Опухоль приживления в гранулы ксенотрансплантата мыши модель человека Мантия клеточная лимфома

Краткое содержание

Мантия клеточная лимфома (мкл) трудно лечить расстройство клетки B и одинаково трудно создать модель мыши ксенотрансплантата первичных MCL для изучения и разработки терапии. Здесь мы описываем успешное создание MCL ксенотрасплантатов в мышей, чтобы помочь понять ее базовой биологии.

Аннотация

Лимфоциты являются ключевыми игроками в циркуляции иммунных клеток и они главным образом проживает и проживают в лимфоидных органов. В то время как нормальные клетки B только размножаются простимулировано Т-лимфоцитов, онкогенные клетки B выжить и расширять автономно в нишах не определен орган. Мантия клеточная лимфома (мкл) является одно такое расстройство клетки B, где медиана выживаемости больных составляет 4-5 лет. Это предусматривает необходимость эффективных механизмов, которые блокируются для того чтобы увеличить выживание самонаведения и приживления этих клеток и продолжительности жизни пациентов. Таким образом усилия по разработке ксенотрансплантата мыши модель для изучения эффективности терапии MCL, блокируя самонаведения механизм в естественных условиях имеет первостепенное значение. Развитие животных получателей для клеток человека ксенотрансплантации тест ранней стадии лекарств давно осуществляется, как соответствующих доклинических мыши модели имеют решающее значение для экрана новых терапевтических агентов. Это животное модель разработана чтобы избежать человека трансплантата и создать модель для заболеваний человека, и это может быть чрезвычайно полезным инструментом для изучения прогрессирования заболевания лимфомы различных типов и выполнить Доклинические испытания кандидат препаратов для гематологических злокачественных новообразований, как ПДК. Мы создали модель ксенотрансплантата мыши, которая будет служить отличным ресурсом для изучения и разработать новые терапевтические подходы для мкл.

Введение

Лимфоцитов по своей природе играют важную роль в иммунной наблюдения, и лимфоцитов торговля является важнейшим шагом в монтаж антигена специфический иммунитет^1,2. Этот процесс включает в себя миграцию наивные Т-лимфоцитов из тимуса в поток крови и оттуда вторичных лимфоидных органов, включая лимфатические узлы, патчи Пейера в или селезенки, где они встречаются родственных антигены. Лимфоциты продифференцировать в костном мозге и мигрируют как наивный клетки в фолликулах вторичных лимфоидных органов³. Некоторые из этих клеток B связывания антигена с их рецепторов и активируются Т-клеток. Пролиферации и дифференцировки клеток этих B толкает неактивированные, наивный B клеток в зоне мантии фолликула. Активированные клетки затем могут дифференцироваться в памяти B клеток, которые патрулируют тело, или перерастет иммуноглобулинов, секретирующих плазматических клеток, которые мигрируют в костного⁴.

MCL происходит, когда наивный B лимфоцитов в зоне мантии превратить в опухоль. Эти лимфомы клетки находятся в микроокружения лимфоидных органов и размножаться независимо от управления конкретными Т-лимфоцитов. Однако на определенном этапе плотности они вырваться из этой ниши и рециркуляции в кровоток в поисках ниши в других органах. Учитывая сложность молекул клеточной адгезии и распущенности chemokines и их рецепторов плохо понимается и таким образом препятствует терапии механизм этой сотовой оборота в естественных условиях . Новые методы необходимы для эффективно блокировать этот процесс миграции для предотвращения клетки лимфомы B от достижения новых микросреды.

MCL является одним из самых трудных для лечения B-клеток злокачественных опухолей. Развития неопластических фенотип MCL является результатом многоступенчатое Каскад, характеризуется приобретения уникальные биологические свойства. На момент постановки диагноза большинство пациентов (70%) уже присутствует с диссеминированной, с большинством случаев, экспонируется экстранодальных причастности селезенки, костного мозга или желудочно-кишечного тракта^5,6. В больных рецидив, устойчивостью опухолей в течение нескольких лет является общим, даже несмотря на то, что обычные химиотерапии побуждает высокие ремиссии курсы в краткосрочной перспективе^7,8. Здесь мы представляем новую модель болезнь, которая может помочь понять распространение MCL и ее базовой биологии: мы создали человека модель мыши ксенотрансплантата MCL, которая возникла из первичного опухолевых клеток больных. Мы надеемся, что эта модель будет способствовать развитию терапевтических стратегий борьбы против распространения MCL и возможно предоставить новые клинические перспективы для оптимального диагностики и лечения рецидивирующего больных.

Протокол

Образцы крови человека были использованы в соответствии с процедурами, утвержденными местной этики и эксперименты над людьми комитетов больницы Университета Женевы.

Животных процедуры были выполнены в соответствии с институциональной этического Комитета животных, уход в Женеве, Швейцария и кантональная служба ветеринарного (номер авторизации: GE/26/15).

1. Подготовка первичных периферической крови мононуклеаров (получения), градиент плотности разделения

Примечание: 3-5 мл периферической крови был получен от пациентов с ПДК в лейкозных фазе. Диагноз был учрежден по данным стандартных диагностических критериев для проточной цитометрии (CD5 +, CD23−, CD200 +, моноклональных клетки B населения) и впоследствии подтверждено присутствие транслокация t(11;14) и Гиперэкспрессия циклин D1. Во всех случаях, моноклональных клетки B составляли до > 90% населения всего B клеток. Остальные клетки были главным образом клетки T и моноцитов.

1. Развести 5 мл (1:1) мкл крови с 5 мл среды Розуэлл парк Мемориальный институт 1640 (RPMI) (рис. 1A).
2. Инвертируйте градиент СМИ плотность (Таблица материалов) несколько раз перед использованием для обеспечения тщательного перемешивания.
3. Добавьте 5 мл градиента плотности СМИ в 15 мл пластиковых пробирок с помощью пипетки Аспиратор.
4. Аккуратно слой разбавленной крови над СМИ градиента плотности в 15 мл пластиковых пробирок с помощью аспиратор (крови коэффициент плотности градиента СМИ должен быть 2:1, например, 10 мл крови по 5 мл градиента плотности СМИ). Следует позаботиться не смесь два слоя (Рисунок 1B, C).
5. Центрифуга образца на 400 x g 40 мин при комнатной температуре с тормозами центрифуги, выключен.
6. Аккуратно с помощью стерильные пипетки Пастера, аспирационная средний слой (беловатые, тонкие кольцо отмеченные стрелки (рис. 1 d, E)) содержащий мононуклеарных клеток и передавать их в чистую пробирку.
7. Стиральная мононуклеарных клеток
   1. Рассчитайте объем передаваемых клеток подвеска и добавить в него 3 тома из стерильных 1 x фосфатный буфер (PBS) с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА).
   2. Смешайте подвеска, закупорить вверх и вниз несколько раз.
   3. Центрифуга для подвески на 400-500 x г за 10-15 мин при комнатной температуре.
   4. Выбросите супернатант для получения гранул клеток и повторите шаг мыть.
   5. Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в желаемый объем, например, 1 или 2 мл ФСБ.
   6. Подсчитать количество ячеек счетчик автоматизированной клеток или вручную с помощью Горяева (Нойбауэр палата).

2. обогащение клеток в клетки B негативный выбор

1. Разбавьте клетки в PBS в конечной концентрации 50 х 10⁶ клеток/мл.
2. Передать 5 мл круглая труба полистирола нижней клетки. Добавить 100 мкл антител коктейль из комплекта обогащения клетки B 2 мл суспензии клеток и осторожно перемешать, закупорить вверх и вниз (рис. 2-1).
3. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 10 мин.
4. Кратко вихревые магнитные частицы предусмотрено в комплект клетки B обогащение 30 s (Рисунок 2-2). Добавьте 150 мкл магнитных частиц в 2 мл образца.
5. Проинкубируйте образцы для еще 5 мин при комнатной температуре.
6. Довести объем образца до 2,5 мл с ПБС, содержащий 2% плода телячьей сыворотки (FCS) и 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Трубка в магнит и инкубировать трубки для еще 3-5 мин (Рисунок 2-3).
7. Подобрать магнит с трубки в месте и в одно непрерывное движение, сцеживаться трубку так, что подвеска обогащенных клеток собирается в свежий трубку (рис. 2-4). Подсчет ячеек счетчик автоматизированной клеток или вручную с помощью Горяева для получения общей доходности B клеток.
   Примечание: Как правило, урожайность-~ 10⁵ B клеток/мл для нормальной клетки B и 5-50 x 10⁶ клеток/мл для мкл.
8. Подтверждает чистоту обогащения клетки B
   1. Взять ~ 50 000 ячеек и инкубировать клетки с анти CD19/CD20 антител (1:20 разрежения) и антитела анти CD45 в сочетании с различными флуорохромов (1:10 разрежения) при комнатной температуре 15-30 мин.
   2. Вымойте с 1 мл раствора 1 x PBS + 1% BSA, центрифуга клетки на 400-500 x g 5 мин и Ресуспензируйте клетки в ~ 200 мкл PBS.
   3. Приобрести образцы клетки, проточной цитометрии и анализировать за чистоту B клеток. Чистота является в основном > 90% этим методом (рис. 3).

3. Разработка модели мыши ксенотрансплантата

1. Приостановите ~ 40-60 x 10⁶ клеток в 150-200 мкл ПБС (объем, необходимый для внедрения на мышь).
2. Внутривенно вводить 150 мкл суспензии клеток (и.в.) в каждой хвост Вену 6-7 неделя старый иммунодефицитных NOD scid гамма (ГЯП) мышей независимо от пола (рис. 4A).
3. Разрешить мышей развивать людской лимфомы ~ 10 недель.
   Примечание: Основной людской лимфомы клетки занять гораздо больше времени, чтобы развиваться опухоли, по сравнению с людской лимфомы клеточных линий (~ 3 недели).
4. Когда животные начинают проявлять симптомы роковой болезни как потеря веса, снижение активности, задних конечностей паралич, взъерошенные волосы, и т.д., пожертвовать мышей CO₂ удушья после пункции сердца сердца для получения крови.
5. Сбор различных органов как костного мозга, селезенки и печени путем рассечения мышей и собирать периферической крови, опираясь кровь от сердца во время жертвоприношения для анализа приживления опухоли (рис. 4В -F).

4. химеризма анализ опухолевых клеток, прижившимися в различных органах

1. После сбора различных органов, их обработки, механических потрясений для создания единого клеточных суспензий после Лизис эритроцитов (РБК), используя 200 мкл 1 x аммония хлорид калия буфер для крови и костного мозга, 500 мкл для селезенки и 2 мл для печени .
2. Граф и пятна с помощью специфических антител человека клетки B, т.е., анти CD19, анти CD20 и анти CD45 клетки.
   Примечание: ГЯП мышей не хватает клетки B и следовательно для анализа, клетки запятнаны с маркерами конкретных B клеток человека.
3. Анализируйте клетки, полученные от каждого органа подачей cytometry, стробирования на лимфоцитов (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
4. Количественно прижившимися опухолевых клеток в различных органах, полученных от MCL вводят мышей, основанный на закрытом клетки, как указано в шаге 4.3 (Рисунок 4 g).
   Примечание: См. Таблицу материалов для деталей.

Результаты

Рукопись описывает оптимизированный протокол для успешного развития ксенотрансплантата мыши модели для приживления MCL клеток. Подготовка населения чистой ячейки (в этом случае клетки мкл), очень важно развивать успешный MCL ксенотрасплантатов. Рисунок 1 представляет препаративные шаги для изоляции мононуклеарных клеток из крови MCL пациента, градиент плотности разделения. Для получения чистого B клеток с помощью комплекта обогащения отрицательные клетки B дл...

Обсуждение

Клинические испытания для препаратов, которые находятся в продвинутой стадии развития, но не может использоваться для обнаружения наркотиков. Давно предпринимались усилия по разработке животных получателей для клеток человека ксенотрансплантации для того чтобы проверить ранней стадии наркотиков. Здесь мы представляем животных модель, которая избегает человеческих трансплантата и может создать модель для заболеваний человека, таких как ПДК. Это в настоящее время состояние искусства ксенотрансплантата модель для изучения м...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Ficoll-paque media	Healthcare	17-1440-02	для разделения мононуклеарных клеток
RPMI Medium 1640	Gibco-Life technologies	61870-010	для разведения образца крови
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	промывка клеток
бычьей сывороткой альбумином (BSA)	Sigma-Aldrich	A8412	для приготовления PBS с 1% БСА, используемого в промывке клеток при выделении
CD19-APC700	Beckman Coulter	B49212	маркер пан-В клеток
человека CD20-APC	Beckman Coulter	A21693	маркер пан-В клеток
человека CD20-ECD	Beckman Coulter	IM3607	маркер пан-В клеток человека
CD5-PC 5.5	Beckman Coulter	PN A70203	маркер Т-клеток человека
CD23-PE	Pharmingen	555711	Белок клеточной поверхности, обычно отсутствует у мышей MCL
CD45 KO	Beckman Coulter	B36294	Пан-лейкоцитарный маркер
CD200-PE	Pharmingen	552475	Белок клеточной поверхности, обычно отсутствует у
мышей MCL NOD scid gamma (NSG)	River Laboratories	5557	использован для разработки ксенотрансплантатов MCL в этом исследовании
Easy sep Набор для обогащения В-клеток человека	Технологии стволовых клеток	19054	используются для обогащения В-клеток с целью получения чистых клеток для введения мышам
FACS	Beckman Coulter	Navios	используется для характеристики образца MCL и для изучения органов для приживления MCL
1X хлорид аммония калий буфер			для лизиса красной крови (NH4Cl 8,024 мг/л; KHCO3 1 001 мг/л; ЭДТА. Na2· 2H2O 3,722 мг/л )

GE Charles