Микроваскулярная vasomotion поджелудочной островок регулирует распределение крови островок и поддерживает физиологические функции β островковых клеток. Этот протокол описывает использование лазера Doppler монитора для определения функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях и оценить вклад поджелудочной островок микроциркуляции для заболеваний поджелудочной железы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лазерная допплеровская: Инструмент для измерения поджелудочной островок микрососудистой Vasomotion In Vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Как функциональное состояние микроциркуляции микрососудистой vasomotion имеет важное значение для доставки кислорода и питательных веществ и удаление углекислого газа и отходов. Обесценение микрососудистой vasomotion может быть важным шагом в развитии заболеваний, связанных с микроциркуляции. Кроме того весьма васкуляризированной поджелудочной островок адаптирована для поддержки эндокринной функции. В этом отношении представляется возможным сделать вывод, что функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion могут повлиять на функцию поджелудочной островок. Анализ патологических изменений функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion могут быть возможные стратегии для определения взносов что поджелудочной островок микроциркуляции делает для заболеваний, как сахарный диабет, панкреатит, и т.д. Таким образом этот протокол описывает использование лазера Doppler крови потока монитора для определения функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion и установить параметры (включая средняя крови перфузии, амплитуды, частоты и относительной скорость поджелудочной островок микрососудистой vasomotion) для оценки функционального состояния микроциркуляции. В модели Стрептозотоцин индуцированной сахарным диабетом мыши мы наблюдали нарушение функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion. В заключение этот подход для оценки поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях может выявить механизмы, связанные с заболеваниями поджелудочной островок.
Введение
Как параметр функционального состояния микроциркуляции микрососудистой vasomotion берет на себя ответственность за доставку и обмена кислорода, питательных веществ и гормонов и имеет решающее значение для удаления продуктов обмена, как двуокись углерода и клеток отходы 1. Микроваскулярная vasomotion также регулирует распределение потока крови и перфузии тканей, влияя тем самым на местных микроциркуляторного кровяного давления и ответы на воспаление, которое может вызвать отек во многих заболеваний. Таким образом микрососудистой vasomotion является чрезвычайно важным для поддержания физиологических функций органов2,3,4, тканей и клеток компонента. Обесценение микрососудистой vasomotion может быть одним из ключевых шагов в развитии заболеваний, связанных с микроциркуляции5.
Лазерная допплеровская была первоначально разработана для наблюдения и количественной оценки в области исследования микроциркуляции6. Эта техника, а также другие технические подходы (например, лазерной спекл7, транскутанное кислород, и т.д.), рассматривается как золотой стандарт для оценки потока крови в микроциркуляции. Обоснование, что перфузии крови местных микроциркуляции (то есть, капилляров, артериол, венулы и т.д.) могут определяться Аппарат оснастили лазера Doppler, основана на принципе доплеровского сдвига. Волны и частота простимулированное излучение света изменения когда легкие частицы сталкиваются движущихся клетки крови в микрососудов, или они остаются неизменными. Таким образом микроциркуляции, количество и скорость кровяных клеток являются ключевыми факторами, касающимся масштабов и распределения частоты Doppler смещается света, в то время как направление потока микрососудистой крови не имеет значения. С помощью различных методов, различных тканей были использованы для микроциркуляторного исследований, в том числе мезентерии и спинной складки палаты мыши, крысы, хомяки и даже люди8. Однако, текущий протокол, мы ориентируемся на функциональный статус микрососудистой vasomotion поджелудочной островок, который вычисляется с помощью лазера Doppler и домашние оценки параметров системы.
Поджелудочной островок микроциркуляцию в основном состоит из микрососудов поджелудочной островок и экспонаты отличительные черты. Поджелудочной островок капиллярной сети показывает пять раз выше плотность чем капиллярной сети своей экзокринных коллегой9. Предоставление каналом для доставки ввода глюкозы и инсулина, распространение, эндотелиальные клетки островка доставить кислород метаболически активные клетки в Иле β-клеток. Кроме того новые данные также демонстрирует что островок микрососудов участвуют не только в регулировании экспрессии гена инсулина и β-клеток выживания, но и в затрагивающих функция β-клеток; поощрение распространения β-клеток; и производит ряд вазоактивных, ангиогенных веществ и факторов роста10. Таким образом в этом отношении, мы сделать вывод, что функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion могут повлиять на функцию островок β-клеток и участвовать в патогенезе заболеваний, таких, как острый/хронический панкреатит, сахарный диабет и другие заболеваний, связанных с поджелудочной железы.
Анализ патологических изменений функционального состояния поджелудочной островок микрососудистой vasomotion может быть осуществимо стратегией для определения вклада поджелудочной островок микроциркуляции к заболеваниям, упомянутых выше. Здесь предоставляют подробную пошаговую процедуру, описывающих подход для определения поджелудочной островок микрососудистой vasomotion в естественных условиях . Типичные измерения отображаются в Представитель результаты. Наконец преимущества и ограничения метода будут выделены в ходе обсуждения, наряду с дальнейшей приложений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были казнены во исполнение всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов. Настоящий протокол продемонстрировал была выполнена под руководством и утверждения из Института из микроциркуляции животных этики Комитета (IMAEC) в Peking союза медицинский колледж (фактические).
1. Животные
- Перед началом эксперимента держите три мышей BALB/c в клетку, с контролируемой температурой (24 ± 1 ° C) и влажности (55 ± 5%), под 12-h свето тени цикла. Разрешить мышей свободный доступ к регулярному питанию и воде.
- Случайным образом разделите мышей на не диабетиков контроля группы и диабетической группы. Точно взвесить каждый индивидуальный мыши и вычислить объем впрыска, с использованием массы тела каждой мыши.
- Быстрая мышей за 4 ч до инъекции Стрептозотоцин (СТЗ) и регулярных водой как нормальный экспериментальный день 1.
- Подготовка буфера цитрата натрия 0,1 М при pH 4,3. Положите 1 мл раствора в 1,5 мл microcentrifuge трубку и завернуть пробки microcentrifuge в алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
- Растворите СТЗ в буфере (рН 4,3) цитрат натрия к окончательной рабочей концентрации 5 мг/мл перед использованием.
- Дать мышей диабетической группы внутрибрюшинной инъекции СТЗ в дозе 40 мг/кг 1 мл шприца и иглы 25-G. Придать мышей не диабетиков контроля с такой же объем буфера цитрата натрия (рН 4,3).
- Вернуть мышей в клетки и поставлять их с регулярной еды и воды 10% сахарозы.
- Повторите шаги 1,3-1,7 на экспериментальных дни 2-5 (т.е., следующих 4 дней подряд).
- Замените воду 10% сахарозы с регулярной водой после последней инъекции СТЗ.
- Быстро мышей для 6 h, но дать им свободный доступ к воде и измерить их уровень глюкозы в крови девять дней спустя (экспериментальный день 14). Сбор крови из Вены хвост для подтверждения гипергликемии, используя систему мониторинга глюкозы крови.
Примечание: Мышей с крови глюкозы уровни > 200 мг / дл считается диабетическая.
2. Подготовка документа
- Чистота поверхности оптических наконечника пробоотборника и зонд лазера Doppler аппарата с тканью мягкие, неабразивные соединителю удалите пыль и частицы. Подключите кабель к порту инструмента (рис. 1A).
- Соберите стенд калибровки, позволяя поток стандартных в термодинамическом равновесии с экспериментальной окрестности (комнатной температуры, обычно в течение 30 мин). Встряхнуть поток стандартных нежно за 10 s и пусть отдых на 2 мин.
- Позиция потока стандартного контейнера в середине основания калибровки. Отрегулируйте зажим на максимальную высоту и закрепите зонд в зажим, таким образом, что он вниз указывает на контейнер. Убедитесь, что поток стандарт правильно расположены под зонд.
- Медленно вниз зонд, пока кончик правильно погружен в стандарте потока. Выберите и нажмите кнопку «Калибровка» на лазерные доплеровские аппарат и выбирать рабочий канал, что зонд подключен к. Запустите программу калибровки, до тех пор, пока «Калибровка успешно» извещения отображается на экране Лазерные доплеровские аппарат.
- Закрепите зонд, с помощью держателей зонда. Вручную зафиксируйте зонд, чтобы избежать движения.
- Поддерживать экспериментальные номер при постоянной температуре (24 ± 1 ° C) и влажности (~ 50-60%).
- Выключите любой внешний свет (например, флуоресцентные и спот лампы) перед выполнением эксперимент, чтобы избежать внешних свет индуцированных изменений.
3. Подготовка животных
- Автоклав, хирургические инструменты и дать им остыть до комнатной температуры перед использованием.
- Дать мышей 10 мин для акклиматизации в экспериментальной среде до обнаружения поджелудочной островок микрососудистой vasomotion лазера Doppler.
- Залейте 1 мл шприц 1 мл 3% Пентобарбитал натрия. Придать Пентобарбитал натрия раствор (75 мг/кг и.п.) чтобы анестезировать мышей.
- Покрытие мыши с предварительно смачивают марлевые для предотвращения сухости глаз.
- Убедитесь, что полностью теряет сознание и больше не реагирует на хвост мыши или hindfoot щепотки пинцетом. Следить за анестезию во обезболивающий и интраоперационная каждые 15 минут поддержания анестезии, дополняя с 10% от объема первоначального впрыска Пентобарбитал решения при необходимости.
- Место грелку с полу изолирующий слой ниже животных и место животного в лежачем положении и передать его на рабочей станции лазера Doppler аппарат. Исправьте мыши рабочей платформы с хирургическая лента.
- Тампоном брюшной кожу мыши с betadine, а затем 75% этанол используется для тампоном брюшной области чистой.
- Внедрить 2% lidocaine/0.5% бупивакаин (50/50) смесь подкожно. Вырезать ~ 3 см-диаметр отверстие в центре губкой марлей. Обложка области живота с губкой марлей.
- Поднимите брюшной кожи пинцетом и сделать первоначальный вертикальный разрез вдоль средней линии живота, с помощью скальпеля или кожи ножницы.
- Понять основные мышцы с щипцами и надрезать для проникновения в брюшную полость. Не травмировать любого из органов. Сложите кожи и основные мышцы груди раскрыть брюшной полости. Аккуратно разоблачить тела поджелудочной железы и селезенки, используя пару Блант носом щипцов.
4. сбор данных для анализа
- Запуск программного обеспечения лазера Doppler аппарата, нажав на «Файл» → «Новый» для создания нового файла измерения. Для настройки подключенных мониторов, на вкладке «Общие», настройте контролирующую продолжительность «Бесплатно запустить». Использовать заводские на закладке «МСО монитор» нажмите кнопку «Далее».
- Настройка отображения графа в «экран диалоговом окне Параметры.» Выберите «Скорость потока, Conc,» каналы, установив соответствующие флажки. Выберите следующие параметры: «Источник данных для канала» и «Label, единицы и цвет». Нажмите кнопку «Далее».
- Введите пользователя сведения о теме и измерения (то есть, имя и номер, оператор, контроль времени, комментарии и т.д.) в «диалоговом окне файла информации» и нажмите «Далее», чтобы завершить настройку измерения.
Примечание: Окно измерения автоматически создается программным обеспечением (рис. 1B). - Вручную заранее электрода поджелудочной железы. Убедитесь, что расстояние между зондом и поджелудочной железы ткани находится в пределах 1 мм. Неуместным расстояние дает искусственно увеличение или снижение крови поток чтение.
- Нажмите значок панели инструментов «Старт», чтобы начать запись данных единиц (ПУ) перфузии микрососудистой крови. Сбор данных пу непрерывно в течение 1 мин каждого прогона. Нажмите кнопку «Стоп», чтобы остановить измерение. Выберите «Файл» → «Сохранить как» имя и сохраните файл готовой измерения.
- Вручную переместить зонд после каждого запуска, чтобы избежать аддитивные эффекты и локализованного истощения сократительной и релаксации. Повторите шаги 4.1-4.4 урожай микрососудистой пу данных многоточечный (т.е., три произвольно выбранных пунктов из ткани поджелудочной железы) для каждой мыши. Измерьте пу данных антибликовое плиты как базовый элемент управления.
- Закройте брюшной мышцы слой и слой кожи с швом. Место животных в клетках, чистый после экспериментов.
- Держите животных тепло, поместив восстановления Кейдж половина на грелку.
Примечание: Обратите внимание на тепло, гигиены, жидкости и пищи и инфекции. Администрировать мышей с 2 мг/кг Carprofen для 48 h как послеоперационной боли. Выполняют euthanasia путем инъекций 150 мг/кг Пентобарбитал натрия и.п., когда мышь наблюдаются в состоянии сильной боли или страдания, которые не могут быть решены.
5. Расчет параметров микрососудистой Vasomotion
- Используйте команду «Экспорт» лазера Doppler программное обеспечение для экспорта время и ПУ необработанные данные в формате *.xlsx и открыть этот файл в таблицу.
- Рассчитать средний базовый блок перфузии (ПУb) (см. шаг 4.6).
- Рассчитать средний крови перфузии (ПУ) за 1 мин измерения следующим: средняя перфузии крови (ПУ) = ПУ - ПУb (уравнение 1).
- Рассчитайте частоту (циклов/мин) для каждого 1 мин измерений.
Примечание: Частота микрососудистой vasomotion определяется как количество вершин, которые произошли в волне микрососудистой vasomotion в минуту. - Рассчитайте амплитуду (ΔPU) для каждого 1 мин измерений.
- Рассчитать амплитуду микрососудистой vasomotion как разница между (ПУМакс) максимальная и минимальная (ПУмин): амплитуда (ΔPU) = пуМакс - пумин (уравнение 2).
- Вычислите относительную скорость (PU) для каждого 1 мин измерений.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Фотография микрососудистой vasomotion измерение лазера Doppler Аппарат оснастили полупроводникового лазерного диода показана на рисунке 1A. Пользовательский интерфейс программного обеспечения представлена на рисунке 1B. С помощью метода, упомянутых выше, были обнаружены гемодинамики поджелудочной островок микрососудистой vasomotion для не диабетиков контроля и диабетических мышей. Различные методы, включая Лазерная доплеровская ф...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В случаях, которые связаны Микроваскулярная дисфункция (например, диабет, острый панкреатит, заболевания периферических микрососудистой и т.д.) некоторых заболеваний привести к снижением кровотока. Помимо изменений в поток крови являются важными показателями, такие как микрососудистой vasomotion, которые отражают функциональное состояние микроциркуляции. Конкретный показатель, микрососудистой vasomotion, обычно определяется как колебание микрососудистой тон в микрососудистой кровати. В текущем протоколе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантов от Peking союза медицинский колледж фонд молодежи и фундаментальные исследования средств для университетов Центральной (Грант № 3332015200).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MoorVMS-LDF2 | Moor Instruments | GI80 | PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) может быть использован в качестве альтернативного аппарата для сбора данных |
| MoorVMS-PC Программное обеспечение | Moor Instruments | GI80-1 | Программное обеспечение MoorVMS-LDF2 |
| Калибровочный стенд | Moor Instruments | GI-cal | Калибровочный инструмент |
| Калибровочная база | Moor Instruments | GI-cal | Калибровочный инструмент |
| Калибровочный флюс стандарт | Moor Instruments | GI-cal | Калибровочный инструмент |
| One Touch UltraEasy глюкометр | Johnson and Johnson | #1955685 | Подтвердить гипергликемию |
| One Touch UltraEasy полоски | Johnson and Johnson | #1297006 | Подтвердить гипергликемию |
| стрептозотоцин | Sigma-Aldrich | S0130 | Растворить в буфере цитрата натрия (pH 4,3) |
| Пентобарбитал натрия | Sigma-Aldrich | P3761 | Рабочая концентрация 3 % |
| Этанол | Sinopharm Inc. | 200121 | Рабочая концентрация 75 % |
| Сахароза | Amresco | 335 | Рабочая концентрация 10 % |
| Медицинская марля | China Health Materials Co. | S-7112 | Хирургические |
| щипцы для тупого носа | Shang Hai Surgical Instruments Inc. | N-551 | Хирургические |
| хирургические ленты | 3M Company | 3664CU | Хирургическая |
| марлевая губка | Fu Kang Sen Medical Device CO. | BB5447 | Хирургический |
| скальпель | Yu Lin Surgical Instruments Inc. | 175C | Хирургические |
| ножницы для кожи | Carent | 255-17 | Хирургический |
| шов | Ning Bo Surgical Instruments Inc. | 3325-77 | Хирургический |
| шприц и игла 25-G | MISAWA Inc. | 3731-2011 | Вес: 1 мл |
Ссылки
- Aalkjaer, C., Nilsson, H. Vasomotion: cellular background for the oscillator and for the synchronization of smooth muscle cells. Br J Pharmacol. 144 (5), 605-616 (2005).
- Serne, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., IJzerman, R. G., Stehouwer, C. D. Microvascular dysfunction: a potential pathophysiological role in the metabolic syndrome. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
- Carmines, P. K. Mechanisms of renal microvascular dysfunction in type 1 diabetes: potential contribution to end organ damage. Curr Vasc Pharmacol. 12 (6), 781-787 (2014).
- Holowatz, L. A. Human cutaneous microvascular ageing: potential insights into underlying physiological mechanisms of endothelial function and dysfunction. J Physiol. 586 (14), 3301(2008).
- De Boer, M. P., et al. Microvascular dysfunction: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Microcirculation. 19 (1), 5-18 (2012).
- Nilsson, G. E., Tenland, T., Oberg, P. A. Evaluation of a laser Doppler flowmeter for measurement of tissue blood flow. IEEE Trans Biomed Eng. 27 (10), 597-604 (1980).
- Chen, D., et al. Relationship between the blood perfusion values determined by laser speckle imaging and laser Doppler imaging in normal skin and port wine stains. Photodiagnosis Photodyn Ther. 13 (1), 1-9 (2016).
- Fuchs, D., Dupon, P. P., Schaap, L. A., Draijer, R. The association between diabetes and dermal microvascular dysfunction non-invasively assessed by laser Doppler with local thermal hyperemia: a systematic review with meta-analysis. Cardiovasc Diabetol. 16 (1), 11-22 (2017).
- Yaginuma, N., Takahashi, T., Saito, K., Kyoguku, M. The microvasculature of the human pancreas and its relation to Langerhans islets and lobules. Pathol Res Pract. 181 (1), 77-84 (1986).
- Brissova, M., et al. Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes beta cell regeneration. Cell Metab. 19 (3), 498-511 (2014).
- de Moraes, R., Van Bavel, D., Gomes Mde, B., Tibirica, E. Effects of non-supervised low intensity aerobic excise training on the microvascular endothelial function of patients with type 1 diabetes: a non-pharmacological interventional study. BMC Cardiovasc Disord. 16 (1), 23-31 (2016).
- Humeau-Heurtier, A., Guerreschi, E., Abraham, P., Mahe, G. Relevance of laser Doppler and laser speckle techniques for assessing vascular function: state of the art and future trends. IEEE Trans Biomed Eng. 60 (3), 659-666 (2013).
- Park, H. S., Yun, H. M., Jung, I. M., Lee, T. Role of Laser Doppler for the Evaluation of Pedal Microcirculatory Function in Diabetic Neuropathy Patients. Microcirculation. 23 (1), 44-52 (2016).
- Sun, P. C., et al. Microcirculatory vasomotor changes are associated with severity of peripheral neuropathy in patients with type 2 diabetes. Diab Vasc Dis Res. 10 (3), 270-276 (2013).
- Pan, Y., et al. Effects of PEMF on microcirculation and angiogenesis in a model of acute hindlimb ischemia in diabetic rats. Bioelectromagnetics. 34 (3), 180-188 (2013).
- Jumar, A., et al. Early Signs of End-Organ Damage in Retinal Arterioles in Patients with Type 2 Diabetes Compared to Hypertensive Patients. Microcirculation. 23 (6), 447-455 (2016).
- Nguyen, H. T., et al. Retinal blood flow is increased in type 1 diabetes mellitus patients with advanced stages of retinopathy. BMC Endocr Disord. 16 (1), 25-33 (2016).
- Forst, T., et al. Retinal Microcirculation in Type 1 Diabetic Patients With and Without Peripheral Sensory Neuropathy. J Diabetes Sci Technol. 8 (2), 356-361 (2014).
- Hu, H. F., Hsiu, H., Sung, C. J., Lee, C. H. Combining laser-Doppler flowmetry measurements with spectral analysis to study different microcirculatory effects in human prediabetic and diabetic subjects. Lasers Med Sci. 31 (1), 1-8 (2016).
- Klonizakis, M., Manning, G., Lingam, K., Donnelly, R., Yeung, J. M. Effect of diabetes on the cutaneous microcirculation of the feet in patients with intermittent claudication. Clin Hemorheol Microcirc. 61 (3), 439-444 (2015).
- Khazraei, H., Shafa, M., Mirkhani, H. Effect of ranolazine on cardiac microcirculation in normal and diabetic rats. Acta Physiol Hung. 101 (3), 301-308 (2014).
- Fujita, T., et al. Increased inner ear susceptibility to noise injury in mice with streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61 (11), 2980-2986 (2012).
- Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14 (4-5), 403-438 (2007).
- Chawla, L. S., et al. Vascular content, tone, integrity, and haemodynamics for guiding fluid therapy: a conceptual approach. Br J Anaesth. 113 (5), 748-755 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
