod на скорости 4 об/мин, а затем место крысы на rotarod. Крыса ходить за один полный оборот на 4 об/мин, а затем начать ускорение и выполнение крыса ходить на rotarod, до тех пор, пока он падает. Продолжить обучение, пока крыса может последовательно ходить по меньшей мере 40 s. Здоровые, молодых взрослых крыс будет легко подготовленных таким образом.
    1. В случае крыса заметно страдает двигательными нарушениями, которые могут помешать крыса достижения базового задержка падать 40 s, предоставляют крысы 3-5 попытки подготовки перед началом забил rotarod.
  4. Начать rotarod проверки, место крысы на rotarod и начать ускорение rotarod. Обратите внимание на время, в котором крысы падает с rotarod; Это задержка падать. Если крыса остается на rotarod после 120 s, крышка на этом этапе сессии, удалить крысы из rotarod и запись падения задержки 120 s.
  5. Повторить тестирование еще два раза в общей сложности три судебных процесса. Чтобы свести к минимуму эффект усталости, космические испытания по крайней мере 5 минут друг от друга. Средние результаты трех испытаний. Ненарушенный взрослых крыс, как правило, имеет среднюю задержку для падения > 40 s.
  6. Крыса обратно в клетке и чистой rotarod и прилегающих районах с 70% этанол.

9. Количественная оценка экспрессия гена GFP в мозжечке

  1. анестезировать крыс и perfuse-фосфатный буфер (PBS), а затем параформальдегида 4%. Вскрыть головного и спинного мозга и замочить тканей в фиксатор на ночь, а затем переместите их на 30% раствор сахарозы. После уравновешивания, вырезать 50 мкм корональных секций на раздвижные микротом с замораживанием этап 4 , 5 , 6.
  2. Выбор разделов 3-6 мозжечка, которые равномерно распределены в червя, Центральный мочку мозжечка. Дневно обозначить GFP для максимального сигнала. Использовать основное антитело для GFP в 1: 500 и использовать Alexa-488 конъюгированных вторичное антитело в разведении 1: 300 4 , 5 , 6.
    Примечание: См. ссылается на 4 , 5 , 6 для более подробная информация о взятии проб, секционирование и пятнать процедур.
  3. Photomicrograph каждый раздел в регионе определенный интерес с низким увеличением объектива, с помощью микроскопа. Использование 2,5 X цель (н.а. 0.12) и фильтр установить 10, 450-490/515-565 возбуждения/выбросов). Сохранить настройки камеры (воздействия раз, например, 2 s) то же самое через образцы для анализа. Сохранить как. TIF файлов.
  4. Открыть Микрофотография в программе широко доступны изображения Scion; два windows откроет. Закройте окна указывается как " индексированных цветов ".
  5. Выбрать " варианты ", затем " плотность SliceŔ спектр оттенков будет указываться красным цветом в окне просмотровые таблицы (LUT). В окне, используйте курсор для заполнения конкретных GFP маркировки только и остановить когда неспецифической фон начинает быть взял на изображении.
    Примечание: Это будет выделить области флуоресцентные Микрофотография чтобы быть количественно. Параметры должны быть оптимизированы специально захватить все заметно люминесцентные клеток. С практикой, этот метод можно точно выделить конкретные флуоресцирования.
  6. Перед началом измерения флуоресцентные области, сначала обеспечить измерения, произведенные в правильной единицах (пикселях). Чтобы сделать это, нажмите кнопку " анализ ", то " набор ScaleŔ четвертая строка должна сказать " единиц ". Выберите из раскрывающегося списка, точках измерения в точках, а затем нажмите " ОК ". Переключать опции анализа на " включают интерьер отверстия " для обеспечения включения всего тела клетки в анализе.
    7. Нажмите
  7. для измерения области флуоресцентные, " анализ " и затем нажмите кнопку " мера ". Чтобы увидеть это значение, нажмите " анализ " нажмите " Показать ResultsŔ появится окно результаты. Флуоресцентный области измерения будет под заголовком помечены " область ".
  8. Для обеспечения стандартизации через измерения, не изменяйте значения выделенной в окне LUT.
  9. После того, как были зарегистрированы все измерения, средние значения для каждого животного (от 3-6 секций на животное). Для сравнения transduced области между группами, используйте соответствующий статистический тест. 6

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Индуцированная мотор нарушениями TDP-43 должно возникать в течение 2-6 недель в зависимости от дозы AAV TDP-43 используется (рис. 1). Инъекции Вену неудачной хвост приведет к частичной или не недостатками; AAV должны достичь кровоток, чтобы произвести эффект. Успешного введения AAV GFP приведет к экспрессия гена GFP в мозг и спинной вектор доза зависимым образом. При использовании сильного рекомбинантных промоутер диск выражение, цитомегаловирус курица бета а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Целый ряд маршрутов доставки были протестированы на векторы AAV: интра Паренхиматозный, интра которых, интра гнойный, внутривенно, интраназально, межмышечная, и т.д. Каждый маршрут может иметь определенные преимущества, а также недостатки. Хвост вен отправления AAV для взрослых крыс является надежным методом для достижения последовательного трансдукции ЦНС. Периферических инъекционный метод избегает введение инъекций канюли в тканях ЦНС и поэтому является минимально инвазивные. Эффективное выражение ЦНС, которое может бы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансировалась ALS ассоциация, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx и благотворительные пожертвования для ALS исследований от Томас Лоусон, для которой мы благодарны. Мы благодарим Elysse Орчард и Донна Burney для консультаций и подготовки кадров. ДЖАС был поддержан фондом лгал и национальных институтов здравоохранения грант GM103418.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ВесыPelouzeSP5
Nalgene ведроThermo Scientific120140004000 мл
Микроцентрифуга пробиркаСША Scientific1615-5500
Раствор лактата Ringer's SolutionBaxter Healthcare0338-0114-04
Мини-вортексерFisher Scientific128101
центрифугаЛабораторная пленка Eppendorf22624415
BemisPM996
1 мл шприцBD309626Поставляется с прилагаемой иглой 25 г><. Замените на иглу 27-30 г для инъекций
Игла 30 г BD305106
IsofluranePiramal Healthcare66794-013-25Isoflurane USP 250 мл
Маска для анестезииKopf Instruments906
МарляHenry Schein100-25242" x 2" (5см x 5см)
Наконечники для пипетокСША Scientific1111-0816
МикропипеткаGilson4642080
Испаритель для газовой анестезииSurgiVet4214322Classic T3
Поглотитель газовой анестезииSurgiVet32373B10Enviro-PURE
ГрелкаSears17280
Настольная подушкаVWR56617-006
RotarodPanlab/Harvard Apparatus76-07724 крысы/4 мыши
70% этанолDecon Laboratories, Inc.2401140 proof
70% изопропанолVWR89108-160
Scion ImageScion Corporation
GFP Tag Поликлональное антителоInvitrogenA11122Первичное антитело - разведение 1:500
AlexaFluor 488InvitrogenA11070Вторичное антитело - разведение 1:300
Axioskop 40 микроскопZeiss

Ссылки

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036(2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFPScion Image

Похожие статьи