Количественная оценка полученных доноров клеток требуется контролировать приживления после трансплантации стволовых клеток у пациентов с hemoglobinopathies. Сочетание сортировки потока на основе цитометрии клеток, колонии формирования assay и последующий анализ короткие тандемные повторы могут быть использованы для оценки масштабов распространения и дифференциации прародителей в отсеке эритроидные.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В значительной части пациентов после трансплантации костного мозга для талассемии основных или серповидно-клеточной анемии отмечается наличие неполной химеризма. Это замечание имеет огромные последствия, поскольку последующие терапевтических иммуномодуляция стратегии может улучшить клинические исходы. Условно полимеразная цепная реакция-анализ короткие тандемные повторы используется для идентификации химеризма в клетках крови доноров производные. Однако этот метод ограничен ядерных клеток и не могут различать между диссоциированных одноклеточных линий. Мы прикладной анализ короткие тандемные повторы течь гранулярных сортировка гемопоэтических предшественников клетки и сравнить это с анализом короткие тандемные повторы, полученные из выбранных взрыв формирование подразделения - эритроидных колоний, оба собранные из костей костного мозга. С помощью этого метода мы в состоянии продемонстрировать различные пролиферации и дифференцировки клеток донора в отсеке эритроидные. Эта техника имеет право завершить текущий мониторинг химеризма в трансплантации стволовых клеток Установка и таким образом может быть прикладной в будущем клинических исследований, исследования стволовых клеток и дизайн испытаний генной терапии.
Введение
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является доступны только лечебный подход для различных врожденные генетические заболевания кроветворной системы, достижения безрецидивной выживаемости более чем 90% иначе сильно скомпрометирован и жизнь ограниченной пациентов1. Эффективность этого важного инструмента терапевтических оптимизирована путем ограничения токсичности пред- и после трансплантации схемы2, но также на мероприятия, направленные на поддержание стабильных трансплантата функция, которая количественно путем тщательного наблюдения за клетки донора производным3....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. изоляции кроветворных клеток костного мозга путем активации Многопараметрический флуоресценции сортировки клеток
- образец пятная
- перед началом процесса, следующие пункты должны быть собраны и готовы:
- градиент СМИ для подготовки мононуклеарных клеток (GM), 50 мл конические трубы
- 12 x 75 мм Расходомерные трубки для окрашивания клеток
- окрашивания буфера: фосфат буфер солевой раствор (PBS) + 3% плода телячьей сыворотки (FCS)
- пипетки < / л я >
- ФК блока и Пятнать антитела (CD34 APC, бионауки CD36 FITC, CD45 V450, BD). С этой комбинации флюрохром существует незначительное распространение в другие ка....
- перед началом процесса, следующие пункты должны быть собраны и готовы:
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Разделение lymphohematopoietic прародителями путем сортировки клеток СУИМ
Мы здесь продемонстрировать результаты от сортировки необходимые клеточных популяций течению STR анализа. Клетки костного мозга окрашивали конъюгированных V450 анти CD45, FITC-конъюгированных анти CD36 и APC-конъюгированных анти CD34. Численность населения интерес является мегакариоцитов эритроидные предшественники (MEP), тому клетки, отве.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Целью настоящего исследования является предоставить аудитории сочетание двух подходов для анализа химеризма доноров/получателей помощи в эритроидные предшественники после ТГСК больных лечение hemoglobinopathies: 1.) сортировки активирован флуоресценции клеток прародитель гемопоэтических клеток в образцах костного следуют анализ короткие тандемные повторы и 2.) Колония формирование подразделения выращивания клеток костного мозга, классификация колоний в различных типах прародитель следуют анализ короткие тандемные повторы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана Regenbogen подчиняется Kinderkrebshilfe.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Удалить эритроциты |
| 50 мл конические пробирки | Falcon | 14-432-22 | Пробоподготовка |
| 12 x 75 мм проточные пробирки | Falcon | 352002 | FACS сортировка |
| Фосфат буферный физиологический раствор | Gibco | 10010023 | PBS |
| Фетальная телячья сыворотка | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (инактивированный при нагревании) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Трипан синий | Gibco | 15250061 | |
| гемоцитометр | Invitrogen Inc. | C10227 | Автоматический подсчет ячеек |
| Ганка s Сбалансированный солевой раствор | Gibco | 14025092 | Суспензионный буфер в FACS анализе |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Компонент суспензионного буфера |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Block FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Recombinant человеческий эритропоэтин | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | ЭПО |
| «Изоков» s Модифицированный Дульбекко s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | компонент культуральной среды |
| CD34+ магнитные шарики | Milteny Biotech | 130-046-702 | CD34+ очистка |
| Рекомбинант человеческий G-CSF | Gibco | PHC2031 | КОЕ-Анализ |
| Рекомбинант человеческий SCF | Gibco | CTP2113 | КОЕ-Анализ |
| Рекомбинантный человеческий GM-CSF | Gibco | PHC2015 | КОЕ-Анализ |
| Рекомбинантный человеческий IL-3 | BD Bioscience | 554604 | КОЕ-Анализ |
| Рекомбинантный человеческий IL-6 | BD Bioscience | 550071 | КОЕ-Анализ |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | КОЕ-Анализ |
| QiAmp ДНК Набор для экстракции крови | Qiagen | 51306 | Выделение ДНК |
| Nanodrop ND-1000 спектральный фотометр | Thermo Scientific | ND 1000 | Количественная |
| оценка ДНКазы без H2O | Thermo Scientific | FEREN0521 | Препарат ДНК |
| AmplTaq Gold ДНК-полимераза | Прикладная бионаука | N8080240 | ПЦР |
| Eppendorf мастерциклер градиент | Eppendorf | 6321000019 | ПЦР |
| Hi-Di Formamid | Прикладная биология | 4311320 | ПЦР |
| GeneScan 500 ROX размер стандартный Прикладная | биология | 4310361 | ПЦР |
| 3130 Генетический анализатор | Прикладная биология | 313001R | ПЦР |
Ссылки
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
