Методическая статья

Использование в естественных условиях и тканей и клеток экспланта подходы к изучению морфогенеза и патогенез эмбриональных и перинатальной аорты

DOI:

10.3791/56039

⸱

12 сентября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine, 2Department of Neurology, Yale University School of Medicine, 3Department of Neurology, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной мышиных аорты, используя в vivo Клональный анализ и сопоставление судьба, аорты эксплантов и изолированных гладких мышц, которые подробно клетки здесь. Эти разнообразные подходы облегчить расследование морфогенеза эмбриональных и перинатальной аорты в нормальное развитие и патогенезе заболеваний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аорты является крупнейшим артерий в организме. Аорты стена состоит из внутреннего слоя эндотелиальных клеток, средний слой знакопеременных упругих ламелей и гладкомышечные клетки (SMCs) и наружный слой фибробластов и внеклеточного матрикса. В отличие от широко распространенной изучение патологических моделей (например, атеросклероз) в взрослых аорты гораздо меньше известно о эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь, мы ориентируемся на SMCs и предоставить протоколы для анализа Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной aortic SMCs нормального развития и болезней. В частности, являются четыре протоколы включены: я) в естественных условиях эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ; II) экспланта эмбриональных аорты культуры; III) SMC изоляции от перинатальной аорты; и iv) подкожной осмотического мини-насос размещение в беременных (или небеременных) мышах. Таким образом эти подходы облегчить расследование origin(s), судьба и клоновых архитектуры SMCs в аорте в естественных условиях. Они позволяют для плавного эмбриональных аорты морфогенеза в утробе матери , продолжительное фармакологических агентов. Кроме того изолированные аорты ткани эксплантах или aortic SMCs может использоваться для получения понимание роли конкретных генов цели во время основных процессов, таких как muscularization, распространением и миграции. Эти гипотезы генерации эксперименты на изолированных SMCs и explanted аорты затем может оцениваться в контексте в естественных условиях через фармакологических и генетических подходов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сосудистой системы многоклеточных организмов функции для доставки питательных веществ и кислорода к клеткам, которые не контакт с внешней окружающей среды и удаления отходов и диоксида углерода из этих клеток. В позвоночных первичной сердечно-сосудистой системы состоит из сердца, которые насосы крови через серию кровеносных сосудов. Стены из крупных кровеносных сосудов, артерий и вен, состоят из трех слоев: я) интима, или внутренний слой эндотелиальных клеток; II СМИ, или средний слой чередующихся окружности удлиненные гладкомышечные клетки SMCs и упругие ламели; и iii) адвентиции или наружный слой соединительной ткани и фибробластов. Подавляющее большинство исследований в сосудистая биология сосредоточиться на эндотелиальных клеток, расследование формирования новой эндотелиальных клеток выстроились трубок по ангиогенез. В сравнении SMCs получают относительно мало внимания. Однако SMCs являются тип критической ячейки в строительстве нормальной артериальной стенки и в сосудистой патологии.

Аорты является крупнейшим калибр артерий в организме, получении сердечного выброса из левого желудочка сердца. Она страдает от различных заболеваний человека, включая атеросклероз, аневризма и рассечение. В взрослых организмов аорты и ее ветвей крупных интенсивно учился в модели сосудистых заболеваний. Например, высоким содержанием жиров кормили мышей, которые являются null для кодирования рецепторов липопротеинов низкой плотности или аполипопротеин E, ген развитие атеросклероза, и недавние судьба сопоставления исследования показывают, что существующие SMCs порождают множественные типы клеток в 1атеросклеротических бляшек. В аневризмы аорты патологические изменения включают SMC апоптоза и внеклеточного матрикса, Ремоделирование2,3.

Значительно меньше известно относительно SMC морфогенеза и патогенез периоды эмбрионального и перинатальной. Здесь мы предоставляем протоколы для изучения эмбриональных и перинатальной аорты SMCs в естественных условиях, в ткани эксплантов и изолированных клеток. Например первый раздел протокола определены судьба сопоставления и Клональный анализ в эмбриональных мышей. CRE рекомбиназа выразил под контролем клетки конкретной промоутера облегчает маркировка отдельных ячеек и их потомства4,5,6; Однако временной контроль клеток конкретных маркировки может быть сложным во время эмбрионального развития у мышей. В этом контексте с эмбрионами, выражая условного CreER под промоутер активно SMCs (e.g.,Myh11 или Acta2) и Cre репортер, мы предоставляем методы для инъекций тамоксифен или его активный метаболит 4-OH-тамоксифен в беременных плотин и для анализа помечены клетки эмбрионов или послеродовой потомство. Кроме того в отличие от судьбы картографические исследования, которые преимущественно используют Cre Репортеры с один репортер Флюорофор1,7, Клональный анализ существенно повышается с многоцветной Cre журналистами.

Второго и третьего протокола описаны методы для изоляции и культивировании эмбриональных эксплантов аорты и аортального SMCs от новорожденных, соответственно. Эти подходы позволяют для манипулирования сигнальных путей, специально в аортальной эксплантов или SMCs и для анализа прямых последствий фармакологических агентов. Таким образом роль конкретных генов в тканях интерес может проверяться в гораздо более быстрой моды чем через традиционные генетические манипуляции в мышах. Кроме того отдельные исследования SMC облегчить анализ миграции клеток и адгезии, которые технически являются ограниченными в естественных условиях.

Наконец в четвертом разделе протокол очерчивает размещения подкожной осмотического мини-насос, загружен с фармакологическими агентами в беременных (или небеременных) мышах. Этот метод облегчает анализ воздействия на эмбриональное развитие, вызванные агентов, которые требуют постоянного притока из-за быстрого метаболизма. Альтернатива частые инъекции не является практичным для многих агентов и следует избегать, так как это может вызвать значительный дискомфорт в беременных дам.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

все протоколы мыши утверждаются институциональный уход животных и использования Комитетом в Йельском университете.

1. In Vivo эмбриональных судьба картирования и Клональный анализ

Примечание: мы использовали эти подходы широко для оценки происхождение клеток и их клоновых архитектуры в модели развития и болезней 7 , 8 , 9 , 10.

  1. создана спаривания между мышей с CreER и мышей с репортером Cre.
    Примечание: CreER используется для SMC маркировки; Myh11-CreERT2 или Acta2-CreERT2 мышей 11 , 12 обычно используется для этой цели. Мы использовали ROSA26R-CreERT2 мышей 13 широко маркировки эмбриональных тканей.
    1. Для Клональный анализ, использовать многоцветные Cre репортер (например, конфетти, или Радуга [Rb] мышей) 8 , , 14 15 и судьба картирования, использовать одноцветный Cre репортер (например, ROSA26R-рекламы ЯФП мышей 16) или двойной цвет Cre репортер ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG)- 17.
      Примечание: Эта схема разведения использует взрослых мышей, которые 2-6 месяцев (обычно ~ 30 g) и будет генерировать эмбрионов с CreER и репортер Cre.
  2. Проверить вагинальных свечей в утром, используя металла зонда и рассмотреть полдень на день обнаружения вилка как эмбриональные день (E) 0,5.
  3. Отдельные женщины от мужчины при обнаружении вилкой.
  4. Подготовка 4-OH-тамоксифен и тамоксифен рабочие решения.
    1. Для 4-OH-тамоксифен, растворяют 5 мг в 50 мкл, 100% этанола, вихревые для 2 мин и затем мкл 450 кукурузного масла. На льду sonicate на 2 уровне вывода для 10 s циклов с отдыха между циклами до тех пор, пока образец охлаждает вниз. После того, как образец полностью не растворится (обычно ~ 4-5 циклов sonication), Возьмите 200 мкл sonicated раствора и растворить в 1800 мкл кукурузного масла, чтобы сделать окончательный рабочий раствор (4-OH-тамоксифен, 1 мг/мл).
    2. Для тамоксифен, разбавляют до 50 мг/мл в 100% этанола и вихревой до тех пор, пока она растворяется. Разбавляют в кукурузном масле, чтобы сделать окончательный рабочий раствор (тамоксифен, 10 мг/мл) и перемешать в 45 ° C, чтобы обеспечить, что он полностью не растворится.
  5. Для ранних эмбриональных индукции, придать 4-OH-тамоксифен внутрибрюшинно беременных дам.
    1. Использовать 4-OH-тамоксифен инъекции (до ~ 150 мкг на беременных мышь, или примерно 5 мг/кг массы тела) на E5.5 и в дальнейшем, поскольку они дают жизнеспособные плотины, эмбрионы и детенышей.
    2. Использование тамоксифен в дозах 0,5 - 1,5 мг (или 17-50 мг/кг) для плотин беременных с эмбрионами в ~ E9 и в последующий период. Используйте иглой 30G для всех инъекций.
      Примечание: Фильтрации через фильтр 0,22 мкм обычно используется для стерилизации все смеси до инъекции.
  6. Для Клональный анализ, используйте внутрибрюшинной инъекции высоких доз 4-OH-тамоксифен (например, 5 мг/кг) или тамоксифен (например, 50 мг/кг) для обозначения нескольких ячеек.
    1. Отметить отдельные ячейки, титровать вниз дозы 4-OH-тамоксифен или тамоксифен, таким образом, что в тканях интереса (то есть, аорты), почти все эмбрионы, проанализированы (как описано ниже в конце данного раздела) имеют либо не помечены и только ячейки одного цвета; это порог дозы.
  7. Отметить ячейки в середине конце гестационного периода и проследить их судьбе или clonality в постнатальном мыши, привнести прогестерона в полость внутрибрюшинного беременных дам сопутствующе обстоятельств тамоксифен в 1:2 (прогестерон: Тамоксифен) соотношение доза.
    Примечание: Тамоксифен дозы 17-50 мг/кг и прогестерон дозы 8,5-25 мг/кг (т.е., половина тамоксифен доз). Прогестерон инъекции может задержать труда ~ 1-2 дней.
  8. Euthanize плотины, беременных с эмбрионами желаемый возраст с помощью метода открытой падения, где плотина помещается в сосуд, содержащий хлопка или марлей смоченной неразбавленный изофлюрановая. Подтвердить смерть, открыв грудную полость побудить пневмоторакса, удалив жизненно важных органов или выполняя шейки матки вывихов.
  9. Очистить живота с 70% этиловом спирте. Используйте ножницы, чтобы разрезать живот и вскрыть вне матки. Удалите из матки эмбрионы и осторожно отделить эмбрионы от плаценты и желточного мешка, используя пинцет.
  10. Усыпить эмбрионов в E15 или старше, выполняя шейки матки вывих или обезглавливание с Ножницы хирургические или острым лезвием.
    Примечание: Эмбрионов моложе E15, быстро умирают после эвтаназии матери и/или удаление эмбрионов от матери.
  11. Эмбрионы в ледяной PBS и вырезать небольшой кусок хвост с помощью ножниц в генотипе CreER и Cre репортером.
  12. Исправить эмбрионов в параформальдегида 4% на 4 ° C на 2 ч. мыть эмбрионов три раза в PBS и затем инкубировать эмбрионов в 30% сахарозы в ФБР в 15 мл трубки, ожидание до тех пор, пока они раковины, которые может занять до двух дней и.
  13. Заполнения пластиковые замораживание формы до 2/3 максимального уровня с оптимальной резки температуры (OCT) соединения. Место каждого эмбриона вертикально в плесени, полностью погружен в инкубировать Окт 10 мин при комнатной температуре (RT) для сведения к минимуму пузыри.
  14. Место замораживание блоков ткани upright в сухой лед, 70% этанол ванна для замораживания. Храните блоков на -80 ° C.
  15. Установите криостата температуру до-22 ° C и вырезать блоков для создания поперечных секции через весь аорты, толщиной 10-20 мкм. Сухие слайды в РТ за 30 мин до их хранение на -80 ° C.
  16. Оттепель слайды на RT, защищенном от света во избежание обесцвечивания флуорофоров. Вымойте слайды с PBS-Tween20 0,1%.
    1. Для Клональный анализ, пятно слайды для ядер (DAPI, 5 мг/мл) и непосредственно изображения других флуорофоров в Rainbow Cre репортер (Церулеан: 433-Нм возбуждения Макс, 475 Нм выбросов Макс; mOrange: 548 Нм, 562 Нм; mCherry: 587 Нм, 610 Нм).
      1. Используйте следующие фильтры для обнаружения флуорофоров с вертикально флуоресцентный микроскоп: DAPI (возбуждения Макс/пропускания 350/50 Нм, выбросов Макс/пропускная способность 460/50 Нм), Лазурный (возбуждения 436/20 Нм, выбросов 480/40 Нм), Техас красный (возбуждения 560 / 40 Нм, выбросов 630/75 Нм) и настраиваемый фильтр, чтобы отделить mCherry от mOrange (возбуждения 577/10 Нм, выбросов 630/50 Нм).
    2. Для сопоставления судьбу с mTmG Cre репортер, обнаружить GFP (484 Нм, 510 нм), либо непосредственно изображений или с помощью иммуноокрашивания. Для изображений с вертикально флуоресцентный Микроскоп использовать фильтр GFP (возбуждения 470/40 Нм, выбросов 525/50 Нм).
    3. Для иммуноокрашивания, инкубировать секции с первичных антител на ночь при 4 ° C, мыть с 0,1% тритон X-100 в PBS и затем инкубации с вторичные антитела на 1 ч. использование анти CD31 (конечная концентрация 0,0016 мг/мл), анти GFP (0,006 мг/мл) и Cy3-непосредственно конъюгированных анти SMA (окончательное разведение 1: 500) первичных антител и использование вторичных antibodies, непосредственно конъюгированных флуорофоров (окончательное разведение 1: 500) (см. Таблицу материалы).
  17. Изображения слайдов с вертикально флуоресцентный микроскоп (увеличение: 4 X - 20 X) или конфокального микроскопа (10 X-63 X). Для большого увеличения, используйте конфокальный изображений 63 x нефти цель с числовой апертуры 1.4-0,6 и размер кадра 1 024 x 1 024 пикселей.

2. Explant эмбриональных аорты культуры

Примечание: этот подход использовался ранее для оценки роли Интегрин beta3 в стеноз описаны АНО (- / -) эмбриональных аорто- 9 , 18.

  1. усыпить приурочен беременных плотины на E15.5 при вдыхании избыток изофлюрановая, в соответствии с шагом 1.8, выше.
  2. Урожай и усыпить эмбрионы, согласно шаги 1.9-1.10, выше.
  3. Supinely положение эмбриона и ПИН-кода расширенного конечностей в Правление рассечение. Визуализация с стереоскоп диссекции и используйте ножницы, чтобы вырезать вертикальный разрез от живота через грудины к верхней грудной клетки. Вскрыть прочь тимуса, трахеи, легких, пищевода, печени и кишечника.
  4. Осторожно потяните сердце вентрально с помощью щипцов и используйте ножницы, чтобы вскрыть аорты от спинной части грудной и брюшной полостей. Чтобы освободить аорты, сократить его в корне проксимальных и дистальных брюшной позиций.
  5. Место аорты в ледяной стерильные PBS в капюшоне культуры клеток. Передавать 24-ну плита аорты и культура в среде DMEM с 0,5% FBS для до 24 ч при 37 ° C.
    Примечание: Питательной среды могут быть дополнены блокирующих антител (например, анти Интегрин αvβ3 антитела на 0,02 мг/мл 9; см. Таблицу материалов) или агента фармакологических.
  6. Вымойте аорты дважды с PBS и затем исправить ее с параформальдегида 4% за 20 мин.
  7. Мыть в три раза с PBS и передачи аорты в 1,5 мл 30% сахарозы в ФБР. После того, как раковины аорты, сделать блоков замороженные ткани, вырезать секции и имунноконтраст, как описано в шагах 1.13-1,15, выше.

3. SMC изоляции от перинатальной аорты

Примечание: этот подход в настоящее время используется для сравнения биологии aortic SMCs изолированы от АНО (- / -) и wildtype перинатальной мышей.

  1. Euthanize, мышиных pup на послеродовой день (P) 0.5, либо путем шейки матки дислокации обезглавливание с Ножницы хирургические или острым лезвием, как описано в шаге 1.10, выше.
  2. Выполнить шаг 2.3 и затем, после открытия грудной клетки и живота, пункции левого желудочка с иглой 23G. Использование пластиковых труб для подключения иглы к стерильный шприц PBS-содержащих провел вертикально на возвышенности так что PBS впадает в левого желудочка под действием силы тяжести. Разрешить вливание стерильных PBS в левый желудочек, до тех пор, пока печень бланша.
    1. Использовать щипцы для удаления adventitial ткани на внешней стороне аорты и вскрыть аорты, как описано в шаге 2.4.
  3. Дайджест аорты в единое решение DMEM (500 мкл) дополнены 225 ед/мл коллагеназы, 2,25 эластазы ед/мл и 1 x противогрибковое антибиотик-для 45 минут при 37 ° C. вручную трясти трубку каждые 5-10 мин
  4. В стерильных клетки культуры Гуд, titurate усваивается ткани, закупорить вверх и вниз с 200 мкл пипетки для создания одной ячейки подвеска. Передавать подвеска одноклеточного до 15 мл, добавить 2 мл DMEM и центрифуги на 920 x g 5 мин 25 ° C.
  5. Удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл SMC питательной среды (DMEM, содержащие 10% FBS дополнена rhFGF 1 мкг/мл, 10 мкг/мл rhEGF, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина и 2,5 мкг/мл амфотерицин B). Трансфер в 35-мм культуры тарелку.
    Примечание: После первоначального изоляции, ~ 400000 клетки получены от одного P0.5 wildtype аорты; ~ 300 000 этих клеток являются SMCs.
  6. Культура клетки при 37 ° C и изменить на свежие SMC культуры среднего каждые 3 дня. С помощью стандартных методов трипсином, проход клетки когда вырожденная. Для экспериментов, использовать клетки из отрывков 3-7.

4. Подкожной осмотического мини-насос размещение в беременных женщин (или Non беременных) мышах

Примечание: этот подход использовался ранее постоянно доставить фармакологических агентов (например, Интегрин β3 и β5 ингибитор cilengitide) до эмбриона в утробе матери 9. Насос был вставлен в беременных дам в E13.5 и до отела.

  1. Анестезировать мышей с изофлюрановая 2-5% кислорода (скорость потока 1 Л/мин) для индукции и 1-3% за обслуживание. Позволяет контролировать уровень анестезии рефлекс мыс щепотка и настройте агент анестезии при необходимости. Администрировать подкожной бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг) для анальгезии.
  2. Бритья нижней части спины с садовыми ножницами. Используйте стерильные шторы, перчатки и инструменты и поддерживать мышей на нагревательной пластинки хирургические во время операции.
  3. Место каждой мыши в лежачем положении и скраб спину betadine, следуют изопропиловый спирт. Приблизительно 3-5 см ростральной к основанию хвоста в нижней части спины, использовать скальпель сделать горизонтальный разрез 0,5 - 1,0 см в длину без ранив основные мышцы.
  4. Вставить кровоостанавливающий в разрез и создание подкожной карман рострально для имплантации насоса путем открывания и закрывания челюстей кровоостанавливающий.
  5. Заполнить осмотического мини-насос с агентом по выбору, в соответствии с производителем ' s руководящие принципы (см. Таблицу материалов). Вставьте заполненный насоса в карман и закрыть разрез с зажимами или 6-0 не рассасывающиеся швы. Убедитесь, что общее время хирургических находится менее чем в 10 минутах
  6. Постоперационно, контролировать мышей каждые 15 мин, до тех пор, пока они оправились от грудины recumbency. Администрировать подкожной бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг) каждые 6-12 ч в течение 48 часов. Когда мышей полностью оправились от общей анестезии, наблюдать за ними ежедневно. Удалять клипы или зашивает 7-10 дней после операции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Представитель клоновых анализа SMCs в мутанта эмбрионов для АНО (ген кодирования белков эластина внеклеточная матрица), АНО(+/-), Acta2-CreERT2 мышей были повязана АНО(+/-) мышах также перевозящих многоцветные ROSA26R(РБ/Rb) репортер. Как описано в шаге 1, вилки были проверены, беременных плотины были индуцированной с одной тамоксифен инъекции (1,5 мг) в E12.5, и они были принесены в жертву на E18.5. Эмбрионы были со...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В отличие от тщательного расследования мышиных аорты и ее крупных филиалов в взрослых патологических состояний, такие как модели атеросклероза меньше известно относительно Морфогенез и патогенезе эмбриональных и перинатальной аорты. Здесь мы ориентируемся на эмбриональных/перинатальной аорты, специально SMCs и предоставить протоколы для изучения в аорту через в естественных условиях, тканях экспланта, и SMC изоляции подходов. Эти бесплатные подходы обеспечивают следователь с различных подходов к изучению эмбрион...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Дин ли для обмена его лаборатории протокол для аорты SMC изоляции. Финансовая поддержка была оказана национальных институтов здравоохранения (R21NS088854, R01HL125815 и R01HL133016 к D.M.G), Американской ассоциации сердца (целевые субсидии 14GRNT19990019 до D.M.G.) и Йельский университет (Браун-Кокс стипендий до утра и запуска средства для D.M.G.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ТамоксифенSigmaT5648
Кукурузное маслоSigmaC-8267Средство для тамоксифена
4-ОН-тамоксифенSigmaH7904Активный метаболит тамоксифена
ПрогестеронSigmaP8783-5GИспользовать при половинной концентрации тамоксифена
ОКТ-соединениеСакура ткань tek4583Для изготовления криоблоков
CryomoldsPolysciences inc18986
DAPISigmaD9542IHC окрашивание ядра, конечная концентрация 5 мг/мл
Cy3 непосредственно конъюгированное анти-СМА антителоSigmaA2547IHC окрашивание СМА, окончательное разведение 1:500
Anti-CD31 антителоBD Pharmingen550274ИГХ окрашивание GFP, конечная концентрация 0,006 мг/мл
Анти-GFP антителоThermo Fisher ScientificA-11121ИГХ окрашивание CD31, конечная концентрация 0,0016 мг/мл
Вторичное антитело козы против кролика, Alexa 647Life Technologiesa21244ИГХ окрашивание, конечная концентрация 0,004 мг/мл
Вторичное антитело козы против кролика, Alexa 488Life Technologiesa11008ИГХ окрашивание, конечная концентрация 0,004 мг/мл
ДМЭМThermo Fisher Scientific10567-014Для клеточной культуры
FBSThermo Fisher Scientific10437028
антиинтегрин бета3 блокирующее антителоBD Biosciences553343клон 2C9. G2, конечная концентрация 0,02 мг/мл
КоллагеназаWorthington Biochemical Corp44H14977AДля переваривания эластазы аорты
Worthington Biochemical Corp34K15139Для переваривания аорты
Антибиотик-антимикотик (100X)Thermo Fisher Scientific15240062
Рекомбинантный человеческий FGFPromegaG5071
Рекомбинантный человеческий EGFPromegaG5021
Пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140122
Амфотерицин BThermo Fisher Scientific15290026
Планшеты для культуры тканейCorningCLS430165
Alzet осмотический мини-насосDurect Corporation2001
ECLIPSE 80i Вертикальный Флуоресцентный микроскопNikon 
  TCS  SP5Соникатор Leica
Branson 450VWR
Myh11-CreERT2 мышиЛаборатория Джексона 19079
Acta2-CreERT2Получено из лаборатории доктора Пьера Шамбона и Даниэля Мецгера
ROSA26R-CreERT2мышей Лаборатория Джексона 8463
ROSA26R(mTmG/mTmG) мышейЛаборатория Джексона  
мышей ROSA26R(EYFP/EYFP)Лаборатория Джексона   006148 
ROSA26R(Конфетти/Конфетти) мышиЛаборатория Джексона 13731
ROSA26R(Rb/Rb) мышейЛаборатория доктора Ирва ВайсманаПолучено из лаборатории доктора Ирва Вайсмана
мышей 026862

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
  2. Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
  3. Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
  4. Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
  5. Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
  6. Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
  7. Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
  8. Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
  9. Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
  10. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
  11. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
  12. Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
  13. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
  14. Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
  15. Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810(2014).
  16. Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4(2001).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
  18. Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
  19. Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
  20. Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
  21. Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
  22. Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
  23. Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
  24. Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
  25. Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
  26. Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
  27. Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
  28. Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
  29. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
  30. Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivo

Похожие статьи