Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56031

⸱

28 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом для анализа взаимодействия РНК-белок. Традиционно в большинстве экспериментов использовались вертикальные гели. Однако горизонтальные гели обладают рядом преимуществ, таких как возможность мониторинга комплексов во время электрофореза. Мы предоставляем подробный протокол для генерации и использования горизонтального гель-электрофореза.

Аннотация

Родной полиакриламидный гель-электрофорез является фундаментальным инструментом молекулярной биологии, который широко используется для биохимического анализа взаимодействий РНК-белок. Эти взаимодействия традиционно анализировались полиакриламидными гелями, образованными между двумя стеклянными пластинами и образцами, электрофорезированными вертикально. Однако полиакриламидные гели, литые в лотках и электрофорезированные горизонтально, обладают несколькими преимуществами. Например, горизонтальные гели, используемые для анализа комплексов между флуоресцентными субстратами РНК и конкретными белками, могут быть отображены несколько раз по мере развития электрофореза. Это дает уникальную возможность контролировать РНК-белковые комплексы в нескольких точках во время эксперимента. Кроме того, горизонтальный гель-электрофорез позволяет параллельно анализировать многие образцы. Это может значительно облегчить эксперименты с временным курсом, а также одновременно проанализировать несколько реакций для сравнения различных компонентов и условий. Здесь мы имеемOvide подробный протокол для генерации и использования горизонтального нативного гель-электрофореза для анализа взаимодействия РНК-белок.

Введение

Анализы сдвига электрофоретической подвижности (EMSAs) оказались бесценным биохимическим инструментом для анализа специфических взаимодействий белок-нуклеиновая кислота 1 , 2 , 3 . Эти анализы могут предоставить важную информацию о связывании сродства белков к РНК или ДНК 3 , стехиометрии компонентов нуклеиновых кислот-белковых комплексов 1 и дать важные новые сведения о специфичности связывания РНК-связывающих белков через субстратные конкурентные эксперименты 1 .

Традиционная экспериментальная установка для этих анализов состоит из смешивания очищенного белка с радиоактивно меченым РНК-субстратом. Полученные комплексы затем анализируют с помощью неденатурирующих (нативных) полиакриламидных гелей, вылитых между двумя стеклянными пластинами с последующим электрофорезом образца в вертикальном устройстве 3, Хотя этот подход был использован исчерпывающе, чтобы дать важные сведения о биохимических механизмах, которые лежат в основе связывания белков с нуклеиновыми кислотами, он также имеет несколько ограничений. Например, эта базовая стратегия имеет относительно низкую пропускную способность и не легко адаптируется для приложений, требующих параллельного анализа многих реакций связывания. Кроме того, с традиционным вертикальным аппаратом сложно потенциально контролировать комплексы в несколько раз во время электрофореза 3 , 4 .

Здесь мы представляем адаптацию анализа EMSA, в котором используются нативные полиакриламидные гели, литые в планшетном аппарате, горизонтальный электрофорез и флуоресцентно меченные РНК-субстраты 4 , 5 , 6 , 7 . Включение этих относительно простых модификаций в основную структуруTegy дает некоторые мощные преимущества. В частности, горизонтальная планшетный формат , который легко поддается анализу десятков образцов одновременно 4. Кроме того, для некоторых РНК-белковых комплексов, таких как те, которые образуются между белком Bicaudal-C и его электрофорезом в РНК-субстрате в горизонтальном геле, обеспечивается повышенная способность разрешать различные комплексы РНК-белок и отличить их от несвязанного РНК-субстрата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка Горизонтального Нативного Полиакриламидного гел 4 .

  1. Подготовка необходимых материалов.
    1. Для горизонтального гелеобразного аппарата используйте гелевую коробку (37 см х 24 см) с поддоном 27 см х 21 см и емкость для двух 24-луночных гребней. Эта настройка обеспечивает в общей сложности 48 выборок, которые могут быть проанализированы одновременно.
    2. Приготовить следующие реагенты: 40% акриламид-бис 19: 1, 5x TBE (Tris-Borate-EDTA pH 8,0), TEMED и 10% APS (персульфат аммония).
  2. Получение 10% активного акриламидного геля.
    1. В колбу на 500 мл добавьте 80 мл 5-кратного ТВЭ, 100 мл 40% акриламида и воду до конечного объема 400 мл.
    2. Добавить 4 мл 10% APS и 400 мкл TEMED. Хорошо перемешать.
    3. Вылейте смесь в горизонтальный литейный лоток и дайте гелю полимеризоваться в течение 30 мин. Гель будет иметь толщину приблизительно 2 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гели могут вставляться в вытяжной шкаф для ускоренияПолимеризации. После полимеризации тонкий слой жидкости останется на вершине геля.
    4. Вылейте жидкость и промойте бегущим буфером. Удалите гребенку (ы) тщательно и ополосните лунки бегущим буфером с помощью шприца.
  3. Подготовка бегущего буфера.
    1. Подготовьте 2 л 1x TBE-буфера для гелевой коробки. Разбавляют 400 мл 5XTBE 1600 мл и перемешивают. Поместите буфер 1x TBE в холодную комнату для охлаждения.
  4. Предварительная работа геля
    1. Добавьте 2 г холодного буфера в гелевую коробку и вставьте гель.
    2. Предварительно запустить гель при 120 В в течение 1 ч при 4 ° С в холодной комнате. В это время подготовьте реакцию связывания.

2. Связывающая реакция 8

  1. 2.1.Подготовьте следующие компоненты реакции.
    20 мМ DTT
    10 мМ BSA
    10 мМ дрожжевых тРНК
    5X (50 мМ HEPES pH 8,0, 5 мМ ЭДТА, 250 мМ KCl, 0,2% Твин-20)
    100 нМ флуоресцеиновой меченной РНК, приобретенной на коммерческой основе
    Концентрированный белок Bicaudal-C
    50% глицерина в обработанном DEPC H 2 O
    Обработанный DEPC H 2 O
  2. Соберите компоненты реакции связывания в бесконтактной микроцентрифужной пробирке, свободной от РНКазы.
    1. В пробирку добавьте 5 мкл 10 мМ BSA, 5 мкл 20 мМ DTT, 5 мкл 10 мМ дрожжей тРНК, 10 мкл 5x Binding Buffer.
  3. Добавить белок до конечной концентрации 250 нМ в 50 мкл. Добавьте воду до конечного объема 45 мкл.
  4. Добавьте 5 мкл флуоресцентно меченого РНК-субстрата. Используйте коммерчески приобретенный 3'-флуоресцеин, меченный 32-нуклеотидным субстратом.
  5. Смешать и инкубировать в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.

3. Анализ образцов на родном горизонтальном полиакриламидном геле

  1. Для каждой реакции добавьте 15 мкл 50% глицерина и осторожно перемешайте.
  2. сторожныДобавьте 30 мкл каждой реакции к гелю. Количество образца, которое может быть загружено в одну лунку, варьируется в зависимости от толщины геля и размера лунок. Мы загрузили объемы всего 15 мкл и до 45 мкл в одну лунку гелей, созданных с помощью 24-луночного гребня, и вылили до толщины 2 см.
  3. После подключения источника питания к гелевому устройству включите питание и настройте напряжение. Запустите гель при 4 ° C при 120 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для горизонтального гелеобразного аппарата это составляет примерно 5 В / см. Для вертикального гелеобразного аппарата это 16 В / см.
    1. Чтобы предотвратить повреждение или отбеливание флуоресцентно меченной РНК, проводите электрофорез в темноте.
    2. Время размораживания электрофореза в зависимости от специфики анализируемого комплекса РНК-белок.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Основным преимуществом горизонтального анализа EMSA является то, что электрофорез может быть остановлен, геля визуализированы, а затем geЛ можно поместить обратно в аппарат, и электрофорез можно продолжать в течение более длительного времени.

4. Изображение геля

  1. Проведите анализ с помощью любого инструмента, предназначенного для обнаружения и визуализации флуоресцентных субстратов.
  2. Поместите гель на тепловизор.
  3. Отрегулируйте настройки изображения. Для флуоресцеин-меченных РНК-лигандов используйте следующие настройки: FAM (длина волны 473 нм), 750 фотоумножителей (PMT), размер пикселя 100 мкм.
  4. Сканирование геля для захвата изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы продемонстрировать мощность и универсальность горизонтального гель-электрофореза, мы проанализировали связывание белка Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) с флуоресцентно меченной РНК, содержащей сайт связывания Bicc1. Белки Bicc1 функционируют в качестве мРНК-специфических трансляционных репрессоров для управления решениями о судьбе клеток во время материнской стадии развития животных 9 , 10 , ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Родные полиакриламидные гели являются бесценным инструментом для исследования взаимодействия белок-РНК, и традиционно эти гели подвергают электрофорезу по вертикали 2 , 3 . Мы использовали модификацию протокола, который заменяет нативные полиакриламидные гели, созданные и электрофорезированные по горизонтали 1 , 4 , 6 , 7 , ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Лауру Вандерплоэг за подготовку цифр. Работа в лаборатории Sheets поддерживается грантом NSF 1050395 и грантом NIH (R21HD076828). Работа в лаборатории Райдера поддерживается грантами NIH R01GM117237 и R01GM117008. Меган Доудл поддерживает стипендию SciMed GRS Advanced Opportunity через Университет Висконсин-Мэдисон и программу обучения биотехнологии через Национальный институт общих медицинских наук Национального института здоровья (T32GM008349).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Горизонтальная гелевая коробкаOWLN/AПродукт больше не производится. Подобные гелевые коробочки можно найти в Thermo Scientific, гелевые коробки серии А. Каталожный номер: A2-BP
24-луночный большой большой горизонтальный гелевый гребень для электрофорезаOWLN/AПродукт больше не производится. Подобные гелевые коробочки можно найти у Thermo Scientific, гелевые коробчатые расчески серии А. Каталожный номер: A2-24C
Powerpac 300Bio-Rad1655050
Mini-Protean II Electrophoresion CellBio-RAD165-2940
InstaPAGE-19 40% 19:1 Акриламид/BisIBIIB70015
TEMEDIBIIB70120
APSIBIIB70080
тРНК дрожжейAmbionAM7119
Флуоресцеин меченый РНКIDTН/ДЗаказ может быть сделан по длине и желаемой последовательности
ЭДТА Гидрат тетранатриевой солиSigma-AldrichE5391-1KG
HEPESSigma-AldrichH4034-500G
Tris Base UltrapureUS BiologicalT8600
Борная кислотаFisher ScientificBP168-500
Хлорид калияFisher ScientificBP366-1
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
DEPCSigma-Aldrich1609-47-8
Дитиотрейтол (DTT)Sigma-Aldrich3483 12 3
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8

Ссылки

  1. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  2. Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels. J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).
  3. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  4. Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).
  5. Royer, C. A., Scarlata, S. F. Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions. Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).
  6. Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus. Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).
  7. Buczek, P., Horvath, M. P. Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain. J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).
  8. Zhang, Y., Park, S., Blaser, S., Sheets, M. D. Determinants of RNA binding and translational repression by the Bicaudal-C regulatory protein. J Biol Chem. 289 (11), 7497-7504 (2014).
  9. Gamberi, C., Lasko, P. The Bic-C family of developmental translational regulators. Comp Funct Genomics. , 141386(2012).
  10. Saffman, E. E., et al. Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C. Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).
  11. Chicoine, J., et al. Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression. Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).
  12. Zhang, Y., et al. Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs. RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).
  13. Maisonneuve, C., et al. Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow. Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).
  14. Tran, U., et al. The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity. Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).
  15. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17 (1), 14-20 (2011).
  16. Foley, T. L., et al. Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays. J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Горизонтальный гель-электрофорез для расширенного обнаружения комплексов протеин-РНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.