Модифицированный дрожжевой одногибридный анализ, описанный здесь, является расширением классического дрожжевого одногибридного (Y1H) анализа для изучения и проверки гетеромерного белкового комплекса-ДНК-взаимодействия в гетерологичной системе для любого исследования функциональной геномики.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модифицированная дрожжевая гибридная система для исследований комплексных ДНК-гетерогенных белков
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
На протяжении многих лет дрожжевой одногибридный анализ оказался важным методом идентификации и подтверждения физических взаимодействий между белками, такими как транскрипционные факторы (ТФ) и их ДНК-мишень. Представленный здесь метод использует основную концепцию Y1H, но модифицируется далее для изучения и проверки связывания белковых комплексов с их ДНК-мишенью. Следовательно, он упоминается как модифицированный дрожжевой одногибридный (Y1.5H) анализ. Этот анализ экономичен и может быть легко выполнен в обычной лабораторной обстановке. Несмотря на использование гетерологичной системы, описанный способ может быть ценным инструментом для проверки и проверки связывания гетеромерного белкового комплекса с их ДНК-мишенью (ами) для функциональной геномики в любой системе исследования, особенно в геноме растений.
Введение
В общем, для понимания взаимодействия белок-ДНК анализ Y1H является предпочтительной системой, успешно используемой в лабораторных условиях 1 . Основной анализ Y1H включает в себя два компонента: а) репортерную конструкцию с интересной ДНК, успешно клонированной выше гена, кодирующего репортерный белок; И b) конструкцию экспрессии, которая будет генерировать слитый белок между TF интересом и доменом активации транскрипции (AD). Интересную ДНК обычно называют «приманкой», в то время как слитый белок известен как «жертва». В прошлые годы были разработаны несколько вариантов анализа Y1H с учетом особых потребностей 2....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Конструирование и репортерная плазмидная подготовка.
- ПЦР амплифицируют промоторные области / «фрагменты» (предпочтительно ~ 250-500 п.о.) ДНК-мишени, подлежащие анализу, для дальнейшего клонирования в векторе-записи с использованием E. coli (TOP10).
- После подтверждения последовательности субклонеруйте положительный клон в совместимом векторе экспрессии pGLacZi 7, как описано выше 8 , 9 , 10 , 11 .
- Трансформируйте дрожжевой штамм для интеграции промотора (YM4271) путем ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Общая процедура настройки пластины для коразрушения областей ДНК в дрожжевых клетках с интересующим белком ( рис. 2 ). Настройка пластины может быть изменена в соответствии с потребностью в эксперименте и количеством тестируемых участков ДНК / фрагментов. После 5-дневного дня следует увидеть хорошо выраженную и положительную пластину, как на рисунке 3 . В нашем исследовании промоторная область 2600 п.о. выше по течению от начала.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существующая стандартная процедура Y1H подходит для идентификации единственной белковой жертвы, связывающей ее ДНК-приманку. С различными техническими изменениями существующая система была использована для определения сетей регулирования транскрипции. Однако известно, что TF функционируют как часть комплексов с участием двух или более ТФ или белков, причем только часть TF способна связываться с ДНК. Белки или ТФ, которые обладают только белоксвязывающими доменами и не обладают способностью связываться с ДНК, более вероя.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не объявляют конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим С.С. Ванга, М. Амара и А. Галла за критическое чтение рукописи. Исследования, опубликованные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом общих медицинских наук Национального института здоровья по номерам премий RO1GM067837 и RO1GM056006 (до SAK). Контент принадлежит исключительно авторам и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здоровья.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| pDEST22 вектор | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two гибридный системный комплект |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | гибридный системный комплект Pro-Quest Two; этот vecor модифицирован. Это pDEST32 минус связывание ДНК Домен |
| pENTR/D-TOPO Набор для клонирования | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Штамм | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER Одногибридная система |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two гибридный системный комплект |
| GATEWAY LR Clonase II смесь ферментов | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD минимальная среда | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Добавка | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Добавка | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10 мг/мл) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 лунок круглый дно | Пластина Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-глубокий колодец | блок США Scientific | 1896-2000 | |
| Герметичная фольга | США Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-меркаптоэтанол | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| 2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Планшетный ридер | Молекулярное устройство | SPECTRAMAX PLUS Микропланшетный спектрофотометр | |
| Инкубатор | Thermo Fisher | Модельный No 5250- 37 градусов, 6250-30 градусов | |
| Шейкер Инкубатор | Нью-Брансуик | ||
| Водяная баня | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 мл Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask Nalgene | |||
| Петриплиты (150 мм) | Greiner bio-one |
Ссылки
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012). <....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
