Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Определение сиаловых кислот в образцах печени и молока дикого типа и

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56030

⸱

14 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем метод ВЭЖХ для определения N-ацетилнейраминовой кислоты и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мыши.

Аннотация

CMAH (гидроксилаза цитидин-моно-фосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты) ответственна за окисление монофосфат-цитидин-N-ацетилнейраминовых кислот у млекопитающих. Однако люди не могут окислять монофосфат-N-ацетилнейраминовую кислоту цитидина до монофосфат-N-гликолинераминовой кислоты цитидина из-за первичной экзоновой делеции гена CMAH . Чтобы более подробно понять последствия и последствия отсутствия активности CMAH , модель нокаутов Cmah у мышей представляет большой интерес к фундаментальным и прикладным исследованиям. Метод анализа для определения фенотипа этой модели мыши подробно описан здесь и основан на обнаружении как N-ацетилнейраминовой кислоты, так и N-гликолиленураминовой кислоты в печени и молоке мышей с диким типом и Cmah . Эндогенные сиаловые кислоты высвобождаются и дериватизируются о-фенилендиамином для получения флуорогенных производных, которые затем могут быть проанализированы с помощью ВЭЖХ. Представленный протокол может бытьТакже применяется для анализа образцов молока и тканей из различных других источников и может быть полезен для исследования пищевых и медицинских эффектов N-гликолилнейраминовой кислоты.

Введение

N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и N-гликолилнеураминовая кислота (Neu5Gc) являются наиболее распространенными сиаловыми кислотами у большинства млекопитающих 1 . Несмотря на то, что эндогенно синтезируется Neu5Ac, люди не способны продуцировать Neu5Gc из-за первичной делеции экзона на ген CMAH , кодирующий гидроксилазу CMP-Neu5Ac 2 , 3 . Однако пищевые продукты на основе животных могут быть диетическими источниками Neu5Gc 4 , 5 , 6 , что приводит к получению антител против Neu5Gc и, следовательно, вызывает иммунный ответ на Neu5Gc 7 . Предполагается, что этот диетический эффект Neu5Gc способствует хроническому воспалению и различным другим заболеваниям 8 , 9 , 10 . Чтобы всесторонне понять эффекты Neu5Gc в hUmans, животная модель для систематического изучения эффектов сиаловых кислот пищевого происхождения весьма желательна. Хотя протоколы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа выбитых мышей, хорошо известны и являются удобным способом генотипической оценки, функциональный анализ фенотипа на метаболическом уровне требует более конкретных методов анализа. Фенотип модели выкатной мыши Cmah можно оценить, выделив и проанализировав состав сиаловых кислот в образцах печени или молока. Ранее сообщалось о нескольких методах обнаружения сиаловых кислот в тканях животных: реакция сиаловых кислот с резорцинолом 11 или тиобарбитуровой кислотой 12 приводит к образованию хромофорного продукта и может быть просто проанализирована с использованием установки на основе плиттера, но только общая сиалическая Содержание кислоты может быть определено. Альтернативно, анализ сиаловых кислот также описывался с использованием газовой хроматографии13 , масс-спектрометрия MALDI-TOF 14 или амперометрические методы 15 . Однако наиболее часто применяемые методы анализа сиаловой кислоты основаны на гидролитическом высвобождении с последующей дериватизацией флуоресценции и последующей высокоэффективной жидкостной хроматографией 16 , 17 , 18 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры, связанные с животными, были одобрены Этическим комитетом экспериментального животного центра Нанкинского сельскохозяйственного университета в соответствии с Национальными руководящими принципами по обеспечению благополучия животных (Министерство науки и технологий, КНР, 2006 г.) с животными, содержащимися в SPF Объект (ID разрешения: SYXK-J-2011-0037).

1. Модель мышиной мыши Cmah

  1. Используйте мышей дикого типа C57Bl / 6 из Центра сравнительной медицины Университета Янчжоу (Китай).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мышцы Cmah с нокаутом были созданы на основе информации, предоставленной в предыдущих исследованиях 17 , 19 Kmah , и коммерчески использовали стратегию CRISPR / Cas9 20 , удалив 92 пары оснований из экзона 6 гена Cmah , что также Удалены в человеческом CMAH- гене 19 . Положительный F 0 </ Sub> -mice (2 индивидуума) скрещивались с мышами дикого типа, чтобы получить гетерозиготную F 1 -мерную. После пересечения гетерозиготных F 1 -mice (5 особей), гомозиготные Cmah выбивание F 2 -mice может быть успешно получен (3 особей).
  2. Выполните генотипирование мышей с использованием геномной ДНК в соответствии с методом, показанным Zangala 21, с использованием коммерческого набора для очистки ДНК.
    1. Усилить соответствующий фрагмент ДНК гена Cmah с использованием коммерческой ДНК-полимеразы и пары праймеров 5'gaaagggctcggctctgtatgaa3 'и 5'tttaaaatgtcccgggtgagaagc3'. Выполните амплификацию гена с использованием 34 циклов ПЦР, состоящих из денатурации при 94 ° С в течение 40 с, отжига при 63 ° С в течение 40 с и удлинения при 72 ° С в течение 1 мин.
    2. Визуализируйте продукты ПЦР на 1% агарозном геле. Нужно наблюдать одиночную полосу (0,5 т.п.н.) для индивидуума дикого типа, двойную полосу (0,4 и 0,5 кб) дляГетерозиготный нокаутный индивидуум и одиночная полоса (0,4 т.п.н.) для гомозиготного нокаута.

2. Сбор образцов

  1. Собирайте мышечное молоко с использованием протокола, описанного Willingham et al. 22 .
  2. Собирайте ткань печени мыши, используя протокол, описанный Gonçalves et al. 23 и хранить образцы при -80 ° C.

3. Выделение сиаловых кислот из молока

  1. Подготовьте 100 мл 2 М раствора уксусной кислоты, добавив 12 мл ледяной уксусной кислоты в 88 мл дистиллированного H 2 O.
  2. Передайте 50 мкл молока в 1,5 мл центрифужную пробирку и добавьте 1,2 мл полученного водного раствора уксусной кислоты.
  3. Инкубировать суспензию в течение 4 ч при 80 ° С и центрифугировать образец при 14000 мкг в течение 10 мин.
  4. Перенесите верхние 1000 мкл надосадочной жидкости в свежую 1,5 мл центрифужную пробирку и запишитеРастворител центрифугированием при комнатной температуре до полного сухости (в зависимости от подключенного вакуумного насоса это займет 4-20 ч). Повторно растворите образец в 500 мкл дистиллированного H 2 O.
  5. Подготовьте колонку обмена микроанионом. Эта стадия специально обогащает анионные соединения и удаляет катионные и нейтральные соединения из образцов молока и печени и, следовательно, повышает селективность флюорогенного меченого агента OPD для дериватизации сиаловой кислоты.
    1. Перенесите для каждого образца 200 мг анионообменной смолы (Dowex 1X8) в пустые 3-миллилитровые колонки с прикрепленным краном.
    2. Добавить 2 мл водного раствора уксусной кислоты, полученного на стадии 3.1, для замены ионов хлорида в смоле ацетатными ионами. Закройте краном, как только растворитель достигнет вершины смолы.
    3. Аккуратно добавьте 2 мл дистиллированного H 2 O, откройте запорный кран и остановите поток, как только большая часть растворителя достигнетВерхняя часть смолы. Убедитесь, что смола всегда покрыта растворителем.
    4. Промойте колонку смолы еще два раза с помощью 2 мл дистиллированного H 2 O для удаления избытка ацетата.
  6. Перенесите полученные 500 мкл растворителя образца из стадии 3.4. На колонну смолы и отказаться от сквозного потока. Аккуратно промыть смолу 2 мл дистиллированного H 2 O. Элюировать образцы анионов из смолы, используя 1 мл 50 мМ раствора ацетата аммония (386 мг ацетата аммония, растворенного в 100 мл дистиллированной H 2 O), в 1,5 мл Центрифужная трубка. Удалите растворитель центробежным выпариванием при комнатной температуре досуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сухие образцы можно хранить при температуре 4-6 ° C в течение 12 месяцев.

4. Выделение сиаловых кислот из ткани печени

  1. Аккуратно оттереть 20 - 50 мг печени мыши и перенести его в тканевую дробилку Dounce (1 мл или 2 мл объема). Добавить 1,2 мл водного раствора уксусной кислотыПолученного на стадии 3.1, и гомогенизируют ткань путем осторожного сдвига в течение 10 с. Перенесите полученную суспензию в 1,5 мл центрифужную пробирку.
  2. Выполните шаги 3.3. До 3.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сухие образцы можно хранить при температуре 4-6 ° C в течение 12 месяцев.

5. Подготовка стандарта смешанной сиаловой кислоты

  1. Взвешивают между 5-8 мг N-ацетилнейраминовой кислоты на аналитическом балансе в 1,5 мл центрифужную пробирку. Обратите внимание на точный вес и добавьте 164 мкл дистиллированного H 2 O для каждого мг ( т.е. если масса Neu5Ac составляет 7,2 мг, затем добавьте 7,2 × 164 = 1, 181 мкл дистиллированного H 2 O). В результате получается 20 мМ исходного раствора Neu5Ac, который можно хранить при -20 ° C в течение 12 месяцев.
  2. Получают N-гликолилнейраминовую кислоту в меньших количествах по умеренной цене, например, в аликвотах по 1 мг. Добавьте 154 мкл дистиллированного H 2 O непосредственно к соединению для получения 20 мМ исходного раствора Neu5Gc. ПередайтеРаствор в 1,5 мл центрифужную пробирку. Этот раствор можно хранить при -20 ° C в течение 12 месяцев.
  3. Объедините 5 мкл из каждого исходного раствора с шага 5.1 и 5.2 в свежую пробирку с 1,5 мл центрифуги и удалите растворитель центробежным выпариванием при комнатной температуре досуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Смешанный стандарт сиаловой кислоты можно хранить при 4-6 ° C в течение 12 месяцев.

6. Флюоресцентная дериватизация сиаловых кислот

  1. Подготовьте 10 мл OPD-раствора, состоящего из 100 мг о-фенилендиамина и 208 мг гидросульфита натрия в 10 мл дистиллированного H 2 O.
  2. Добавьте 20 мкл OPD-раствора в образцы сиаловой кислоты, полученные из мышиного молока (стадия 3), печень мыши (стадия 4) или смешанный стандарт сиаловой кислоты (этап 5). Вихрь энергично в течение 30 с и инкубируйте образцы в течение 4 ч при 80 ° С в темноте ( т. Е. Оберните микропробирки в алюминиевой фольге).
  3. Пусть образцы остынут в течение 5 минут, добавьте 80 μ, L дистиллированного H 2 O и центрифугируют пробирки при 14000 xg в течение 1 мин.
  4. Передайте 80 мкл из супернатанта в 300 мкл высокоэффективного ВЭЖХ-ампулы. Образцы производных сиаловой кислоты можно хранить при 4-6 ° C в течение одной недели.

7. Анализ ВЭЖХ производных сиаловой кислоты

  1. Проанализируйте образцы, используя стандартную систему ВЭЖХ, подключенную к онлайн-детектору флуоресценции.
  2. Для анализа используйте колонку с обращенной фазой C18 с стандартными размерами 250 мм и диаметром 4,6 мм.
  3. Подготовьте растворитель А, разбавив 200 мл исходного раствора 800 мл воды LCMS (LCMS - жидкостная хроматографическая масс-спектрометрия). Сам исходный раствор можно приготовить следующим образом:
    1. Добавить 46 г муравьиной кислоты до 800 мл LCMS-класса H 2 O.
    2. Отрегулируйте pH до 4,5 путем добавления по каплям раствора гидроксида аммония (puriss. Pa).
    3. Перенесите растворитель вИзмерительный цилиндр и заполнить до 1000 мл LCMS-grade H 2 O. Этот исходный раствор можно хранить при 4-6 ° C в течение 3 месяцев.
  4. Для растворителя B используйте ацетонитрил LCMS.
  5. Отделите производные сиаловых кислот со скоростью потока 1 мл / мин со следующим градиентным элюированием:
    1. Начните с добавления 10% растворителя В, смешанного с растворителем А.
    2. От 0 мин до 15 мин постепенно увеличивают долю растворителя В с линейным градиентом до 60%.
    3. С 15 минут до 16 минут быстро увеличивайте долю растворителя B с линейным градиентом от 60% до 90%. Это инициирует промывку колонки ВЭЖХ.
    4. Для дальнейшей промывки колонки ВЭЖХ поддерживать уровень растворителя В на 90% между 16 и 18 мин, прежде чем постепенно снижать уровень растворителя В снова до 10% в течение 18 мин и 19 мин.
    5. Повторно уравновешивают колонку ВЭЖХ до начальных условий 10% В между 19 и 24 мин.
  6. В50 мкл образца в систему ВЭЖХ.
  7. Контролировать элюенты с использованием длин волн возбуждения / испускания флуоресцентного излучения 373/448 нм, а дериватизированные сиаловые кислоты можно ожидать при приблизительном времени удерживания 9 мин (для Neu5Gc-OPD) и 10 мин (для Neu5Ac-OPD).
  8. Вычислите относительное количество Neu5Gc (F Neu5Gc ) из областей пика флуоресценции Neu5Ac (A Neu5Ac ) и Neu5Gc (A Neu5Gc ) следующим образом: F Neu5Gc [%] = 100 × A Neu5Gc / (A Neu5Ac + A Neu5Gc ). В случае образцов молока и печени из гомозиготной мышиной ножки Cmah F Neu5Gc должно быть 0%, тогда как значения для F Neu5Gc гетерозиготных и дикого типа мышей могут широко варьироваться в зависимости от возраста мыши и типа ткани (от 2% И> 90%) с ожидаемым пределом погрешности ± 12%.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Схематический анализ описанного метода анализа показан на рисунке 1 и включает выделение сиаловых кислот из образцов молока и печени мутантных мышей дикого типа и Cmah , а также дериватизацию флуоресценции и анализ HPLC этих компонентов. На фиг. 2 и 3 показаны типичные хроматограммы ВЭЖХ дериватизированных сиаловых кислот молочных и печеночных образцов от гомо- и гетерозиготных нокаутных мы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный здесь протокол позволяет фенотипическую оценку гомозиготных мышечных мышей Cmah , анализируя и количественно определяя относительные количества Neu5Gc образцов молока и печени. Анализ проводили с использованием стандартной установки ВЭЖХ с детектированием флуоресценции. Наиболее важным этапом этой процедуры является получение анионообменных колонок и проведение анионообменной хроматографии; Для правильной установки смолы и для сбора правильной фракции промывки и элюирования требуется нем...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук Китая (номера грантов 31471703, A0201300537 и 31671854 для СП и LL) и 100 иностранных планов талантов (номер гранта JSB2014012 для СП).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Химические вещества:
N-ацетилнейраминовая кислотаSigmaA0812
N-гликолилнейраминовая кислотаSigma506441 мг аликвоты должно быть достаточно
o-фенилендиаминаSigma694975
гидросульфита натрияJ& K Scientific Ltd75234
Инструменты/материалы:
3 мл трубки SPESupelcoSigma 57024пустые твердофазные экстракционные колонки
Luer stopcockSigmaS7396для остановки потока трубки SPE
Dowex 1X8Dow ChemicalsSigma 44340200 - 400 меш
Dounce тканевый измельчительSigmaD8938плотная посадка
<прочная>ВЭЖХ Анализ:
пробирка с высоким уровнем извлечения ВЭЖХAgilent Technologies#5188-2788
Система ВЭЖХShimadzuNexera
Флуоресцентный детектор для ВЭЖХShimadzuRF-20Axs Колонка
ВЭЖХPhenomenexHyperclone ODS250 x 4,6 мм
LCMS-класс H2OMerck Millipore#WX00011
LCMS-класс АцетонитрилMerck Millipore#100029Гиперсортный
раствор гидроксида аммонияFluka#44273puriss. P.a.

Ссылки

  1. Lamari, F. N., Karamanos, N. K. Separation methods for sialic acids and critical evaluation of their biologic relevance. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 781 (1-2), 3-19 (2002).
  2. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273 (25), 15866-15871 (1998).
  3. Chou, H. H., et al. A mutation in human CMP-sialic acid hydroxylase occurred after the Homo-Pan divergence. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (20), 11751-11756 (1998).
  4. Rehan, I. F., et al. Large-Scale Glycomics of Livestock: Discovery of Highly Sensitive Serum Biomarkers Indicating an Environmental Stress Affecting Immune Responses and Productivity of Holstein Dairy Cows. J Agric Food Chem. 63 (48), 10578-10590 (2015).
  5. Wang, B., McVeagh, P., Petocz, P., Brand-Miller, J. Brain ganglioside and glycoprotein sialic acid in breastfed compared with formula-fed infants. Am J Clin Nutr. 78 (5), 1024-1029 (2003).
  6. Yao, H. L., et al. Quantification of sialic acids in red meat by UPLC-FLD using indoxylsialosides as internal standards. Glycoconj J. 33 (2), 219-226 (2016).
  7. Nguyen, D. H., Tangvoranuntakul, P., Varki, A. Effects of natural human antibodies against a nonhuman sialic acid that metabolically incorporates into activated and malignant immune cells. J Immunol. 175 (1), 228-236 (2005).
  8. Byres, E., et al. Incorporation of a non-human glycan mediates human susceptibility to a bacterial toxin. Nature. 456 (7222), 648-652 (2008).
  9. Hedlund, M., Padler-Karavani, V., Varki, N. M., Varki, A. Evidence for a human-specific mechanism for diet and antibody-mediated inflammation in carcinoma progression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (48), 18936-18941 (2008).
  10. Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12045-12050 (2003).
  11. Svennerholm, L. Quantitative estimation of sialic acids. II. A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochim Biophys Acta. 24 (3), 604-611 (1957).
  12. Warren, L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J Biol Chem. 234 (8), 1971-1975 (1959).
  13. Kakehi, K., Maeda, K., Teramae, M., Honda, S., Takai, T. Analysis of sialic acids by gas chromatography of the mannosamine derivatives released by the action of N-acetylneuraminate lyase. J Chromatogr. 272 (1), 1-8 (1983).
  14. Wheeler, S. F., Domann, P., Harvey, D. J. Derivatization of sialic acids for stabilization in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and concomitant differentiation of alpha(2 --> 3)- and alpha(2 --> 6)-isomers. Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (2), 303-312 (2009).
  15. Hurum, D. C., Rohrer, J. S. Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods. J Dairy Sci. 95 (3), 1152-1161 (2012).
  16. Ito, M., et al. An improved fluorometric high-performance liquid chromatography method for sialic acid determination: an internal standard method and its application to sialic acid analysis of human apolipoprotein. E. Anal Biochem. 300 (2), 260-266 (2002).
  17. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Mol Cell Biol. 27 (8), 3008-3022 (2007).
  18. Manzi, A. E., et al. High-pressure liquid chromatography of sialic acids on a pellicular resin anion-exchange column with pulsed amperometric detection: a comparison with six other systems. Anal Biochem. 188 (1), 20-32 (1990).
  19. Hedlund, M., et al. N-glycolylneuraminic acid deficiency in mice: implications for human biology and evolution. Mol Cell Biol. 27 (12), 4340-4346 (2007).
  20. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  21. Zangala, T. Isolation of genomic DNA from mouse tails. J Vis Exp. (6), e246(2007).
  22. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar J. 6, 169(2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

NNo
Определение сиаловых кислот в образцах печени и молока дикого типа и
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.