Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56002

⸱

6 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Medical University Innsbruck, 2Department of Internal Medicine V (Hematology & Oncology), Medical University Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Department of Pediatrics, Medical University Graz

В этой статье

Краткое содержание

Количественная оценка полученных доноров клеток требуется контролировать приживления после трансплантации стволовых клеток у пациентов с hemoglobinopathies. Сочетание сортировки потока на основе цитометрии клеток, колонии формирования assay и последующий анализ короткие тандемные повторы могут быть использованы для оценки масштабов распространения и дифференциации прародителей в отсеке эритроидные.

Аннотация

В значительной части пациентов после трансплантации костного мозга для талассемии основных или серповидно-клеточной анемии отмечается наличие неполной химеризма. Это замечание имеет огромные последствия, поскольку последующие терапевтических иммуномодуляция стратегии может улучшить клинические исходы. Условно полимеразная цепная реакция-анализ короткие тандемные повторы используется для идентификации химеризма в клетках крови доноров производные. Однако этот метод ограничен ядерных клеток и не могут различать между диссоциированных одноклеточных линий. Мы прикладной анализ короткие тандемные повторы течь гранулярных сортировка гемопоэтических предшественников клетки и сравнить это с анализом короткие тандемные повторы, полученные из выбранных взрыв формирование подразделения - эритроидных колоний, оба собранные из костей костного мозга. С помощью этого метода мы в состоянии продемонстрировать различные пролиферации и дифференцировки клеток донора в отсеке эритроидные. Эта техника имеет право завершить текущий мониторинг химеризма в трансплантации стволовых клеток Установка и таким образом может быть прикладной в будущем клинических исследований, исследования стволовых клеток и дизайн испытаний генной терапии.

Введение

Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является доступны только лечебный подход для различных врожденные генетические заболевания кроветворной системы, достижения безрецидивной выживаемости более чем 90% иначе сильно скомпрометирован и жизнь ограниченной пациентов1. Эффективность этого важного инструмента терапевтических оптимизирована путем ограничения токсичности пред- и после трансплантации схемы2, но также на мероприятия, направленные на поддержание стабильных трансплантата функция, которая количественно путем тщательного наблюдения за клетки донора производным3,4,5.

В общем полный химеризма (CC) подразумевает полная замена отсека lymphohematopoietic клетками донора производные, тогда как термин смешанные химеризма (MC) используется для доноров и получателей, полученных клетки одновременно присутствуют в различных пропорции. Сплит химеризма (SC) обозначает сосуществование смешанных химеризма наблюдается в одноклеточных линий, таких как эритроидные отсека. Оперативное определение статуса химеризма ТГСК имеет решающее значение, как это может помочь определить восприимчивы рецидивов заболевания и инициировать последующих иммуномодулирующих стратегии, такие как доноров лимфоцитов инфузии или сокращение иммунодепрессивных больных 6лечения.

Несколько методов были разработаны для мониторинга приживления после ТГСК. Isotyping иммуноглобулины и анализ цитогенетика имеют плохое чувствительность и ограничены в их способность обнаруживать полиморфизм,78. Введения флуоресцентных в situ гибридизация (рыба) может повысить чувствительность в химеризма мониторинга после ТГСК, но ограничивается секс несоответствие аллотрансплантантов9. В настоящее время является наиболее распространенным методом, используемым для обнаружения химеризма полимеразной цепной реакции (ПЦР) и основывается на электрофорез геля агарозы обычных-акриламид переменное число повторов тандем (VNTRs) или короткие тандемные повторы (СПО). Обычно используются количественного PCR способен обнаружить крайне небольшая доля остаточных доноров клеток после ТГСК. Основным ограничением исследований пока, что MC обнаружения ограничивается почти исключительно наличием ядерных клеток, а не зрелых эритроцитов, а именно клеток, что являются функционально важно для пациентов, пострадавших от hemoglobinopathies. У больных с различными группами крови стоит вспомнить, что cytofluorometric анализ способен идентифицировать химеризма в красных кровяных клетках путем использования моноклональных антител к антигенам эритроцитов ABO и C, c, D, E и e-10 , 11. разные, но очень интересные средства оценки химеризма эритроидные линии является сочетание потока гранулярных сортировки эритроидные предшественники и выбор различных типов эритроидные предшественники путем культивирования в колониеобразования анализов, После анализа12ул. Этот подход имеет возможность количественно относительные пропорции химеризма доноров и получателей помощи в отсеке эритроидные и могут быть использованы в стратегии для поддержания костного трансплантата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. изоляции кроветворных клеток костного мозга путем активации Многопараметрический флуоресценции сортировки клеток

  1. образец пятная
    1. перед началом процесса, следующие пункты должны быть собраны и готовы:
      1. градиент СМИ для подготовки мононуклеарных клеток (GM), 50 мл конические трубы
      2. 12 x 75 мм Расходомерные трубки для окрашивания клеток
      3. окрашивания буфера: фосфат буфер солевой раствор (PBS) + 3% плода телячьей сыворотки (FCS)
      4. пипетки < / л я >
      5. ФК блока и Пятнать антитела (CD34 APC, бионауки CD36 FITC, CD45 V450, BD). С этой комбинации флюрохром существует незначительное распространение в другие каналы, но также возможен любой другой комбинации подходят флюрохром.
      6. Бисер компенсации (при необходимости)
      7. Подвеска буфера: Хэнк ' s сбалансированной соли раствора (HBSS) + 25 мм HEPES + 3% FCS
      8. Трипановый синий и Горяева
      9. Коллекции трубок: любой богатой среде с высоким сыворотки трубы (содержащие 1 мл FCS + 25 мм HEPES) могут быть использованы для коллекции сортировки клеток.
        10. Образец
      10. костного мозга: обычно требуется осознанное согласие для биопсии костного мозга от подвздошной кости задней бедренной кости. В образце костного мозга является чем хранится в гепаринизированным шприцы на RT до окрашивания. В соответствии с руководящими принципами института выполняются следующие шаги протокол ' Комитет по этике исследований человеческого s для благополучия человека.
    2. Генерировать одну ячейку подвеска образца костного мозга. Добавьте 3 мл GM для пластиковых пробирок. Тщательно слой 4 мл суспензии одну ячейку на ГМ решения. Центрифуга на 550 г за 30 мин при 20 ° c (C) (тормоз выключен). Розыгрыш верхний слой, содержащий плазмы и тромбоцитов с использованием стерильной пипеткой, оставляя нетронутыми слоя мононуклеарных клеток на интерфейс. Трансфер слой мононуклеарных клеток в стерильных пластиковых пробирок с помощью стерильной пипеткой.
    3. После мытья с 5 мл, окрашивание буфера, Ресуспензируйте клетки в буфере 2 мл подвеска и определения концентрации клеток. Место 5 мкл суспензии клеток в пробирке колпачок. 95 мкл 0,2% Трипановый синий пятно. Тщательно перемешать. Дать постоять 5 мин при комнатной температуре. Заполните Горяева для подсчета клеток. Под микроскопом, наблюдать если нежизнеспособных запятнаны и количество жизнеспособных клеток.
    4. Центрифуга клетки на 250 g 10 мин при 20 ° C, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в пятнать буфера в концентрации до 1 x 10-6 на 100 мкл.
    5. FcR блока с использованием 2,5 мкг ФК блок на 1 x 10 6 клеток на льду на 10-15 мин
    6. Добавить соответствующую комбинацию 10 мкг МАБ пятно 1 х 10 6 клеток и проинкубируйте втечение 20 мин при температуре 4 ° C в темноте, последовал шаг Стиральная с 3 мл, окрашивание буфера. Для правильного компенсации небольшие аликвоты клетки (или предпочтительно компенсации бусины) витражи с одного антитела один Алиготе, оставаясь неокрашенных.
    7. Регулировка концентрации до 20 х 10 6 клеток/мл.
    8. Набор вверх и оптимизировать сортировщик ячейки. Процесс создания проточный цитометр и программное обеспечение является стандартным с подробной инструкцией, предоставляемые компанией и должна быть выполнена надлежащим образом подготовленным персоналом.
  2. Сортировка в сортировщике клетки
    1. подготовить коллекции трубок от шага 1.1.1.9.
    2. Шаблон, который включает двумерных сюжет для отображения точечной вперед (FSC) и стороны точечной (SSC).
    3. Запустите клетки и отрегулировать FSC/SSC для размещения населения интерес по шкале
    4. Запись негативного контроля труб.
    5. Запустить один положительный контроль труб; записи данных для каждой трубы.
    6. Расчета компенсации вручную или автоматически с помощью функции, предоставляемые приобретение программного обеспечения.
    7. Приобретают экспериментальный образец и ворота их на двумерных участке точка FSC/SSC ( Рисунок 1A) включить лимфобластный и миелобластный клетки. Исключить Дуплеты и агрегатов, сравнивая различные сигналы FSC (т.е., высота, ширина и район) ( рис. 1B). Визуализировать синглетно клетки на участке двумерных точка отображения CD45 и CD36 ( рис. 1 c). События позитивные для CD45 лейкоцитов (включая их предшественники), те негативные для CD45 позитивные для CD36 эритроидные предшественники. Использование стробирования инструменты для определения CD36 + (при желании, эти клетки могут быть далее разделены на CD36 высокой и низкой выражая клеток) и CD45 + клеток. Визуализируйте CD45 + события в другой участок точка, отображение параметров CD34 и SSC. Использование стробирования инструменты для определения CD34 + клеток (прародителями лейкоцитов) и SSC высокий (клетки миелоидного на различных стадиях дифференцировки).
    8. После того, как были определены ворота, ворота могут быть выбраны для сортировки во внешней коллекции трубок.
    9. Продолжить с сортировкой при 4 ° C, пока не было получено необходимое количество клеток
    10. Анализ после сортировки, чтобы определить чистоту отсортированных клеточных популяций ( Рисунок 1E, 1F).

2. Колониеобразования Assay

  1. Подготовка реагентов
    перед началом процесса, следующие пункты должны быть собраны и подготовлены:
    1. пипетки, 100 мм пластин
    2. Трипановый синий и Горяева
    3. воссоздания человеческого рекомбинантного эритропоэтина (ЭП) на 500 ед/мл в стерильных PBS, содержащий менее 0,1% человеческого сывороточного альбумина. Разделить это решение на небольших аликвоты и держать на 20 ° C до избегать повторного замораживания оттаивания.
    4. Подготовить полный Iscove ' s Modified Дульбекко ' s среднего (IMDM) с окончательной концентрации 5% FCS, 2 мм глутамина, 100 единиц/мл пенициллина/стрептомицина (PS). Добавить человеческого рекомбинантного эритропоэтина (ЭП) в различных концентрациях в отдельных скважинах для полного среднего IMDM: 3 единицы ЕПВ/Ну, 6 единиц ЕПВ/Ну и 12 ЕПВ единиц/хорошо (1 x, 2 x, 4 x EPO соответственно).
  2. Подготовка клетки костного мозга
    1. 10 мл образца костного мозга, разбавленным с 20 мл PBS медленно поверх градиента средне плотность 15 мл в 50 мл Конические трубки, поддержание понятный интерфейс между двумя этапами и вы nder стерильные условия. Затем центрифуга 15 мл конические трубы на 550 x г за 30 мин при комнатной температуре (RT) с качестве 9 ускорение и замедление 0 (или тормоз OFF).
    2. После центрифугирования, удалите интерфейс в новой 50 мл трубки и добавьте PBS в окончательный объем 50 мл.
    3. После центрифугирования с 250 г за 10 мин при 10 ° C удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в полной IMDM среде приблизительно 0,5 x 10 6 клеток/мл. Учитывать Микропробирка 10 мкл суспензии клеток, смешать с такой же объем раствора Трипановый синий (0,4%) и рассчитывать, с помощью Горяева.
    4. Oфакультативные: CD34 + клетки обогащены магнитные ячейку Сортировка с бисером Milteny CD34 согласно инструкциям производителя. Основным преимуществом этого шага обогащения является обнаружить качество гемопоэтических стволовых клеток, которые выращиваются на матрицу полутвердых добавил с 50 нг/мл стволовых клеток фактора (SCF), 20 нг/мл 20 нг/мл гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), Интерлейкин-3 (IL-3), 20 нг/мл интерлейкина-6 (IL-6), 20 нг/мл гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) и 3 различных концентраций ЭП как 1.4.
    5. Развести клетки 0,1 - 0,15 x 10 6 мононуклеарных клеток/мл или 2 x 10 3 CD34 + клеток/мл, добавив полного среднего IMDM дополнены с ЕПВ и передачи 300 мкл до 3 мл средний Methocult H4434. После того, как возбуждение и короткий инкубационный 5 мин пластины три раза 1,1 мл на блюде 35 мм. Два из этих блюд культуры вместе с третьей - с водой - помещаются в 100 мм пластин.
    6. Клетки являются культивировали в инкубаторе увлажненные 37 ° C с 5% CO 2 на 14 дней.
  3. Анализ колоний
    1. колоний оцениваются согласно их морфология с инвертированным микроскопом на 40 кратном в культуре блюдо, отмеченные с сеткой скоринга. Для целей нашего анализа, формируя единиц колонии (CFU) делятся на 4 категории: multipotential прогениторных клеток (CFU-ГЭММ), гранулоцитарно макрофагального Прародителя (CFU-GM), взрыв формовочный блок эритроидные (BFU-E) и образуя колонии единица эритроидные (CFU-E). Смотреть производитель ' s инструкции для дальнейших колонии подклассификацию.
    2. Для дальнейшего анализа, клетки от пластины пробирного CFU восстанавливаются отдельно согласно 4 категории, приостановив в 4 мл комнатной температуре PBS, содержащий 2% FCS/IMDM. После центрифугирования в 400 г за 10 мин при температуре 4 ° C, клетки высокомобильна в PBS, подсчет и обрабатываются для экстракции ДНК.

3. Анализ химеризма

  1. ДНК изоляции
      ,
    1. Пелле клетки центрифугированием на 400 г за 10 мин.
    2. Изоляции ДНК с помощью крови ДНК извлечения (комплект QIAmp ДНК крови извлечения). Предварительно теплой Элюирующий буфер (AE) при 37 ° C для повышения урожайности eluted дна.
    3. Измерения концентрации ДНК с Nanodrop ND-1000 спектров фотометра. Для дальнейшего анализа используются образцы с ОД 260/280 между 1.8-2.0.
    4. Развести ДНК с DNAase бесплатно H 2 O до 0,1 нг/мкл в суммарный объем 50 мкл.
  2. STR-анализ
    1. Настройка реакции PCR, смешивая реакции Mix, золото AmplTaq ДНК-полимеразы и профилировщик плюс грунт с 20 мкл геномной ДНК (0.1 нг/мкл) в соответствии с руководством (грунтовка комплект содержит немеченого грунтовки в буфере для того чтобы усилить STR-локусов D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317 и D7S820 и amelogenin маркер гендерного). Включать нуклеиназы свободной воды как отрицательный контроль и 9947A как позитивный элемент управления. До пересадки ДНК от доноров и получателей, также включены.
    2. Реакции PCR, выполняют с помощью Eppendorf mastercycler градиент с соблюдением следующих условий: 95 ° C 11 мин, 28 усиления циклов 95 ° c за 1 мин., 59 ° C за 1 мин и 72 ° C в течение 1 мин, после чего 60° C на 45 мин
    3. Набор вверх фрагмент анализа реакции путем добавления 12 мкл Hi-ди Formamid и 0,5 мкл GeneScan 500 ROX размер стандартный (все применяемые биосистем) в 1 мкл ПЦР продукта. На первый и последний координата необходима аллельные лестница (Genotyper Amp Fl STR синий, II зеленый и желтый, применяется биосистем).
    4. Начать электрофореза и приобретение с помощью инструмента электрофорез.
    5. Анализ локусов, аллелей и высоты пика образцов и контроль программного обеспечения 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Разделение lymphohematopoietic прародителями путем сортировки клеток СУИМ

Мы здесь продемонстрировать результаты от сортировки необходимые клеточных популяций течению STR анализа. Клетки костного мозга окрашивали конъюгированных V450 анти CD45, FITC-конъюгированных анти CD36 и APC-конъюгированных анти CD34. Численность населения интерес является мегакариоцитов эритроидные предшественники (MEP), тому клетки, отве...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Целью настоящего исследования является предоставить аудитории сочетание двух подходов для анализа химеризма доноров/получателей помощи в эритроидные предшественники после ТГСК больных лечение hemoglobinopathies: 1.) сортировки активирован флуоресценции клеток прародитель гемопоэтических клеток в образцах костного следуют анализ короткие тандемные повторы и 2.) Колония формирование подразделения выращивания клеток костного мозга, классификация колоний в различных типах прародитель следуют анализ короткие тандемные повторы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Regenbogen подчиняется Kinderkrebshilfe.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ficoll-PaqueGE HealthcareGE17-1440-02 Удалить эритроциты
50 мл конические пробиркиFalcon14-432-22Пробоподготовка
12 x 75 мм проточные пробиркиFalcon352002FACS сортировка
Фосфат буферный физиологический растворGibco10010023PBS
Фетальная телячья сывороткаInvitrogen Inc.16000-044FCS (инактивированный при нагревании)
CD34 APCBD Bioscience561209FACS-Ab
CD36 FITCBD Bioscience555454FACS-Ab
CD45 V450BD Bioscience642275FACS-Ab
Трипан синийGibco15250061
гемоцитометрInvitrogen Inc.C10227Автоматический подсчет ячеек
Ганка s Сбалансированный солевой растворGibco14025092Суспензионный буфер в FACS анализе
HEPESGibco15630080Компонент суспензионного буфера
FcRBD Bioscience564220Block FCR
FACS Aria IBD Bioscience23-11539-00FACS Sorter
Recombinant  человеческий эритропоэтинAffimetrix eBioscience14-8992-80ЭПО
«Изоков» s Модифицированный Дульбекко s MediumGibco12440053IMDM
L-glutamineInvitrogen25030-081компонент культуральной среды
CD34+ магнитные шарикиMilteny Biotech130-046-702CD34+ очистка
Рекомбинант  человеческий G-CSFGibcoPHC2031КОЕ-Анализ
Рекомбинант  человеческий SCFGibcoCTP2113КОЕ-Анализ
Рекомбинантный  человеческий GM-CSFGibcoPHC2015КОЕ-Анализ
Рекомбинантный  человеческий IL-3BD Bioscience554604КОЕ-Анализ
Рекомбинантный  человеческий IL-6BD Bioscience550071КОЕ-Анализ
Methocult H4434 MediumStemcell Technologies4444КОЕ-Анализ
QiAmp ДНК Набор для экстракции кровиQiagen51306Выделение ДНК
Nanodrop ND-1000 спектральный фотометрThermo ScientificND 1000Количественная
оценка ДНКазы без H2OThermo ScientificFEREN0521Препарат ДНК
AmplTaq Gold ДНК-полимеразаПрикладная бионаукаN8080240ПЦР
Eppendorf мастерциклер градиентEppendorf6321000019ПЦР 
Hi-Di FormamidПрикладная биология4311320ПЦР
GeneScan 500 ROX размер стандартный Прикладнаябиология4310361ПЦР
3130 Генетический анализаторПрикладная биология313001RПЦР

Ссылки

  1. Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
  2. Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia. Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825(2012).
  3. Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance. Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).
  4. Andreani, M., et al. Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia. Blood. 87, 3494-3499 (1996).
  5. Andreani, M., et al. Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).
  6. Kumar, A. J., et al. Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).
  7. Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow. Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).
  8. McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation. Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).
  9. Dewald, G., et al. A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes. Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).
  10. Andreani, M., et al. Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease. Haematologica. 96, 128-133 (2011).
  11. Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies. Chimerism. 2, 21-22 (2011).
  12. Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major. Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).
  13. Kimpton, C. P., et al. Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci. PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).
  14. Centis, F., et al. The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major. Blood. 96, 3624-3629 (2000).
  15. Miccio, A., et al. In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Сортировка клеток методом проточной цитометриианализ коротких тандемных повторовмононуклеарные клетки костного мозгаанализ колониеобразующих единицгейтирование клеток CD36 CD45экстракция ДНК и ПЦР-анализметод мониторинга химеризмаприживление трансплантата у пациентов с гемоглобинопатией
Определение остаточного доноров эритроидных клеток-предшественников после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у пациентов с Hemoglobinopathies
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.