Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Искусственного кровообращения в мышиной модели: новый подход

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56017

⸱

22 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiothoracic, Transplantation, and Vascular Surgery, Hannover Medical School, 2Department of Hematology, Oncology, Immunology, Rheumatology, and Pulmonology, University Hospital Tuebingen, 3Department of Pneumology, Hannover Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот документ описывает, как выполнять искусственного кровообращения у мышей. Эта новая модель будет способствовать изучение молекулярных механизмов, занимающихся повреждения органов.

Аннотация

Как длительное искусственного кровообращения становится более важным во время кардиологических вмешательств, клинических спрос возникает для оптимизации процедуры и минимизации орган ущерба в результате длительного экстракорпоральной циркуляции. Целью этой статьи было продемонстрировать полностью функциональной и клинически значимых модель искусственного кровообращения в мыши. Мы сообщаем о дизайн устройства, оптимизация цепи перфузии и микрохирургической техники. Эта модель является острый модель, которая не совместима с выживания вследствие необходимости для нескольких рисунков крови. Из-за ряда инструментов, доступных для мышей (например, маркеры, нокауты и т.д.) Эта модель будет способствовать расследование молекулярные механизмы повреждения органов и эффект искусственного кровообращения по отношению к другой сопутствующих заболеваний.

Введение

С момента введения искусственного кровообращения (КПБ) в клинике она сыграла важную роль в хирургии сердца1. В современной кардиохирургии длительное время КПБ имеет важное значение для выполнения обширной реконструкции аорты и комбинированных процедур. Хотя технологические достижения были огромны, использования экстракорпоральной циркуляции связан с интра - и послеоперационной системных и местный орган ущерб2,3.

Крупные животные модели были разработаны для расследования роли КПБ на физиологические процессы в4,5. Хотя эти модели представление о некоторых из КПБ ассоциированных осложнений, они являются очень дорогостоящими и молекулярных инструменты (например, антитела) весьма ограничены. Была разработана более экономичную альтернативу в мелких животных. После их разработки оптимизировать модель КПБ в крыс и кроликов5,6,,78,9были проведены многочисленные исследования. Эти модели обеспечивают хорошую основу для измерения процессов патофизиологические болезни; Однако они все еще недостаточны для расследования гуморального и клеточного иммунологии из-за отсутствия соответствующих антител и реагенты. Это ухудшает их роль в этой области исследований.

Мы недавно разработали модель мыши КПБ. Благодаря широкому выбору мыши специфические реагенты и генетически модифицированные мыши мыши модели являются в целом модель выбора для физиологических, молекулярной и иммунологических исследований10,11. Таким образом наша модель будет способствовать изучению КПБ в отношении различных сопутствующих заболеваний, как есть много мышей штаммов с клинически значимых заболеваний12,13. Соответственно этот документ описывает, в деталях, как выполнять КПБ в мышах. После глубокого дыхания и кровообращения ареста внимательно следить за кислорода и гемодинамики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецкого закона о защите животных (TierSchG) и были утверждены Комитетом местных животных (Нижняя Саксония государственное управление по защите прав потребителей и безопасность пищевых продуктов, протокол TSA 14/1556). Минимальный вес мыши подходит для этой модели — 25 г.

1. предоперационная подготовка

Примечание: все процедуры осуществляются в чистой, не стерильных условиях, газобетона инструментами.

  1. Место 50-60 8-cm длинный пропилена полых волокон параллельно в трубку и связаться с Т-адаптер с обеих сторон. Заполнить пространство между полых волокон и внешние отделение Т-адаптер с клеем.
    1. Разрешить по крайней мере 24 часа для клея для упрочнения. Вырезать полые волокна, которая выходит из Т-адаптер, используя стандартный микротом и натяните силиконовые трубки для соединения сайтов.
  2. Вставьте 2 Fr полиуретановые канюля металла иглу 27 G (от 26G branule). Используйте хирургическое лезвие и микро ножницы под микроскопом (8-12 крат) сделать три-четыре ярусе около 0,15 см каждый в дистальной трети канюля для обеспечения оптимального венозного возврата потока.
    1. Удалить провод после завершения. Используйте ватные тампоны для тупых диссекции и Ретракция структур. Использовать марлевые тампоны (5 x 5 см 2) чтобы впитывать лишнюю жидкость для предотвращения обезвоживания тканей.
  3. Подготовить грунтование тома. Для завершения добавьте 30 ед гепарина мл грунтовка решения и 2,5% v/v 8,4% раствора NaHCO 3 для буферизации. Хранить это решение на 4 ° C до тех пор, пока используется.
  4. Заполнить цепи КПБ (т.е., насос, воздушный охотник, труб и оба канюли) раствором 850 мкл грунтование через венозный катетер. После того, как заполнены, держать циркулирующих КПБ, пока животное не готова для катетеризации.

2. Животных анестезии

  1. для администрирования анестезии, поместите животное в камеру всасывание под 2,5% v/v изофлюрановая/кислородная смесь. Подтвердите надлежащее анестезии путем оценки педали вывода рефлекс, хвост щепотку рефлекс и рефлекс глаз мерцания. Применять мазь ветеринарных глаз избежать сухости глаз.
  2. Место животное на потепление площадку с функцией регулирования температуры. Измерение температуры тела с зонд вставляется ректально и подключены к системе сбора данных.
  3. После достижения полной анестезии, интубировать животных orotracheally с использованием пластиковых braunule 20G, вставив его устно и вставив его в трахею под визуальным контролем. Начала искусственной вентиляции легких с помощью изофлюрановая испарителем, подключенных к мыши вентилятора. В зависимости от веса животного, отрегулируйте вентиляции, таким образом, чтобы достичь дыхательный объем 250-350 мкл.
  4. Для обеспечения полной анестезии, вводить подкожно 5 мг/кг массы тела животных carprofen. Рекомендуется, что концентрация изофлюрановая храниться между 1,3-2,5% кислорода. Изофлюрановая концентрация вручную может корректироваться в зависимости от стадии процедуры.

3. Хирургические процедуры

  1. после того, как достигается полная анестезия и интубации, выполняют Кожный разрез средней линии шеи с тонкой ножницами, отдельных мышц в тупой моды и подвергать право яремной вены и левой сонной артерии. Во время подготовки, коагулировать малых судов с использованием ветеринарных коагулятор, подключенных к биполярный пинцет для обеспечения минимальной кровопотерей.
  2. После подготовки шейных сосудов, краниально перевязать Дистальный сегмент левую общую сонную артерию на его развертывание с использованием шелковых нитей 8-0.
  3. Подключение, дистальный конец канюли 27 G приток артериальной трубок с помощью силиконового соединителя (ID 0,5 мм, 1 мм OD), место 8-0 Шелковый шов скольжения узлов в проксимальном сегменте артерии и вставить кончик канюли в сонной артерии.
  4. После правильного размещения кончика канюля, заранее кончик канюля, так, что она откладывает 3-4 мм проксимально аорты. Исправить кончик канюля путем обеспечения с шелковой узлов 8-0.
  5. Использование микрохирургических щипцы и ножницы, выполняют тупые и острые рассечение, подвергать право яремной тупым подготовка ткани боков к ключично мышцы, недалеко от ключицы и место 8-0 шелк узел на дистальном конце и 8-0 цикла в проксимальном конце.
  6. После перевязки дистального конца яремной вены, поместите кончик венозная канюля в правой яремной вены и прогресс в направлении правого предсердия и secure с использованием шелковой узел. Для оптимального венозный возврат, это может быть необходимо заранее венозной кончика в правый желудочек.
  7. Как только достигается правильным канюля позиции, выполнять системные Гепаринизация путем добавления 2,5 МЕ гепарина на грамм веса животных через прямой внутривенные инъекции в яремной.
  8. Для мониторинга в реальном времени инвазивного давления, иглу левой бедренной артерии. Подвергать паховой области и аккуратно отделить общие бедренной артерии от бедренной вены и бедренного нерва под 25 крат.
    1. Ligate дистальной частью бедренной артерии. Временно загородить проксимальной части с скольжения узел и сделать небольшой надрез на передней стенке с помощью микро пинцет.
    2. После этого, вставьте 1 Полиуретановые канюля Fr в бедренной артерии и закрепите его с шелком шва 10-0. Этот катетер используется для извлечения образцов крови для анализа газов крови.
  9. После успешного размещения артериальной и венозной канюли, инициировать искусственного кровообращения, повернув на насосе. Время от интубации начиная КПБ является примерно 45 мин начать использовать скорость потока 0,5 мл/мин, в зависимости от системных давления измерения и увеличение потока крови в течение 2 мин до полного потока (4-6 мл/мин), увеличивая скорость насоса.
  10. Под полный контроль, выполняют верхняя стернотомия, с помощью острых ножниц, начиная от рукоятка и собирается 5 мм в хвостовой направлении. Коагулировать края грудины немедленно, чтобы избежать кровотечения. Разоблачить аорты, потянув правой сонной артерии в направлении черепной.
  11. Для оптимального управления, окружности бесплатно аорты из вилочковой железы и окружающих тканей для облегчения зажима. Место 8-0 шелковые петли вокруг восходящей части аорты. Чтобы поставить крест зажим для Кардиоплегия, тянуть шелковые петли в черепной направлении лучше выставить восходящей части аорты.

4. Искусственного кровообращения и анализ газа крови

  1. для анализа газов крови (BGA), использовать стеклянные капиллярные трубки для сбора 60-90 мкл артериальной крови через катетер бедренной артерии.
    1. Использовать струбциной маленький на Силиконовая трубка и отсоедините трубку от катетера. Сбросьте давление медленно на зажим, чтобы разрешить контролируемое заполнение капиллярной трубки.
    2. Прикрепить силиконовые трубки катетера. Вставьте капиллярной трубки в крови газоанализатор для измерения в следующее время:
      10 мин после начала КПБ с вентиляцией (BGA1)
      после 25 мин КПБ и 15 минут дыхания (BGA2)
      после 40 мин КПБ и 30 минут остановка дыхания (BGA3)
      после 55 мин КПБ, 45 мин респираторных и 20 мин остановки сердца (BGA4)
  2. под стабильным потоком КПБ, инициатива TE дыхания, остановив вентиляции.
  3. После окончания вентиляции, установите потепление площадку до 28 ° c и начать местно охлаждения животного до 28 ° c температуры тела в течение первых 20 минут дыхания с помощью Марли, смоченной в холодной соленой.
  4. После достижения температуры тела 28 ºС и после всего 30 минут остановка дыхания, администрировать 0,3 мл раствора KCl 7,45% в контуре КПБ инициировать Кардиоплегия.
  5. Для крест пережатие аорты, потяните ранее размещенных шелковые петли (шаг 3.10) в черепной направлении для лучшего воздействия и поместите зажим микро serrefine на восходящей части аорты.
  6. Выполнить в общей сложности 60 мин остановка дыхания и сердца 30 мин. Выньте зажим микро serrefine из восходящей части аорты инициировать реперфузии сердца. Одновременно, повторно проветривать и теплые животных до 37 ° C.
  7. После завершения реперфузии и животное достиг normothermia, прекратить КПБ, отключив насос и продолжать следить за физиологических измерений (например температуры тела, ЭКГ и инвазивных артериальное давление) 20 мин
  8. В конце эксперимента, exsanguinate животное под полным наркозом (5% изофлюрановая) и собирать кровь и органы для дальнейшего анализа 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол описывает перфузии цепи, хирургических процедур и мониторинга физиологических параметров во время КПБ мыши. При исполнении адекватно квалифицированных микрохирург, последовательно и можно воспроизвести результаты.

Для поддержания адекватного ткани перфузии, среднее артериальное давление всегда находится между 40 и 60 мм рт.ст, регулируя поток крови КПБ и добавление дополнительных тома. В зависимости от веса животно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы разработали полностью функционирующей клинически значимых модель КПБ в мыши. С более чем тридцатью штаммов мышей, имеющих сердечно-сосудистые заболевания наша модель может быть отправной точкой для разработки новых перспективных протоколов, связанных с КПБ. Кроме того из-за множества мыши специфические реагенты и нокаут из мышей, эта модель может не только заменить текущий крысы модель КПБ но облегчит рассечение молекулярных механизмов, участвующих в повреждения органов, связанных с КПБ. На сегодняшний день, КПБ не пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы имеют без подтверждений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
СтерофундинB.Braun Petzold GmbHPZN: объем 8609189грунта, 1:1 с Tetraspan
Tetraspan 6% раствором HES B. Braun Melsungen AGPZN: 05565416объем грунта, 1:1 со Стерофундином
Heparin Natrium 25.000Ratiopharm GmbHPZN: 30298432,5 МЕ на мл раствора для прайминга
NaHCO3 8,4% растворB. Braun Melsungen AGPZN: 15797753% в праймингическом растворе
KCL 7,45 % растворB. Braun Melsungen AGPZN: 24185770,1 мл при кардиоплегии
CarprofenZoetis Inc., СШАPZN: 00289615 088591535 мг/кг/МТ
1 Fr PU CatheterInstechlabs INC., СШАC10PU-MCA1301сонной артерии
2 Fr PU CatheterInstechlabs INC., СШАC20PU-MJV1302яремная вена
Vasofix Безопасный катетер 20GB.Braun Medical4268113S-01оротрахеальная интубация
8-0 Шелковый шов плетеныйAshaway Line & Twine Mfg. Co., США75290лигатура
IsofluranePiramal Critical Care Deutschland GmbHPZN:9714675наркоз
CLINITUBES кровеносные капиллярыRadiomed GmbH51750132забор крови 60 - 95 мкл
Пружинные ножницы - 6 мм ЛезвияFine Science Tools GmbH15020-15инструменты
Пружинные ножницы - 2 мм ЛезвияFine Science Tools GmbH15000-03инструменты
Halsted-Mosquito HemostatFine Science Tools GmbH13009-12инструменты
Dumont #55 ЩипцыFine Science Tools GmbH11295-51инструменты
Castroviejo Micro Needle Holder - 9cmFine Science Tools GmbH12060-02инструменты
Micro SerrefinesFine Science Tools GmbH18555-01Инструменты
Bulldog SerrefineFine Science Tools GmbH18050-28инструменты
MiniVent Вентилятор для мышей (модель 845)Harvard Apparatus73-0044Механическая вентиляция
Изофлурановый испаритель Drager 19.1Drä gerwerk AG & Co. KGaAанестезия 1,3 - 2,5%
Устройство сбора данных PowerLab 4/35ADInstruments Ltd, Новая ЗеландияPL3504инвазивное давление, ЭКГ, температура
ABL 800 FlexRadiometer GmbHанализ газов крови
МРТ мышиCharles River LaboratoriesCrl:NMRI(Han)самец, 30 - 35 г, 12 недель, размещение не менее чем за 1 неделю до эксперимента

Ссылки

  1. Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
  2. Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
  3. Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
  4. Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
  5. Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
  6. Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
  7. Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
  8. Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
  9. Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
  10. Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
  11. Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
  12. Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
  13. Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
  14. Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Искусственного кровообращения в мышиной модели: новый подход
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.