Method Article

Высокопроизводительного скрининга для наследования на основе белков в S. cerevisiae

DOI:

10.3791/56069

⸱

August 8th, 2017

 , 
1Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает высок объём методологию функционально экран для наследования на основе белков в S. cerevisiae.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кодирование биологической информации, доступной для будущих поколений обычно достигается через изменения в последовательности ДНК. Долгоживущих наследования, закодированные в конформации белка (а не последовательность) долго рассматривалась как сдвиг парадигмы, но редко. Лучше всего характеризуется примеры таких эпигеномные элементов являются прионы, которые обладают самостоятельной сборки поведение, которое может управлять наследуемое проявление новых фенотипов. Многие архетипической прионов отображения ярких предвзятости последовательности N/Q-богатые и собрать в амилоида лоно. Эти необычные свойства сообщили большинство скрининг усилия по выявлению новых прионных белков. Однако по крайней мере три известных прионы, (в том числе основателей прионы, ОТРSc) не гавань этих биохимических характеристик. Поэтому мы разработали альтернативный метод прозондирует область на основе белков наследования на основе свойства массовых действий: переходных гиперэкспрессия прионных белков увеличивает частоту, на которой они приобретают конформации self шаблонов. Этот документ описывает метод для анализа дрожжей ORFeome способность добиться на основе белков наследования. Используя эту стратегию, мы ранее обнаружил, что > 1% белков, дрожжи могут топлива появление биологических черт, которые были долгоживущих, стабильной и возникают чаще, чем генетической мутации. Этот подход может быть использован в высокой пропускной способности через весь ORFeomes или как целенаправленного скрининга парадигмы для конкретных генетических сетей или экологических раздражителей. Так же, как вперед генетических экраны определяют многочисленные пути развития и сигнализации, эти методы обеспечивают методологию для исследовать влияние наследования на основе белков в биологических процессах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Биологические системы часто испытывают временные колебания в изобилии белка. Ли они имеют долговременное воздействие на формирование фенотип организма или будущих поколений остается неясным. Известных экземпляров этой биологии включать редкие класса белков, прионы, подталкивающих появление наследственные черты без модификации генома. Вместо этого эти проteinaceous и вобструктиным частицы передают фенотипов через самоподдерживающиеся изменения конформации белка1,2. Этот тип наследования был обнаружен в качестве причины необычной наследования шаблонов разрушительные нейродегенеративных заболеваний. Однако исследования в организмах, начиная от грибов до млекопитающих3,4,5,6,,78,9,10 с тех пор показали, что китовая птичка как элементы могут иметь значение adaptive. Тем не менее прионы были осмотрены как увлекательная, но редких биологических странность.

Этот сложившейся мудрость проводится в части потому что характеристика на основе белков наследования давно были ограничены небольшим набором примеров. Недавние усилия систематического отбора значительно расширили эту картину путем выявления несколько новых bona fide прионов11 и белка почти двух десятков доменов12 мощностью до конформационные конверсии топлива китовая птичка как. Однако потому что эти подходы как правило сосредоточены на сильных аминокислот последовательности предубеждения, прионы, которые были обнаружены поделиться биохимические свойства основателей дрожжи прионов [PSI+]13,14,15[URE3] и [RNQ+]11,16. К ним относятся: 1) Модульная домены, которые богаты длинные полимерные тянется аспарагин (N) и (Q), глютамин 2) Ассамблея в амилоида [китовая птичка+] конформации17,18,19и 3) завершить зависимость disaggregase функции Hsp104 для верных распространения от матери к дочери13,,2021. Действительно, многие bona fide прионы, включая [Гар+], [Het-s] и даже оригинальные китовая птичка (ScPrP), будет не хватать под такие строгие критерии. Возможно более важно, они будут не в состоянии захватить любых новых механизмов на основе белков наследования22. Таким образом истинный биологических ширина таких явлений может быть гораздо более общий характер, чем предполагалось ранее.

Расследовать этот вопрос, было занято высокой пропускной способностью, протеома общесистемной стратегии. Отличительной чертой всех прионы, включая PrPSc, [Гар+], и [Het-s], что переходные гиперэкспрессия причинной белков сильно увеличивает скорость прионных приобретение15,23,24,25,26. Мы воспользовались эта возможность систематически во всем дрожжей ORFeome, спросить, если стабильной основе белка, эпигенетических государств мог бы быть инициирован временно вызывая гиперэкспрессия индивидуальных белков. Это хорошо известно, что гиперэкспрессия белка может изменить фенотипов27. Однако прионных белков являются необычными, потому что их временные перепроизводства производит изменение фенотипа, что наследственные многие сотни поколений после первоначального гиперэкспрессия. Мы ранее принял преимущество этой функции, а также необычные наследования шаблонов на основе белков генетические элементы, чтобы определить десятки белков, которые способны heritably повторной проводки фенотипические пейзажи без изменения генома28. Хотя некоторые выявленные белков ранее были известны как прионы, большинство не было, подчеркнув сила этого подхода для выявления новых форм на основе белков наследования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Первоначальное сверхвыражение

  1. Трансформируйте дрожжевые клетки (в данном случае BY4741 MAT a гаплоиды), ранее выращенные в жидкости YPD (10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона и 20 г глюкозы на 1 л) с нужными конструкциями-кандидатами из библиотеки FLEXGene ORFeome (дрожжевые ORFs под контролем галактоз-индуцируемого промотора в URA3-маркированном центромерномплазмидном каркасе, pBY01129).
  2. Используйте автоклавные зубочистки, чтобы выбрать четыре отдельные колонии из этих преобразований, которые будут служить биологическими репликами. Выращивают их в течение 48-72 ч в 150 мкл SRaffinose-URA (0,74 г CSM-URA, 6,7 г дрожжевого азота без аминокислот и 20 г рафинозы на 1 л) в 96-луночных планшетах. Инокулировать колонии из первого КИН в лунку А1 всех планшетов, колонии из второго КИН в А2 всех планшетов и т.д.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы роста проводятся при 30 °C и атмосферном уровнеCO2 (407,05 ppm), если не указано иное.
  3. Убедитесь, что культуры насыщены (клетки видны на глаз на дне каждой лунки) и используйте робота для работы с жидкостями для инокуляции массива 1:4 объемом 1 мкл из каждой лунки с 96-луночным планшетом в 4 отдельные лунки 384-луночного планшета, заполненного 45 μл SGal-URA (0,74 г CSM-URA, 6,7 г дрожжевого азота без аминокислот, и 20 г галактозы на 1 л) на лунку.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: При этом создается композитная пластина, в которой 4 биологические реплики каждого ORF расположены в квадратном узоре.
  4. В то же время готовят отдельные 384-луночные планшеты, содержащие 45 мкл SGal-URA с интересующими стрессорами (например, хлоридом марганца при концентрации 20 мМ) на лунку. Прививаем эту пластину таким же образом, как на шаге 1.3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наибольшего динамического диапазона для фенотипического обнаружения рекомендуется использовать 2-кратный ряд разведения вокруг концентрации LD50 данного стрессора. Это можно сделать заранее, чтобы определить оптимальную концентрацию, при которой следует наблюдать как усиленный, так и пониженный рост.
  5. В качестве заключительного параллельного контроля инокулируйте третий 384-луночный планшет таким же образом, с тем же стрессором, включенным в среду, который не будет индуцировать экспрессию плазмид. Убедитесь, что планшет содержит 45 мкл SD-URA (0,74 г CSM-URA, 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот и 20 г глюкозы на 1 л) на лунку и заведен в соответствии с этапами 1.3 и 1.4.
  6. Немедленно поместите планшеты с ячейками на укладчик микропланшетов и установите протокол на 72-часовой непрерывный цикл, измеряя наружный диаметр600 с помощью считывателя микропланшетов, оснащенного укладчиками, при комнатной температуре и атмосферномCO2 (407,05 ppm).<бр/> Примечание: Частота измерения роста будет зависеть от количества пластин (в конечном счете определяемого количеством генов и состояний, которые исследователь хочет исследовать), используемых в прогоне. Чем больше пластин используется, тем больше времени потребуется считывателю пластин для завершения цикла и, следовательно, больше времени между измерениями (время измерения одной пластины составляет ~45 с, в зависимости от используемого прибора).
  7. После измерений роста используйте того же робота для работы с жидкостями для переноса 1 мкл на лунку культур, индуцированных SGal-URA (т.е. тех, у которых наблюдалась гиперэкспрессия белка) в новые 384-луночные планшеты, содержащие 45 мкл SD-URA на лунку (среда, которая не допускает экспрессии белка плазмиды).
    1. Параллельно проводят аналогичные инокуляции второго набора 384-луночных планшетов, содержащих 45 мкл SD-URA на лунку, из культур, выращенных в SD-URA в присутствии стрессоров (т.е. из этапа 1.5).
    2. Выращивайте тарелки в течение 48 часов при 30 °C до насыщения в увлажненной камере (т.е. в герметичном пластиковом контейнере с влажным бумажным полотенцем внутри).
  8. Возьмите планшеты с предыдущего этапа и повторно инокулируйте 1 μL на лунку в 384-луночных планшетах, содержащих 45 μL SD-URA. Затем проведите отдельную повторную инокуляцию 1 мкл на лунку с той же исходной пластины в отдельную 384-луночную пластину, содержащую 45 мкл SD-URA с ударителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит определить, сохраняются ли фенотипы чувствительности/резистентности к стрессору после прекращения сверхэкспрессии белка.
  9. Немедленно поместите планшеты с ячейками на укладчик микропланшетов и настройте протокол на 48-часовой непрерывный цикл измерения наружного диаметра600 с помощью считывателя микропланшетов при комнатной температуре и атмосферномCO2 (407,05 ppm).
  10. Экспортируйте измерения времени в зависимости от наружного диаметра600 в виде таблицы XY с помощью программного обеспечения для считывания пластин. Сгруппируйте столбцы OD600 для каждой биологической реплики вместе и рассчитайте среднее значение. Создайте график времени XY в зависимости от OD600 для построения кривых роста.
    1. Сравните темпы роста культур, которые были подвергнуты прошлой сверхэкспрессии (т.е. тех, которые первоначально индуцировались в среде, содержащей галактозу, до повторного инокуляции в SD-URA), с культурами, которые этого не делали (т.е. тех, которые размножались в глюкозе), как описано ранее30.
  11. Для культур, которые демонстрируют значительные различия в росте в ответ на данный стрессор, зависящие от сверхэкспрессии предкового белка, берут 1 мкл из каждого биологического репликата, разводят его в 10 мл воды, а затем наносят 50 мкл на планшеты, содержащие 5-FOA (0,74 г CSM-URA, 1 г 5-FOA, 50 мг урацила, 6,7 г дрожжевого азота без аминокислот, 20 г глюкозы и 20 г агара на литр). Выращивайте при 30 °C в течение 3 дней.
    1. Если это приводит к слишком большому или слишком малому количеству колоний на планшете, отрегулируйте коэффициент разбавления соответствующим образом.
      Примечание: 5-ФОА превращается в токсичный промежуточный продукт путем биосинтеза урацила. Это приведет к потере URA3-маркированной экспрессии плазмиды, преобразованной на первом этапе.
  12. Выберите 8-32 одиночные колонии с помощью автоклавных зубочисток и прикрепите их к 96-луночным планшетам, содержащим 150 мкл SD-CSM. Выращивайте до насыщения в течение 48-72 ч в увлажненной камере при 30 °C. Используйте эти культуры для инокуляции двух новых наборов 96-луночных планшетов, содержащих 150 мкл SD-CSM, как со стрессорами, указанными на этапе 1.11, так и без них.
  13. Поместите планшеты на укладчик микропланшетов и установите протокол для измерения наружного диаметра600 в непрерывном цикле в течение 48 часов.
  14. Проанализируйте данные, как показано на шаге 1.10, и подтвердите, что значительные различия в росте, наблюдаемые на шаге 1.10, сохраняются после потери плазмид><. Примечание: Эти клетки содержат стабильные фенотипические состояния, которые могут указывать на наследование на основе белка.
  15. Проверьте клетки, которые поддерживали индуцированные фенотипы, на классические признаки наследования на основе белка (см. ниже).

2. Тесты на прион-подобное наследование

  1. «Отверждение», опосредованное шапероном
    1. Тест на зависимость от шаперона Hsp104.
      1. Выберите колонию штамма дрожжей, несущего стабильное фенотипическое состояние, разделите на одиночные колонии на планшете YPD (10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г глюкозы и 20 г агара на 1 л), содержащем 3 мМ GdnHCl, и выращивайте при 30 °C в течение 3 дней. Параллельно таким же образом выделите колонию из наивного штамма в одиночные колонии на YPD+ 3 mM GdnHCl в качестве контроля.
      2. Повторите еще 2 раза на свежих планшетах YPD, содержащих 3 мМ GdnHCl.
      3. Поскольку воздействие GdnHCl может увеличить частоту возникновения миниатюрных клеток, выберите несколько колоний, которые претерпели 3 пассажа на GdnHCl, и проверьте функциональное митохондриальное дыхание, исследуя их способность расти в видимые колонии на пластинах YP-глицерина (10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 мл глицерина и 20 г агара на 1 л) через 7 дней.
      4. Выберите несколько колоний из YP-глицериновых пластин и проверьте поддержание стабильных фенотипических состояний с использованием роста в присутствии стрессора по сравнению с не«вылеченными» и наивными (т.е. изогенными клетками, которые не имеют фенотипического состояния, такими как BY4741 MATa гаплоидами) контрольной группой аналогично описанному в шаге 1.13.
    2. Проверьте зависимость от шаперона Hsp70.
      1. «Лечение» с помощью плазмиды.
        1. Трансформируйте как наивные клетки, так и клетки со стабильными фенотипическими состояниями с помощью URA3-меченых плазмид, экспрессирующих доминантный негативный аллель Hsp70 (K69M)25,31 из сильного конститутивного промотора (GPD).
        2. Выберите по одному трансформанту для каждого, разделите на отдельные колонии на планшете SD-URA (0,74 г CSM-URA, 6,7 г азотной основы дрожжей без аминокислот, 20 г глюкозы и 20 г агара на 1 л) и выращивайте в течение 3 дней при 30 °C и атмосферномCO2.
        3. Повторите это прохождение еще 2 раза на планшетах SD-URA.
        4. Выберите несколько колоний и переходите к одиночным колониям на пластинах 5-FOA, чтобы уничтожить плазмиду.
        5. Выберите несколько одиночных колоний для каждого изолята и проверьте сохранение (или потерю) стабильных фенотипических состояний таким же образом, как описано в шаге 1.13.
      2. «Лечение» путем генетического скрещивания.
        1. Скрещивание BY4741 MAT— гаплоидные штаммы, несущие стабильные фенотипические состояния, и наивные штаммы противоположного типа спаривания (в данном случае BY4742 MATα), несущие генетические делеции в двух из четырех дрожжевых паралогов Hsp70 (ssa1Δ ssa2Δ).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Этот штамм имеет недостаточную функцию шаперона Hsp70.
        2. Отбирают для роста диплоидов путем разбиения на одиночные колонии на среде SD-LYS-MET (0,74 г CSM-LYS-MET, 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот, 20 г глюкозы и 20 г агара на 1 л).
        3. Соберите одиночные диплоидные колонии и выращивайте в течение 24 ч при 30 °C в 8 мл предварительной среды для спороношения (0,8% дрожжевого экстракта, 0,3% пептона, 10% декстрозы и 100 мг/л сульфата аденина).
        4. Убавьте культуры в течение 3 минут при 3 000 xg, отсадите среду предварительного спороношения (pre-SPO) и промойте гранулы стерильной водой.
        5. Повторно суспендируйте гранулы в 2 мл споруляционной среды (1% ацетата калия, 0,1% экстракта дрожжей, 0,05% глюкозы и 0,01% аминокислот с добавлением смеси (2 г гистидина, 10 г лейцина, 2 г лизина и 2 г урацила)). Выращивайте при температуре 25°C в течение 5 дней.
        6. Увеличьте температуру культуры до 30 °C и инкубируйте еще 48 часов.
        7. Оцените эффективность спорообразования, найдя наличие тетрад с помощью светового микроскопа32.
        8. Возьмите 40 мкл культуры, уменьшите в течение 1 минуты при 3000 xg в пробирке объемом 1,5 мл и повторно суспендируйте в равном объеме смесь ферментов зимолязы (1 М сорбит, 0,1 М ЭДТА и 10 мг/мл зимолязы 100 Тл)
        9. Выдерживать при температуре 25 °C в течение 5 минут.
        10. Нанесите 10 мкл переваренной культуры на очень сухую, очень ровную агаровую пластину YPD и дайте культуре медленно распределиться вниз по пластине по прямой линии.
        11. Дайте пластинам высохнуть не менее 30 минут в колпаке с ламинарным потоком.
        12. С помощью диссекционного микроскопа разделите споры на тетрады и расположите их на пластине.
        13. Дайте отдельным гаплоидным спорам вырасти в колонии и проверьте их способность расти на пластинах SD-HIS-LEU (0,67 г CSM-HIS-LEU, 6,7 г дрожжевого азота без аминокислот, 20 г глюкозы и 20 г агара на 1 л), указав, что они содержат обе генетические делеции (ssa1Δ ssa2Δ).
        14. Проверьте каждый из них на поддержание фенотипического состояния на фоне дефицита Hsp70 способом, аналогичным описанному в шаге 1.13.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Скрещивание этих спор обратно в штамм дикого типа с восстановленной функцией Hsp70 не должно восстанавливать фенотип прионов.
  2. Тестирование на неменделевское наследование.
    1. Скрещивание BY4741 MATгаплоидных штаммов, несущих стабильные фенотипические состояния и изогенный наивный контроль, с изогенным наивным штаммом противоположного типа спаривания (в данном случае BY4742 MATα).
    2. Отбор для роста диплоидов путем разбиения на одиночные колонии на среде SD-LYS-MET с двойным выпадением.
    3. Соберите одиночные диплоидные колонии и выращивайте в течение 24 ч при 30 °C в 8 мл среды, предшествующей спороношению.
    4. Повторите шаги 2.2.2.3-2.2.2.12, как описано выше.
    5. Дайте отдельным гаплоидным спорам вырасти в колонии и проверьте каждую из них на поддержание фенотипического состояния с помощью мейоза с помощью анализа роста, как в шаге 1.13.
      Примечание: Еще одной определяющей особенностью прионов является то, что они могут быть наследственно устранены путем удаления исходного случайного белка. Таким образом, аналогичное скрещивание прионного штамма со штаммом, несущим генетическую делецию исходного индуцированного белка, приведет к отмене фенотипов прионов в спорах, которые наследуют делецию. Также обратите внимание, что прион может поддерживаться в «скрытом» состоянии у такого мутанта, если удаленный ген необходим для проявления фенотипа приона, но не для размножения самого приона. Чтобы различить эти две возможности, скрещивайте споры обратно в наивный штамм дикого типа и проверяйте, проявляется ли фенотип приона вновь в диплоидном генетическом фоне, где функция гена была восстановлена.
  3. Цитодукция.
    1. Создание исходного штамма-реципиента BY4742.
      1. С помощью преобразования введите дефектный аллель KAR (kar1-15), который предотвращает ядерный синтез во время спаривания23.
      2. Сделайте этот штамм «миниатюрным» (т.е. неспособным к митохондриальному дыханию), введя одну колонию в бульон YPD с 0,25% бромида этидия.
      3. Выращивайте культуру при 30 °C до поздней экспоненциальной/стационарной фазы (наружный диаметр600 ~ 1).
      4. Разведите 1:1,000 в свежем YPD с 0,25% бромида этидия и повторите дважды.
      5. Как только культура достигнет поздней экспоненциальной/ранней стационарной фазы (OD600 0,8-1,2), разбавляют отдельные колонии, разводя 1:10 000 в стерильной воде и помещая 50 μL на планшет YPD. После выращивания в течение 3 дней при 30 °C выберите несколько колоний и проверьте каждую на нарушение дыхания, изучив их способность превращаться в видимые колонии на пластинах YP-глицерина через 7 дней.
    2. Выполните начальную цитодукцию в BY4742.
      1. Смешайте клетки донорского штамма BY4741, несущего стабильное фенотипическое состояние, с клетками наивного штамма-реципиента BY4742 kar1-15 на поверхности агаровой пластины YPD.
      2. Выращивать в течение 24 ч при 30 °C и атмосферномCO2 (407,05 ppm) и перенести в среду с метионином, содержащую глицерин (SGly-MET: 0,74 г CSM-MET, 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот, 20 мл глицерина и 20 г агара на 1 л).
        Примечание: Это позволяет отбирать оба ядерных маркера BY4742, а также восстанавливать функциональные митохондрии с помощью цитоплазматического обмена.
      3. Через 3-5 дней выберите несколько одиночных колоний и проведите еще один раунд отбора на SD-MET (0,74 г CSM-MET, 6,7 г дрожжевого азота без аминокислот, 20 г глюкозы и 20 г агара на 1 л).
      4. Параллельно подтвердить, что колонии не являются диплоидами, путем пассирования на среду SD-LYS-MET.
    3. Проводят обратные цитодукции.
      1. Смешайте новые донорские штаммы (на этот раз успешные цитодуктанты BY4742 kar1-15) с миниатюрными наивными клетками BY4741 (сгенерированными, как описано выше) на агаре YPD.
      2. Повторите цитодукцию, как описано ранее (этапы 2.3.2.1-2.3.2.4), за исключением отбора ядерных маркеров реципиента BY4741 на глицериновой среде, лишенной лизина (SGly-LYS: 0,74 г CSM-LYS, 6,7 г азотного основания дрожжей без аминокислот, 20 мл глицерина и 20 г агара на 1 л).
      3. Выберите несколько цитодуктантов и проверьте на поддержание стабильных фенотипических состояний с помощью анализа роста, как описано в шаге 1.13.
  4. Трансформация белка.
    1. Приготовьте лизат.
      1. Вырастите 50 мл клеток, несущих стабильные фенотипические состояния, в YPD в течение 18 ч при 30 °C.
      2. Гранулируйте культуры при 3 000 х г в течение 4 минут, а затем промойте дважды: один раз в автоклавном H2O, а затем в 1 М сорбите.
      3. Повторно суспендируйте клетки в 200 мл буфера SCE (1 М сорбит, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 100 мМ цитрата натрия и 1 таблетка ингибитора протеазы без мини-ЭДТА на 50 мл, pH 5,8) с 50 Ед/мл литического фермента дрожжей 100 Тл.
      4. Выдерживайте смесь при температуре 35 °C в течение 30 минут.
      5. Ультразвук в клетках с частотой 20 кГц и интенсивностью 20% в течение 10 с на льду с помощью звукового дисмембранора.
      6. Удалите остатки клеток центрифугированием при температуре 10 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
      7. Переместите надосадочную жидкость в чистую пробирку и добавьте РНКазу I и биотинилированную ДНКазу в 3-кратном избытке (согласно единицам активности) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
      8. Удалите ДНКазу I, добавив избыток стрептавидин-агарозных гранул, инкубируйте в течение 5 минут и гранулируйте центрифугированием при 10 000 x g в течение 1,5 минут.
      9. Переложите надосадочную жидкость в свежую трубку.
    2. Подготовьте для реципиента сферопласт.
      1. Вырастите 5 мл наивных клеток-реципиентов в YPD до среднеэкспоненциальной фазы (OD600 в диапазоне 0,5-1).
      2. Соберите урожай центрифугированием (3 000 x g в течение 4 минут) и промойте 4 раза: дважды в H2O и дважды в 1 М сорбите.
      3. Повторно суспендируйте клетки в 1 М сорбитоле, содержащем 200 Ед/мл дрожжевого литического фермента, и инкубируйте в течение 15 минут при 35 °C для расщепления клеточных стенок.
      4. Полученные сферопласты соберите с помощью щадящего центрифугирования при 600 x g в течение 5 мин и промойте 1 мл 1 М сорбита, а затем снова 1 мл буфера STC (1 М сорбит, 10 мМ Tris pH 7,5 и 10 мМ CaCl2).
      5. Ресуспендируйте промытые сферопласты в 50 μл буфера STC.
        ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью ножниц отрежьте последние ~0,7 см кончика пипетки; Это создаст более широкое устье и предотвратит лизис сферопластов.
    3. Преобразуйте наивные клетки с помощью белка.
      1. Трансформируйте 50 мкл аликвот сферопластов с 50 мкл донорского лизата, 20 мкл ДНК спермы лосося (2 мг/мл) и 5 мкл селективной плазмиды, маркированной URA3 (например, pAG426-GFP)28,33.
      2. Выдерживайте смесь при температуре 25 °C в течение 30 минут.
      3. Центрифугировать в течение 5 мин при 600 х г для сбора сферопластов и повторного суспендирования в 150 мкл SOS-буфера (1 М сорбита, 7 мМ CaCl2, 0,25% дрожжевого экстракта и 0,5% пептона).
      4. Восстановите в течение 30 минут при 30 °C.
      5. Выложите всю культуру на планшеты SD-URA.
      6. Быстро насыпьте покрытую культуру теплой (~45 °C) SD-URA, содержащей 0,8% agar.
        Примечание: Это предотвратит разрыв сферопластов
      7. Инкубируйте трансформационные планшеты в течение 2-3 дней при 30 °C.
      8. Используя зубочистку, выберите успешно растущие клетки из наложенной пластины и повторите создание одиночных колоний на пластинах SD-URA.
      9. Выберите десятки колоний для каждой из них и используйте 5-FOA планшеты, чтобы уничтожить плазмиду-носитель, меченную URA3.
      10. Выберите колонии, которые растут на пластинах 5-FOA, и проверьте передачу стабильных фенотипических состояний с помощью анализа роста, как и ранее (шаг 1.13).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Известно, что сверхэкспрессия белка резко меняет клеточные фенотипы27. Действительно, при первоначальном подходе к скринингу сотни новых фенотипов были воспроизводимо восстановлены из сверхэкспрессии клонов дрожжей ORFeome с использованием всего десяти стрессоров. Тем не менее, описанные выше анализы позволяют оценить, сохраняют ли клетки какие-либо долгосрочные стабильные фенотипы после этой сверхэкспрессии. Одним из белков, способных кодировать такое состояние, я...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первый прионов дрожжи были определены их необычные фенотипы и запутанной модели наследования. Характеристики этих прионы, затем были использованы для построения алгоритмов и вычислительных средств экран для дополнительных прионных белков. Метод, описанный здесь, напротив, экспериментальной и опирается на переходных гиперэкспрессия для создания прочного изменения в стабильное государство закодированные в конформации белка. Однако если эффективность «посева» прионных Ассамблеи по гиперэкспрессии для любого данного белка оч...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Sohini Chakrabortee, Сандра Джонс, Дэвид Гарсия, Bhupinder Bhullar, Амелия Chang, Ричард она и Сьюзен Линдквист за их помощь в разработке анализов, используемые в этом документе, а также рецензентов для их вдумчивые комментарии.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Гуанидина гидрохлоридSigmaCat#G3272-25GХимический
хлорид марганцаSigmaCat#M8054-100GХимический
Бромид этидииSigmaE1510Химический
5-фтороротовая кислотаSigmaCat#F5013-50MGХимический
BY4741 MATa (his3Δ 1 леу2&дельта; 0 LYS2 met15Δ 0 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998N/AШтамм дрожжей
BY4741 MATα (his3Δ 1 леу2&дельта; 0 lys2Δ 0 MET15 ura3Δ 0)Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998Н/ДШтамм дрожжей
Hsp70 (K69M) Jarosz et al., 2014bN/AПлазмида
FLEXGene libraryHu et al., 2007N/AПлазмидная библиотека
Dextrose (глюкоза)Fisher ScientificD16-3Медиакомпонент
RaffinoseSigmaR0250-25GМедиакомпонент
GalactoseFisher ScientificBP656-500Медиакомпонент
CSMSunrise Наука1001-100Медиакомпонент
CSM-URASunrise Science1004-100Медиакомпонент
CSM-LYSSunrise Science1032-100Медиакомпонент
CSM-METSunrise Science1019-100Медиакомпонент
CSM-LYS-METSunrise Science1035-100Медиакомпонент
дрожжевой экстрактФишер ScientificBP1422-2Медиа компонент
пептонResearch Products InternationalP20240-5000Медиа компонент
бакто-пептонBD211677Медиа компонент
глицеринEMD MilliporeGX0185-2Медиа компонент
дрожжевого азота без аминокислотBD291920Медиа компонент
агарIBI НаучныйIB49172Медиакомпонент
Сульфат аденинаSigmaA3159-25G Медиакомпонент
Ацетат калияSigmaP1190-500GМедиакомпонент
UracilSigmaU0750-100G Медиакомпонент
ГистидинSigmaH8000-100G Медиакомпонент
ЛейцинСигмаL8000-25G Медиакомпонент
ЛизинСигмаL5501-25G Медиакомпонент
РНКаза I Thermo Fisher ScientificEN0601Фермент
биотинилированная ДНКазаThermo Fisher ScientificAM1906Фермент
зимоляза 100T (дрожжевой литический фермент)Sunrise ScienceN0766555
Считыватель микропланшетовBioTekSynergy H1Оборудование
Укладчик микропланшетовBioTekBioStack3Оборудование
наполнительBiotTekEL406Оборудование
Робот для работы с жидкостямиBeckman CoulterBiomek FXОборудование

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
  2. Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992(2014).
  3. Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
  4. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
  5. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  6. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
  7. Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  8. Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
  9. Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
  10. Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
  11. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
  12. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
  13. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  14. Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
  15. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  16. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
  17. Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
  18. Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  19. King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
  20. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
  21. Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
  22. Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
  23. Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
  24. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
  25. Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
  26. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
  27. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  28. Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
  29. Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
  30. Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766(2016).
  31. Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
  32. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  33. Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425(1992).
  34. Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
  35. Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
  36. Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
  37. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
  38. Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
  39. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
  40. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
  41. Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
  42. Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
  43. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein based InheritanceYeast ORFeome ScreeningHigh throughput PhenotypingPrion Protein DetectionManganese Chloride StressorHSP104 DisaggregasePSP1 Open Reading FrameNon mendelian InheritanceYeast Prion FieldEpigenetic Screening

Related Articles