Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Жить клеточной изображений грибковых клеток расследовать режимы записи и внутриклеточных локализации дефензинов противогрибковые завод

6.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55995

⸱

24 декабря 2017 г.

 ,  , 
1Donald Danforth Plant Science Center, 2Department of Biology, Kutztown University of Pennsylvania

В этой статье

Краткое содержание

Завод дефензинов играть важную роль в защите растений против патогенов. Для эффективного использования этих противогрибковые пептидов как противогрибковых агентов, понимая их режимы действий (MOA) имеет решающее значение. Здесь жить клеточной изображений метод описан для изучения важнейших аспектов MOA этих пептидов.

Аннотация

Малые хвоща богатые дефензинов являются одним из крупнейших групп узла обороны пептидов в всех растений. Многие растения дефензинов экспонат мощным в vitro противогрибковые активностью в отношении широкого спектра возбудителей грибковых и поэтому имеют потенциал для использования в качестве противогрибковых агентов в трансгенных культур. Для того, чтобы задействовать весь потенциал растений дефензинов для контроля заболеваний, важно разъяснить их механизмов действий (MOA). С появлением микроскопии передовых методов клеток стала мощным инструментом для понимания динамики противогрибковые MOA дефензинов растений. Здесь конфокальная микроскопия на основе клеток изображений метод описан с помощью двух дефензинов дневно обозначенные завода (MtDef4 и MtDef5) в сочетании с жизненно флуоресцентными красителями. Этот метод позволяет в реальном времени визуализации и анализа динамических событий MtDef4 и MtDef5 интернализации в грибные клетки. Важно отметить, что этот assay генерирует большой объем информации, включая интернализации кинетики, режим въезда и внутриклеточных локализации этих пептидов. Наряду с другими инструментами биологических клеток эти методы предоставили критической понимание динамики и сложности MOA этих пептидов. Эти инструменты могут также использоваться для сравнения MOA эти пептиды против разных грибов.

Введение

Растения эволюционировали сложной иммунной системы для защиты от патогенных микробов завод1. Они выражают многочисленные ген закодированы принимающей обороны пептиды с предполагаемым Антимикробная активность2. Действительно многие из этих пептидов отображения антимикробную активность в пробирке3. Дефензинов составляют одну из крупнейших групп узла обороны пептидов в Царство растений4. Эти богатые цистеином, катионных пептидов демонстрируют мощный рост ингибиторная активность против грибковых и оомицеты патогенов в микромолярных концентрациях и представляют собой одну из первой линии обороны против этих патогенов5,6. Из-за их мощных противогрибковых деятельность может быть использована дефензинов в agribiotechnological приложениях для создания болезням сельскохозяйственных культур. Было показано, что учредительный гиперэкспрессия нескольких растений дефензинов повышения сопротивляемости болезням в оранжерею и поле испытания трансгенных культур6. Важно раскрыть механизмы действия (MOA) эти противогрибковые пептиды для того, чтобы полностью использовать их потенциал как эффективных инструментов для защиты урожая. Однако плохо понимаются MOA дефензинов этих растений. Текущие данные свидетельствуют о том, что они демонстрируют разные MOA5,6,,78. Некоторые дефензинов действовать внеклеточно на грибки и целевых конкретных клеточной стенки/плазмы мембраны-резидентов Сфинголипиды, нарушить целостность мембраны и активировать сотовой токсичности пути9,10,11. Недавно однако, противогрибковые дефензинов, которые перемещают в грибные клетки были обнаружили12,,1314. Некоторые из этих дефензинов связываются с биоактивными фосфолипиды мембраны резидентов, образуют олигомерных комплексов и разрушения мембраны плазмы15,16,17. Таким образом были освещены некоторые аспекты MOA дефензинов растений. Однако MOA растений дефензинов вероятно включают сложный набор событий, которые еще не были определены и включены в комплексной модели. В частности сохраняется серьезный пробел в нашем понимании клеточных мишеней этих пептидов.

С последних достижений в микроскопии технологий и разработки новых флуоресцентных зондов методы визуализации клеток в настоящее время часто используются для изучения MOA антимикробных пептидов (AMPs). Эти методы дополняют широко используемые методы, такие как immunolocalization, электронная микроскопия, атомно-силовой микроскопии или рентгеновской томографии18, которые использовались главным образом для того, чтобы проанализировать влияние противогрибковые пептидов на морфологию и рост грибковых клеток, включая изучение целостности клеточной стенки, изменения шаблонов роста/ветвления клеток, а также плазматической мембраны permeabilization и убийство. Тем не менее эти исследования были ограничены для визуализации ячеек в определенный момент времени после лечения с пептидами вместо выполнения покадровой изображений на те же клетки для мониторинга их динамические изменения в ответ на дефенсина вызов. В последние годы использование дневно обозначенные пептидов в сочетании с живой клетки изображений с помощью конфокальной микроскопии позволило в реальном времени визуализации динамики AMP-микробных взаимодействий. Как естественно очищенной и химически синтезированных противогрибковые пептиды могут быть помечены с флуоресцентные метки (например, DyLight, родамин, BODIPY или Alexa Fluor на основе красителей) и непосредственно под наблюдением во время их взаимодействия с клетками промежуток времени жить Клеточная томография. Использование этих помечены пептиды значительно возросло понимание различных аспектов их MOA, включая режим въезда, субцеллюлярные локализации, внутриклеточных торговлю и сайты противогрибковые действий в течение жизни грибковых клеток 18.

Недавно несколько исследований показали, что различные противогрибковые пептиды, включая завод дефензинов относить на счет жизни грибковых клеток12,14,19,20. MOA этих дефензинов вероятно предусматривают взаимодействие с внутриклеточной целей. Недавно мы сообщили противогрибковое действие дефенсина MtDef4 в двух грибов аскомицетов, Нейроспора густая и Fusarium graminearumзавода. MtDef4 было показано использование различных путей для грибковых клеток вход и внутриклеточных локализации в этих грибов14. Это исследование используется химически синтезированных родамин тетраметилсвинца (ТАМРА)-помечены MtDef4 в сочетании с жизненно Краски люминесцентные, флуоресцентные (мембраны селективного окрашивания, FM4-64; мембраны permeant краситель, SYTOX зеленая краска репортер для смерти клетки, пропидий йодидом) и метаболические ингибиторы. Эти анализы показали кинетика интернализации MtDef4, ее механизмы формирования внутриклеточного транспорта и его субцеллюлярные цели14.

Здесь представлен протокол для клеток изображений с помощью конфокальной микроскопии. Протокол использует дневно обозначенные пептидов в сочетании с жизненно флуоресцентных красителей для изучения растений дефенсина грибковые взаимодействия, в частности, пути транслокации и внутриклеточных целей дефензинов в грибковых клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Маркировка дефензинов с флуорофоров

  1. Выберите Флюорофор, который имеет минимальное воздействие на антимикробные свойства, а также поглощение и локализации дефенсина внутри живой клетки.
    Примечание: Выбор оптимального Флюорофор зависит от конкретных экспериментальных целей. Следует также рассматривать спектральных и химические свойства, светостойкость, размер и заряд Флюорофор.
  2. Лейбл дефенсина с выбранной Флюорофор, используя соответствующие пептид, маркировки комплект от коммерческих поставщиков. Кроме того химически синтезировать Флюорофор меченых дефензинов. В этом исследовании, ярлык MtDef5 дефенсина с DyLight550 с использованием коммерческих маркировки комплект по данным производителя протокол и тетраметилсвинец родамин (ТАМРА)-дефенсина помечены MtDef4 был химически синтезированных коммерчески.
    Примечание: Рекомендуется использовать химически синтезированных Флюорофор меткой пептидов (особенно для коротких пептидов аминокислот 50 или меньше), поскольку Флюорофор может быть присоединен к N - или C-терминал остатки пептид обеспечить минимальное воздействие на его Антимикробная активность. Синтез длинные пептидов с более чем тремя дисульфидными облигаций является сложной задачей. В этом случае рекомендуется, что пептид маркироваться с оптимальной Флюорофор, с помощью подходящего коммерчески доступных пептид маркировки комплект.
  3. Тестирование в vitro антимикробной активности помечены дефенсина и определить минимальный тормозной концентрации (MIC) против грибков должны расследоваться.
    Примечание: В этом исследовании, микрофон DyLight550-MtDef5 и ПМР-MtDef4 был определен против Нейроспора густая и Fusarium graminearum.

2. грибковых культур и рост среднего

  1. Передача конидий от запасов культуры н. густая наклонной тубы Вогельс агар средних21 и инкубации при комнатной температуре под свет на 5 дней.
  2. Культура F. graminearum PH-1 штамм на тарелках, содержащие полный средних (см)22 на 28 ° c в течение 5 дней. Для производства конидий прививать 4 вилки (диаметр 10 мм) 5-дневных культуры F. graminearum PH-1 в 50 мл карбоксиметил целлюлозы (CMC) среднего (15 g карбоксиметилцеллюлоза, 1 г, экстракт дрожжей, 0,5 г MgSO4.7 H2O, 1 g NH 4 НЕТ3и 1 g KH2PO4) и культура для 4-7 дней на 28 ° c в шейкере вращающиеся на 180 об/мин.

3. Подготовка конидиальная подвеска

  1. F. graminearum конидиальная подвеска
    1. Вихревой F. graminearum культур в жидкой среде и собирать конидий путем фильтрации 1,5 мл грибковые культуры через два слоя материала фильтрации (например, Miracloth) в 2-мл пробирку microcentrifuge. Центрифуга конидиальная подвеска на 13,226 x g скорость в microcentrifuge на 2 мин.
    2. Отменить супернатанта и добавить 1 мл стерильной воды, чтобы помыть лепешка.
    3. Центрифуга конидиальная подвеска на 13,226 x g скорость в microcentrifuge на 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл 2 X SFM (синтетический грибковых СМИ)23.
    4. Граф конидий, используя Горяева под микроскопом света.
    5. Отрегулируйте конидиальная подвеска до 105 конидий/мл с 2 X УЛП.
  2. N. густая конидиальная подвеска
    1. Передача небольшое количество растущей культуры (5 день старый) н. густая microcentrifuge трубка, содержащая 2 мл жидкой среды Вогельс по циклу прививка.
    2. Вихревой конидиальная подвеска и процеживают через Биофильтрационный материал в новые пробки microcentrifuge.
    3. Центрифуга конидиальная подвеска на максимальной скорости в microcentrifuge на 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте конидиальная Пелле в 1 мл Фогель в жидкой среде.
    4. Граф конидий, используя Горяева под микроскопом света.
    5. Отрегулируйте конидиальная подвеска до 105 конидий/мл с Фогель в жидкой среде.

4. Образец подготовки и конфокальная микроскопия

  1. Локализация внутриклеточных MtDef4 дефенсина в грибные клетки
    1. Пипетка 50 мкл каждого конидиальная подвески (105 конидий/мл) в микрорезервуар 10 мм 35 мм стекла дно микрорезервуар блюд. Для наблюдения за конидий непосредственно перейти к следующему шагу, или для germlings подготовки, пипеткой 50 мкл N. густая и F. graminearum конидий в культуре блюда 35 мм и пусть прорастают для 3-6 ч при комнатной температуре.
    2. Добавьте 50 мкл дневно обозначенные дефенсина в микрофон к каждому блюду микрорезервуар и проинкубируйте 2,5 ч. Микрофон Флюорофор меченых дефензинов используется здесь (шаг 1.3) 3 мкм для N. густая и F. graminearum и MIC ПМР-MtDef4 N. густая и F. graminearum был 1 мкм и 12 мкм, соответственно.
    3. Добавить 2 мкл мембраны-селективных красителя FM4-64 (конечная концентрация: 5 мкм) в культуре блюдо и Инкубируйте 30 мин и сразу подключить конфокального микроскопа для воображения.
    4. Выберите белый свет лазера (WLL). Используйте два лазерных источников 488 нм и 550 Нм для возбуждения ПМР-MtDef4 и FM4-64 краситель, соответственно. Обнаружить флуоресценции ПМР-MtDef4 580-700 Нм и обнаружить FM4-64 красителя на 690-800 Нм.
      Примечание: Выполнение confocal микроскопии в темной комнате.
  2. Время перерыва изображений интернализации дефенсина MtDef5
    1. Пипетка 50 мкл N. густая и F. graminearum конидиальная подвески (105 конидий/мл) в микрорезервуар 10 мм в 35 мм стекла дно микрорезервуар блюд. 10 мм микрорезервуар немелованной и имеет Стекло покровное № 1,5 на дне. Для наблюдения за конидий непосредственно перейти к следующему шагу. Для наблюдения за germlings Инкубируйте конидий для 3-6 ч при комнатной температуре, прежде чем с помощью микроскопии.
    2. Включите В.Л.Л. Выберите линию лазера на 550 Нм для возбуждения Флюорофор меченых дефензинов используется здесь (шаг 1.3) и FM4-64 с 1.00% интенсивности и активировать соответствующий детекторов. Флюорофор меченых дефензинов используется здесь (шаг 1.3) был обнаружен на 560-600 Нм и FM4-64dye был обнаружен на 690-800 Нм.
      Примечание: Используйте низкий лазерной интенсивности для живых клеток изображений как лазер высокой интенсивности может привести к повреждению живой грибковых клеток.
    3. Установите блюдо микрорезервуар на микроскопе. Найти ячейки, используя 10 x целей первоначально, а затем переключиться на 100 x / 1,44 нефти цель увеличение.
      Примечание: Для xyzt (комбинация Z-стек и time-lapse режимов), установить режим сканирования Z положение, масштаб, частоту захвата изображений и т.д.
Прежде чем приступить к следующему шагу.
  • 50 мкл Флюорофор меченых дефензинов используется здесь (шаг 1.3) о на MIC 3 мкм и 2 мкл мембраны селективного окрашивания FM4-64 (конечная концентрация 5 мкм) к каждому блюду микрорезервуар и начать покадровой изображений. Место мелкие кусочки мокрый фильтр документов в микрорезервуар блюда для предотвращения испарения. Частоту захвата изображений было 3 мин 30 s и общий период было 2 ч 30 мин.
    Примечание: Добавление дефенсина и Флюорофор после монтажа микрорезервуар блюдо в Микроскоп можно расфокусировать области интереса. Таким образом после добавления микрорезервуар дефенсина и Флюорофор, регион интереса необходимо переориентировать который может вызвать задержку загрузки изображений.
  • Используйте Конфокальный микроскоп для всех конфокальная томография и осуществляют микроскопии в темном помещении при комнатной температуре.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    Живой клетки изображений было проведено, чтобы отслеживать и сравнивать интернализации и внутриклеточных локализации двух дефензинов, MtDef4 и MtDef5, от Люцерна truncatula; в грибковых клеток. TMR-MtDef4 химически был синтезирован в то время как MtDef5 был назван с Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Конидий инкубировали с либо дефенсина в сочетании с мембраны селективного окрашивания FM4-64. Рисунок 1 показывает, что ПМР-MtDef4 имеет различные пути тор...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    В этом исследовании надежный клеток изображений методологии с использованием дневно обозначенные противогрибковые дефензинов был описан для изучения кинетики интернализации этих пептидов в грибные клетки и определить их субцеллюлярные целей. Этот метод является мощным инструментом для визуализации динамики взаимодействия между дефензинов и грибковых клеток во времени и пространстве.

    Различные методы были использованы для изучения интернализации и внутриклеточной локализации растений дефензинов...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    Авторы не имеют ничего сообщать.

    Благодарности

    Мы благодарим д-р р. Говард Берг, директор механизма комплексной микроскопии в Дональд Данфорт завод научный центр, за его руководство и помочь с confocal микроскопии. Авторы имеют никакого конфликта интересов объявить.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    FM4-64 КрасительLife TechnologiesT13320
    DyLight 550 Набор для мечения антителThermo Scientific84530
    Стеклянное дно Посуда для микролунокTeKP35G-1.5-10-C
    Ткань Mira EMDMillipore Corp475855-1R
    SP8-XLeica
    ImageJFiJiДля анализа изображений
    Программное обеспечение ImarisBitplaneДля анализа изображений
    программное обеспечение

    Ссылки

    1. Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
    2. Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
    3. Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides. Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).
    4. Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. Plant defensins: Common fold, multiple functions. Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).
    5. De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides. Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).
    6. Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants? Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).
    7. Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production. Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).
    8. Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications. ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).
    9. Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics. Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).
    10. Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins. Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).
    11. Aerts, A. M., François, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).
    12. Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae. J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).
    13. Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle. Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).
    14. El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum. Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).
    15. Baxter, A. A., et al. The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis. Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).
    16. Kvansakul, M., et al. Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization. Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).
    17. Poon, I. K. H., et al. Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis. eLife. 3, e01808(2014).
    18. Muñoz, A., Read, N. D. Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action. Front. Immunol. 3, 248(2012).
    19. Hayes, B. M. E., et al. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans. Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).
    20. Muñoz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26. Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).
    21. Eaton, C. J., et al. The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through Gα proteins in Neurospora crassa. PLoS One. 7 (10), e48026(2012).
    22. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium. laboratory manual. , Blackwell Professional. Ames, IA, USA. (2006).
    23. Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).
    24. Sagaram, U. S., et al. Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry. PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).
    25. Uchida, M., et al. Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).
    26. Nair, R., et al. Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information. Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).
    27. Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. Refining protein subcellular localization. PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66(2005).
    28. Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging. Sci. Rep. 7, 43542(2017).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Больше статей

    Конфокальная микроскопияспособ проникновенияфлуоресцентное мечениетаймлапс-визуализациякраситель FM4-64противогрибковая активность
    Жить клеточной изображений грибковых клеток расследовать режимы записи и внутриклеточных локализации дефензинов противогрибковые завод
    Связаться с нами
    Порекомендовать библиотеке

    Конфиденциальность

    Условия использования

    Политики

    © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.