Method Article

Оптимизированный метод LC-MS/MS для высокой пропускной способности анализа клинических образцов Ivacaftor, его основных метаболитов и Lumacaftor в биологических жидкостях больных муковисцидозом

DOI:

10.3791/56084

⸱

October 15th, 2017

 ,  ,  , 
1Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, 2Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Microbiology, Monash University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сочетание Ivacaftor и ivacaftor-lumacaftor являются два новых препаратов CF. Однако есть еще недостаток понимания их Фармакологических и фармакологии. Мы представляем оптимизированный метод ВЭЖХ-МС для одновременного анализа ivacaftor и его главных метаболитов и lumacaftor.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дефекты в Регулятор проводимости транс мембраны кистозный фиброз (МВТР) являются причиной кистозный фиброз (CF), болезнь с угрожающей жизни легких проявлениях. Ivacaftor (IVA) и ivacaftor-lumacaftor (яркость) комбинации являются два новых прорыв CF лекарств, которые непосредственно модулировать активность и торговля дефектных МВТР-белка. Однако есть еще недостаток понимания на фармакокинетические/фармакодинамика параметров и фармакологии ivacaftor и lumacaftor. Метод ВЭЖХ-МС для одновременного анализа концентрации ivacaftor, гидроксиметил ivacaftor, ivacaftor карбоксилатных и lumacaftor в биологических жидкостях у больных, получавших стандартные комбинации ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor терапия ранее был разработан нашей группы и частично проверяются по стандартам FDA. Однако, чтобы разрешить высок объём анализа большего числа пациентов образцов, наша группа оптимизировал сообщил метод с помощью столбца реверс фаза хроматографии размер меньше поры (2.6 мкм, C8 100 Å; 50 x 2,1 мм) и градиентной жидкостной системы ( 0-1 мин: 40% B; 1-2 мин: 40-70% B; 2-2.7 мин: в 70% B; 2,7-2,8 мин: 70-90% B; 2.8-4.0 мин: 90% B стирки; 4.0-4.1 мин: 90-40% B; 4.1-6.0 мин: в 40% B) вместо Изократические элюции. Целью настоящего исследования было уменьшить время анализа ВЭЖХ-МС на сэмпл резко от ~ 15 мин до только 6 мин на сэмпл, которая необходима для анализа большого количества пациентов образцов. Этот метод целесообразно будет весьма полезными для исследований в воздействие-реакция этих препаратов CF прорыв.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кистозный фиброз (CF) является общим генетическим заболеванием, с участием слизь экзокринной железы легких, печени, поджелудочной железы и кишечника, вызывая прогрессивного мульти полиорганной недостаточности, такие как снижение легочной функции и недостаточность поджелудочной железы1, 2,3. Ivacaftor (IVA) является первым пищевых продуктов и медикаментов (FDA-США) и Европейское агентство лекарственных средств (EMA) одобрил муковисцидоз транс мембраны проводимости регулятор (МВТР) potentiator наркотиков, с свидетельствует клиническая эффективность производства значительного улучшение функции легких над плацебо в небольшого подмножества CF пациентов с учетом G551D-МВТР [глицин (G) в положение 551 заменяется аспарагиновой кислоты (D)] Миссенс-мутации (~ 4-5% из населенности CF)4,5. Это перорально наркотиков увеличивает МВТР канал открытия, тем самым увеличивая поток ионов хлорида и действуя на первичный дефект, который приводит к клинических проявлений CF4,6. К сожалению, IVA монотерапия не эффективен у пациентов с более распространенными гомозиготных F508del мутация [в кадр удаления гена МВТР, что приводит к потере фенилаланин (F) в позиции 508] что приводит смятых МВТР, который рассматривается в ~ 50% CF населения7,8.

Недавно FDA предоставил официальное утверждение для объединения IVA с корректором МВТР lumacaftor наркотиков. Умная стратегия объединения МВТР Корректор (lumacaftor, Лума), который спасает F508del-МВТР на поверхности клеток с модулятором (IVA), который потенцирует активность канала МВТР, эффективно расширяет окна лечения для большинства населения CF5 . Вопросы по-прежнему ли эти препараты будут выполнить свое обещание, как ряд противоречивых докладов появились что сомнение после их клиническая эффективность9,10. Кроме того, улучшение функции легких были лишь скромный (2,6-4% для комбинации ivacaftor-lumacaftor) по сравнению с успех, достигнутый с IVA монотерапии у больных с учетом G551D мутации (10.6-12,5%)8. Потенциальные антагонистических наркотиков-взаимодействиях между IVA и LUMA потенциально ограничивают клиническая эффективность ivacaftor-lumacaftor комбинации приходят от его менее идеальных фармакокинетические свойства7,11. IVA активно метаболизируется ферментами цитохрома P450 (CYP), главным образом в активный метаболит гидроксиметил IVA (IVA-M1, M1) и неактивной форме IVA-карбоксилатных (IVA-M6, M6)7,12. Индуктором CYP3A4 Лума, с другой стороны, широко не метаболизируется и это во многом экскретируется в неизмененном виде в фекалиях11. Как индукторов CYP3A4 вызывают метаболизм цитохрома, ivacaftor (CYP3A4 субстрата) концентрации могут быть сокращены. Кроме того IVA и LUMA очень гидрофобные молекулы и ~ 99% связаны с белками плазмы, что значительно ограничивает свободный (активные) препарата концентрация1,13.

В совокупности эти факторы могут собираются вместе, чтобы ограничить клиническая эффективность комбинации ivacaftor-lumacaftor. Не известно ли оптимальный плазменные концентрации достигаются под текущий режим дозирования для ivacaftor-lumacaftor комбинации или если порог терапевтического сохраняется8. В настоящее время существует нехватка информации о фармакокинетические параметры, такие как пик и концентрации в плазме установившемся ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor. Учитывая отметил метаболизм ivacaftor и lumacaftor, мониторинг воздействия-реакция является условием для достижения оптимальной дозировке схемы для ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor терапии. Наша группа недавно опубликовал первый метод ВЭЖХ/LC-MS для мониторинга воздействия-реакция IVA и LUMA14. До настоящего времени не поступало никаких альтернативных методов измерения концентрации ivacaftor, его метаболитов и lumacaftor. Для высокой пропускной способности анализа больших пациента коллектива и резко уменьшить время анализа, наша группа оптимизированный метод сообщалось с помощью столбца реверс фаза хроматографии размер меньше поры и градиентной жидкостной системы, уменьшает стоимость и время работы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

утверждения этики был получен от Монаш Университета человека исследовательской этики Комитет (MUHREC).

1. применение анализа: сбор образцов пациента

  1. записывать время, когда пациент принимает их стандартной дозы 150 мг ivacaftor или ivacaftor 125 мг /lumacaftor 200 мг.
  2. Примечание вниз точное время, когда собирается образец крови пациента.
    Примечание: Мы рекомендуем, собирая образцы 4-5 время течение 24 h. Если коллекция только один образец возможно, указанное время является 2,5-4 ч пост ivacaftor или ivacaftor-lumacaftor сочетание дозировки как C Макс концентрации в стационарном состоянии будет достижимо после > 5 дней подряд лечения.
  3. Собирать 4-5 мл крови в коммерчески доступных необработанных синий трубы.
  4. После сбора всей крови, позволяют крови к свертыванию, оставляя нетронутыми при комнатной температуре.
    Примечание: Обычно это занимает 15-30 мин
  5. Удаление сгусток центрифугированием в 1,000-2,000 x g 10 мин при 4 ° C в охлажденных центрифуги. Назначить результате супернатанта как плазмы.
  6. После центрифугирования, немедленно перевести супернатант (плазмы) в чистой полипропиленовые трубы, с помощью пипетки Пастера. Ярлык плазмы трубки с ID пациента (например, 1 пациента), управляемых препарата (например, комбинация ivacaftor-lumacaftor) и время пациента образец был сбор (например, 2,5 ч после дозировки).
  7. Сохранить образцы в 2-8 ° C во время обработки. После завершения обработки, хранения образцов в – 20 ° C.
  8. В случае необходимости, корабль образцы с утвержденным курьера к анализу института.
    Примечание: Образцы должны быть отправлены на сухого льда до прибытия и должна быть сохранена в – 80° C до анализа.

2. Подготовка и обработка понесенных образцов и стандартов

Примечание: плазмы от наивных здоровых доноров к терапии ivacaftor/lumacaftor был получен из австралийского Красного Креста. Для обеспечения целостности, все образцы/стандарты должны храниться при температуре 2-8 ° C в ходе сбора и обработки. После завершения обработки, хранения образцов в – 20 ° C.

  1. Весят IVA, IVA-карбоксилатных, гидроксиметил IVA и ЛЮМА, который будет служить в качестве ссылки для внутренних стандартов.
  2. Подготовить два независимых акций решения каждого аналита (IVA, M1, M6 и LUMA) в LC-MS класс метанола на 100 мкг/мл и 10 мкг/мл.
    Примечание: Соединения истекает через 10 дней на benchtop.
  3. Свежие подготовить LC-MS калибровки стандартов до каждой аналитической запуск путем разбавления калибровки стандартов акций решения в человеческой плазмы для достижения после концентрации: 0.01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 и 10.0 мкг/мл. Эти образцы, именуемые стандарты.
  4. Осадок белков, подготовить 0,1% муравьиной кислоты (ФА) в ацетонитриле (ACN, класс LC-MS) и оставить в холодильнике до тех пор, пока требуется.

3. Предварительная обработка понесенных образцов и стандартов

  1. позволяют обоих образцах плазмы пациента и пустой сбалансировать до комнатной температуры.
  2. Вихрь смешивать каждого образца плазмы для 15 s на сэмпл.
  3. Передачи 100 мкл Алиготе либо пустой плазмы для стандартов или пациентов образцов для анализа в трубку 1,5 мл полипропиленовые microcentrifuge.
  4. Добавить внутренние стандартные IVA в каждый из стандартных труб (например, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 и 10.0 мкг/мл для покрытия потенциальных концентрациях), закройте крышку, и вихрь для 2-3 s. Обратите внимание что внутренний стандарт только добавляется пустой плазмы и не внутренний стандарт добавляется пациентов образцов.
  5. Повторите шаг 3.4. для других внутренних стандартов, M1, M6 и LUMA.
  6. Спин вниз каждой трубы кратко для обеспечения того, чтобы без капельки на крышке.
  7. Добавить 200 мкл смеси 0,1% FA в АКС в каждую пробирку для осаждения белков плазмы.
  8. Водоворот смесь энергично для около 15 s.
  9. Позволяют трубы постоять 10 мин в холодильник.
  10. Центрифуг на 10000 x g 10 мин при температуре 4 ° C, если это возможно.
  11. Фильтр 200 мкл Алиготе супернатант через фильтр шприц 13 мм в 1,5 мл флакон ВЭЖХ.
  12. Передачи 100 мкл супернатант в пробирку LC-MS для анализа ВЭЖХ-МС.

4. ВЭЖХ-МС анализ

Примечание: был проведен анализ ВЭЖХ-МС на LC-MS системы в сочетании с тройной квадрупольный масс-спектрометр (Таблица 1).

  1. Повернуть на системе LC-MS, поместите лоток с образцами в auto сборники.
  2. Добавить столбец в столбец гвардии и подключиться к системе LC-MS.
  3. Придают обе бутылки подвижных фазах (бутылка A: 100% АКС; бутылка B: 0,1% муравьиной кислоты в воде) и сбалансировать системы LC-MS.
  4. Включить следующие параметры в протокол LC-MS.
    1. Разделить поток мобильных фаза перед входом в масс-спектрометр в соотношении 2:1 (отходы: MS входе).
    2. Выполнять градиента элюции при скорости потока 0,5 мл/мин с помощью мобильных фаза, состоящая из 100% АКС и 0,1% муравьиной кислоты в воде (отправная точка в широколиственные, v/v). Обратите внимание, что объем % мобильных фазы изменяется по всему анализ.
    3. Работают масс-спектрометр в режиме ионизации позитивные электроспрей.
    4. Убедитесь, что используются следующие параметры LC-MS: Ион спрей напряжение 4.5 кв, энергию столкновения 295.9 V, Небулайзерная газ: азота в 3 Л/мин; столкновения газ: Аргон; сушки газа расход 20 Л/мин, объектив напряжения Q3:-22 V, desolvation температуры 250 ° C с блоком тепла температуры 400 ° C.
    5. Тома inject 10 мкл на сэмпл.
    6. Обнаружения аналитов, используя несколько реакции, мониторинг (MRM). Отслеживать переходы ионов m/z 392.49 → 393, m/z 408.49 → 409, m/z 422.47 → 423 и m/z 452.40 → 453 IVA, IVA-М1, IVA-M6 и ЛЮМА, соответственно.
      Примечание: Недавно усовершенствованного метода еще не полностью проверяться согласно стандартам FDA.

5. Калибровочные кривые

  1. конструкции LC-MS калибровочных кривых перед каждой аналитической запуска, используя отношения между пик области показатели каждого из четырех аналитов внутреннего стандарта и калибровки стандартных номинальной концентрации ivacaftor (IVA-М1, IVA-M6 или LUMA) в рамках программы настройки LC-MS.
    Примечание: Точные шаги для построения калибровочной кривой зависит от модели используемого оборудования LC-MS. Эта информация может быть доступна в руководстве оборудование.
  2. Выполнения регрессионного анализа линейных наименьших квадратов путем взвешивания 1/C 2 согласно взаимным концентраций.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы недавно сообщили метода, частично проверяются по стандартам FDA, на тройной квадрупольного LC-MS и ВЭЖХ системы детектор, с помощью столбца C8 (5 мкм, и.д. 3,9 мм x 50 мм) с мобильных фаза, состоящая из 100% АКС и 0,1% муравьиной кислоты в воде (широколиственные v/v) со скоростью потока 1 мл/мин. Линейной корреляции пиков наблюдалось над диапазоном концентрации от 0.01 до 10 мкг/мл в человеческой плазмы для всех метаболитов, ivacaftor, Iva-М1, Iva-M6 и lumacaftor14. Здесь был оптимизирован этот...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как сообщалось ранее наша группа имеет впервые разработан и проверен метод ВЭЖХ и LC-MS для быстрого обнаружения и количественного определения ivacaftor и его главных метаболитов гидроксиметил IVA M1 (активный) и IVA-карбоксилатных M6 (неактивный); и lumacaftor в плазме крови и мокроты больных CF14. Assay сообщили нашей группой, ранее успешно используется для количественного определения концентрации Лума, IVA, IVA-M1 и IVA-M6 в плазме крови и мокроты CF пациентов, проходящих стационарное состояние...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) национальных институтов здравоохранения (R01 AI111965) поддерживаются J.L. и Т.В. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения в национальном институте аллергии и инфекционных заболеваний или национальных институтов здравоохранения. МС является австралийский NHMRC главный научный сотрудник. J. L. австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) старший научный сотрудник, и т.в. Австралийский NHMRC промышленность карьера развития уровня 2 научный сотрудник. E.K.S назначен посол Янг 2017 для ASM (Американское общество микробиологии) и поддерживается австралийских последипломного Award.
Часть этой работы был представлен на 12th Australiasian конференции по муковисцидозом в Мельбурн (5-8го августа 2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
IVA (Cat#S114) SelleckChem (США). 
LUMA (Cat#S1565) SelleckChem (США). 
IVA-карбоксилат (Cat# 510242247CS) Clearsynth (Канада). 
гидроксиметил-IVA (Cat# 510240849CS) Clearsynth (Канада). 
Метанол (марки MeOH, LC-MS), Сигма-Олдрич
ацетонитрил (ACN, LC-MS grade) Сигма-Олдрич
муравьиная кислота (ФК) Sigma-Aldrich
тройной квадруполь Shimadzu 8030 LC-MS 
Phenomenex Kinetex (2.6 & micro; m C8 100 Å; 50 раз &; 2,1 мм)
(Встроенный фильтр KrudKatcher Ultrea HPLC 0,5 м с глубинным фильтром x 0,004 дюйма ID). 
Полипропиленовая микроцентрифужная пробирка (VWR) объемом 1,5 мл. 
Eppendorf Centrifuge 5430
13-мм шприцевой фильтр (0,45 &; м нейлон, ГРЕЙС, США) 
[Phenomenex VEREX, 9 мм, PP, 300 & микро; L, ПТФЭ/силиконовые перегородки]. 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schneider, E. K., et al. Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor. J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).
  2. Solomon, M., Leatte, P. N. Treatments for Cystic fibrosis. , (2009).
  3. O'Sullivan, B. P., Flume, P. The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis. Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).
  4. Ramsey, B. W., et al. A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation. N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).
  5. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).
  6. Hadida, S., et al. Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator. J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).
  7. FDA. FDA Advisory Commitee Briefing Material VERTEX-FDA Pulmonary-Allergy drugs advisory commitee. 98 , VERTEX Pharmaceuticals Incorporated. (2015).
  8. Holmes, D. False dawn for cystic fibrosis disease modifiers? Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).
  9. Veit, G., et al. Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).
  10. Cholon, D. M., et al. Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis. Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).
  11. EMA, Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency. , (2015).
  12. VERTEX. Vertex prescribing infomation. , (2015).
  13. Matthes, E., et al. Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor). Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).
  14. Schneider, E. K., et al. Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO. J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).
  15. Su, Q., et al. An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ivacaftor AnalysisLumacaftor DetectionLC MS MS MethodHigh throughput AnalysisClinical SamplesBiological FluidsGradient ElutionPhenomenex C8 ColumnSample PreparationTherapeutic Drug Monitoring

Related Articles