Методическая статья

Руководство по продукции, кристаллизации и определения структуры человеческого IKK1/α

DOI:

10.3791/56091

⸱

2 ноября 2018 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, University of California, San Diego, 2Department of Biophysics, Bose Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IκB киназы 1/α (IKK1/α CHUK) является Ser/Чет протеинкиназы, которая участвует в бесчисленных клеточной деятельности, главным образом через активацию NF-κB транскрипционных факторов. Здесь мы опишем основные шаги, необходимые для производства и определения структуры кристалла этого белка.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Класс внеклеточного раздражителей требует активации IKK1/α побудить поколения NF-κB Субблок p52, путем обработки его предшественник p100. P52 функции как Антуану или гетеродимера с другой NF-κB Субблок, RelB. Эти димеры в свою очередь регулируют выражение сотен генов, участвующих в воспаление, выживаемость клеток и клеточного цикла. IKK1/α главным образом остается связанной с IKK2/β и Немо как третичный комплекс. Однако небольшой бассейн это наблюдается также как низкой молекулярной массой complex(es). Неизвестно, если действие обработки p100 инициируется активации IKK1/α в течение большего или меньшего комплекс бассейна. Учредительный активность IKK1/α была обнаружена в нескольких раковых заболеваний и воспалительных заболеваний. Чтобы понять механизм активации IKK1/α и включить его использования в качестве целевого наркотиков, мы выразили рекомбинантных IKK1/α в различных хост-систем, таких как кишечная палочка, насекомых и млекопитающих клетки. Нам удалось выразить растворимых IKK1/α в бакуловирусы инфицированных насекомых клеток, получение количества мг чистого белка, кристаллизующийся в присутствии ингибиторов и определение его кристаллической структуры рентгеновского. Здесь мы описываем подробные шаги для получения рекомбинантных белков, его кристаллизации и его определения структуры рентгеновских кристалл.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Транскрипционный анализ деятельность в семейства NF-κB димерной транскрипционных факторов, необходимых для различных клеточных функций, начиная от воспаления и иммунитет для выживания и смерти. Эти мероприятия строго контролируются в клетки и потеря регулирование приводит к различных патологических состояний, включая аутоиммунных заболеваний и рака1,2,3. В отсутствие стимула деятельность NF-κB хранятся тормозится IκB (ингибитор - κB) белки4. Фосфорилирование конкретных Ser остатков на белки IκB помечает их ubiquitination и последующего протеосомной деградации или выборочной обработки5. Два весьма гомологичных Ser/Чет киназы, IKK2/β и IKK1/α, выступать в качестве центрального регуляторы деятельности NF-κB осуществляя эти события фосфорилирование6,7.

Взаимодействия лигандов и рецептор передает сигнал через ряд посредников, ведущие к активации NF-κB факторов. NF-κB сигнализации процесс широко можно подразделить на два различных пути – канонические и нестандартные (альтернативных)8. Деятельность IKK2/β главным образом регулирует NF-κB сигнализации канонический путь, который имеет важное значение для воспалительных и врожденный иммунный ответ9. Отличительная черта этого пути является быстрое и недолго активации10 IKK2/β в пределах до сих пор биохимически uncharacterized IKK комплекс — предположительно будет состоять из IKK1 и IKK2, а также нормативно-правовой компонент, Немо (NF-κB основные модулятор )11,12,13. Между двумя каталитического IKK подразделений комплекса IKK, IKK2 является главным образом ответственный14 для фосфорилирование конкретных остатков прототип IκBs (α, - β и - γ) обязан NF-κB, а также нетипичные IκB белок, NF-κB1/p105, который является предшественником NF-κB p50 Субблок5. Фосфорилирование индуцированной ubiquitination и деградации протеосомной IκB (или обработки p105) приводит к выпуска и активации определенного набора NF-κB димеры15. Аберрантное NF-κB активности из-за неправильного регулируемой функции IKK2 наблюдается во многих раках, также как и аутоиммунных расстройств2,3,16.

В отличие от IKK2/β активность IKK1/α регулирует NF-κB сигнализации нестандартные пути, который имеет важное значение для развития и иммунитет. IKK1 фосфорилирует конкретные остатки NF-κB2/p100 на ее сегмент C-терминала IκBδ, что приводит к ее обработка и генерация p52. Формирование транскрипционно активных p52:RelB гетеродимера инициирует медленно и устойчивого реагирования на развития сигналы7,,1718,19,20. Интересно, что поколения Центральной p52 фактора NF-κB этот путь зависит от другой фактор, NF-κB вызывая киназы (ник)21,22, но не на IKK2 или Немо. В клетках отдых уровень NIK остается низким из-за его постоянной протеасом зависимой деградации23,24,25. После стимуляции клеток «не канонических» лигандов и в некоторых злокачественных клеток Ник стабилизируется набирать и активировать IKK1 / α. киназы деятельности Ник и IKK1 имеют важное значение для эффективной обработки p100 в p527. IKK1 и Ник фосфорилировать трех serines (Ser866, 870 и 872) NF-κB2/p100 приводит к ее обработка и генерация p52 сегмента IκBδ C-терминала. Ошибочной активации нестандартные пути были причастны многих злокачественных опухолей, включая множественной миеломы26,27,28.

Известны несколько весьма эффективные и конкретные ингибиторы для IKK2/β, хотя никто до настоящего времени оказались быть эффективный препарат. В отличие от IKK1/α-специфические ингибиторы являются скудными. Это может частично обусловлены нашего отсутствия структурных и биохимических информации о IKK1/α, который ограничивает наше понимание механистический основы активацию NF-κB, IKK1 в клетки и рациональных наркотиков дизайн. Структуры рентгеновского IKK2/β предоставил нам взглянуть на механизм активации IKK2/β29; Однако, эти структуры не могут выявить как различных вышестоящих раздражителей вызвать срабатывание IKK1/α или IKK2/β регулировать различные наборы NF-κB деятельности 30,31. Чтобы понять механистический основания, лежащие в основе функции distinct сигнализации IKK1/α и создать платформу для рационального наркотиков дизайн, мы сосредоточены на определении структуры IKK1/α.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка рекомбинантных вирус подходит для больших масштабах выражение IKK1/α

  1. Подготовка вирус P1 32
    1. День 1: Плита Sf9 клетки (~ 6 X 105) (проход число меньше 10) в 2 мл среды насекомых клеток Sf900 III в каждом также 6-ну плиты и Инкубируйте на 27 ° C. Проход клеток, когда они достигают плотность составляет 2-3 Х 106 клеток / мл в суспензии путем разбавления в свежие СМИ на плотности ~ 6 X 105.
    2. День 2: Развести 8 мкл Реагента Sf9-трансфекции в 100 мкл Sf900 III или Грейс насекомых среды без антибиотиков и сыворотки. Вихрь кратко.
    3. Разбавьте 1 мкг комплект очищенная рекомбинантных bacmid (подробная информация приводится в «Представитель результаты»)32 в другой 100 мкл той же среде, в трубку, отдельный.
    4. Объединить разреженных ДНК и трансфекции реагента (общий объем ~ 210-220 мкл) и инкубации при комнатной температуре 15-30 мин.
    5. Удалите носитель из колодца. Добавьте 1 mL свежих средних без антибиотиков и сыворотки.
    6. Добавьте разбавленные смеси реагентов ДНК трансфекции каплям на клетки. Отрегулируйте размер капли, таким образом, чтобы он не выбить адэрентных клеток.
    7. После ~ 6 h добавить 1,5 мл свежей среды на вершине или удалите среды и добавьте 2,5 мл свежей среды. Тепло свежих среднего до 25-27 ° C до сложения.
    8. Инкубировать клетки на 27 ° C. Проверьте скважинах периодически каждые ~ 12 ч для признаков вирусной инфекции. Провести все Sf9 обслуживание и выражение 27 ° c.
    9. День 5: Извлеките носитель содержит клетки 60-72 h пост инфекции. Центрифуги для 5 мин на 500 x g и 4 ° C. Сохранить супернатант; Это акции P1-вирус. Заморозить малых аликвоты-80 ° c.
  2. Выбор лучших выражения P1 вирус клон.
    1. Плита клетки так же, как описано в шаге 1.1.
    2. Следующий пост день или ~ 6 h обшивка, добавить 20 мкл и 50 мкл различных P1 вирус клон запасов на клетки в различных скважин.
    3. Выбить адэрентных клеток, нежный закупорить и урожай инфекции пост 60-72 h инфицированные клетки центрифугированием на 5 мин, 500 x g и 4 ° C. Сохраните супернатант. Это вирус запас P2. Храните небольшой аликвоты акций-80 ° c.
    4. Добавьте 100 мкл буфера 2 x Laemmli SDS в Пелле заготовленных клеток. Тепло в > 95 ° C на 10 мин центрифуги (обычно > 10000 x g) за 5 мин.
    5. Запустите 10-15 мкл каждого образца на 8-10% SDS-PAGE в 120-160 V, пока краска фронта достигает нижней части геля.
    6. Электро передача решена белков путем стандартных полусухое протокол (20 V, 30-45 мин) передачи на нитроцеллюлозную/PVDF мембрану.
    7. Пятно антитела анти IKK1 (разбавления ~ 1:2, 000, должны быть оптимизированы) или анти PentaHis антитела (разбавления ~ 1:3, 000, должны быть оптимизированы) для выражения.
    8. Выберите лучший клон вирус P1, сравнивая выражение рекомбинантных IKK1.
  3. Подготовка большого масштаба складе вирусом P3.
    1. Плита клетки так же, как описано в шаге 1.1 в 15 см пластины, содержащих 25-30 мл среды Sf900 III.
    2. ~ 6 h пост обшивка, 150-300 мкл наилучшим образом выражая запасов вируса P1 на клетки.
    3. После 72 ч пост инфекции, аспирационная среднего тщательно от пластины в подходящей трубки (стерильные) и центрифуги трубки на 500-1000 X g 10 мин при 4 ° C. Отменить Пелле ячейки (если один образуется) и сохраните супернатант. Это складе вирусом P3.
  4. Определение титр оптимальный вирус для больших масштабах выражения протеина
    1. Плита клетки в 2 мл средний Sf900 III, как описано в 1.1, в 6-ну пластине.
    2. Добавьте 20, 30, 40 и 50 мкл P3, вирус складе в отдельных скважинах ~ 6 ч после покрытия. Включите элемент неинфицированных.
    3. Урожай клетки от каждой инфекции хорошо 48-60 h пост.
    4. 100 мкл 2 X Лэмли SDS буфера. Тепло в > 95 ° C на 10 мин центрифуги (обычно в 14.000 x g) за 5 мин.
    5. Разрешить 10-15 мкл каждого образца в геля SDS-PAGE 8-10%.
    6. Решены белка можно передайте мембраны нитроцеллюлозы/PVDF как упомянуто в 1.2.6.
    7. Пятно антитела анти IKK1 (разбавления ~ 1: 2000, должны быть оптимизированы) или анти PentaHis антитела (разбавления ~ избытке, должны быть оптимизированы).
    8. Используйте вирус с лучшими, выражая титр для больших масштабах выражений.

2. крупномасштабные выражение 6 x его меткой человека IKK129,33

  1. Осуществляют крупномасштабные выражение в культуре подвеска. Разделение ячеек в 1 Л Sf900 III среды в 2 колбу Эрленмейера Л с крышкой вентилируемые. Плотность клеток должно быть ~ 5 x 105 клеток/мл.
  2. Растут эти клетки в виде суспензии в ~ 100 об/мин при 27 ° C в шейкере ~ 2 дней, пока он не достигнет плотность составляет 1-2 х 106/мл. Плотность клеток не должен превышать 2 x 10-6/мл.
  3. Добавьте необходимое количество вируса P3, оцененной в 1.4.
  4. Растут зараженных культуру для 48-60 h на ~ 100 об/мин при 27 ° C в шейкере.
  5. Урожай клетки центрифугированием в < 1500 x g при 4 ° C.
  6. Сохраните Пелле клеток и отказаться от среднего.
  7. Перейти непосредственно к очищение протеина. Вспышки заморозить Пелле клеток в жидком азоте и хранить при температуре-80 ° C для использования в будущем.

3. Очистка его IKK133

  1. День 1, Ресуспензируйте Пелле клеток в 40 мл буфера Lysis (25 мм трис рН 8,0, 0,2% NP-40, 200 мм NaCl, имидазола 10 мм, 10% глицерина, 5 мм β-меркаптоэтанол и ингибитор протеазы коктейль).
    Примечание: Гранулы мокрой клеточной массы не был определен. Как правило ~ 2 L культуры был использован для этого шага.
  2. Лизировать клетки, sonication в 60-70% циклов, 5-10 импульсов продолжительностью 30 s с интервалом > 1 мин, сохраняя суспензию клеток охлажденной на льду.
    Примечание: Этот шаг требует оптимизации с каждой моделью sonicator. Не позволяйте образца подогревают выше 10 ° C.
  3. Уточнить lysate центрифугированием в 28000 x g ≥ 45 мин при 4 ° C.
  4. Сбалансировать 4 мл Ni-НТА агарозы смолы с буфера lysis и смесь осветленный lysate (супернатант) после производителя протокол.
  5. Разрешить белка, чтобы привязать смолы, инкубации 2 h на роторный смеситель в комнате 4 ° С.
  6. Тщательно вымойте смолаы с буфера lysis, содержащий 30 мм имидазола. Проверьте концентрация белка в периодически используя Assay Брадфорд мыть. Вымойте, до тех пор, пока эта концентрация белка в мыть достигает 0,1 мг/мл. Обычно для достижения этой точки требуется > 20 кровать объем буфера мытья.
  7. Элюировать его меткой IKK1/α белков под самотечный поток, с помощью 20 мл буфера (литического буфера, содержащий 250 мм имидазола). Сбор фракций 1-1,5 мл.
  8. Проверьте чистоту eluted белка на 8 или 10% геля SDS-страницы, загрузка 5-10 мкл пример из всех фракций, смешанного с буфер Лэмли.
  9. Бассейн пик фракций (концентрация ≥ 2 мг/мл) и измерять концентрацию протеина используя assay Брадфорд.
  10. Дайджест с ТРВ (1:30-50 (TEV протеазы: IKK1)) протеазы на ночь (≥12 h) при 4 ° C.
    Примечание: Оптимизировать количество ТэВ протеазы, необходимых для завершения 6 X-его тег априорипищеварение (≥ 95%). TEV протеазы был очищен в доме.
  11. На утро дня 2 Инкубируйте белка с 1 мм АТФ в присутствии 20 мм MgCl2, β-Глицерофосфат 20 мм, 10 мм NaF и Ортованадат натрия 1 мм на 1 ч при 27 ° C.
  12. Фильтр раствор белка через фильтр 0,45 или 0,22 мкм.
  13. Загрузка 6 мл образца на ~ 120 мл препаративные столбец Размер изоляции придает системе автоматизированных жидкостной хроматографии. Сбалансировать столбце с буфером A (20 мм трис-HCl (рН 7,5), 150 NaCl, 5 мм DTT, 5% глицерина), до применения образец протеина.
    Примечание: Меньше столбец может использоваться в зависимости от урожайности белка после Шаг очищение сродства Ni-НТА. Настройка/вычислить объем нагрузки 5% объема колонки).
  14. Размер-гель-проникающей хроматографии на скорости потока 1 мл/мин и отслеживать элюции 280 и 254 Нм. Сбор фракций размером 2 мл.
  15. Проверить чистоту пик фракций (обычно около ~ 60-70 мл) на геля SDS-PAGE 8-10%.
  16. Бассейн чистый фракций (≥95% чистоты с концентрацией ≥0.5 мг/мл) и концентрироваться в 10 кДа или 30 кДа молекулярный вес производства центробежных белка концентратор следуя инструкциям производителя.
  17. Периодически проверять концентрацию белка концентрата методом Брэдфорд и сконцентрировать образца до 8-12 мг/мл.
  18. Отказаться от 25 мкл аликвоты и флэш-замораживание в жидком азоте. Храните эти флэш замороженных образцов в морозильной камере-80 ° C.

4. экран для кристаллизации состояние IKK1

  1. Рассчитайте общее количество белков, необходимых для экрана для кристаллов методов, описанных ниже (по объему).
  2. Попробуйте различные ингибиторы (универсальный протеинкиназы ингибиторов: AMPPNP и Staurosporine; IKK-specific ингибиторов: MLN120B, соединение A и IKK-ингибитор XII) для выполнения проверки для кристаллизации. Сделайте акций решения этих соединений, следуя инструкциям производителя. Убедитесь, что максимальная концентрация комплекса в его Стоковый раствор не превышает 20 мкм.
  3. Подготовить комплекс IKK:inhibitor для кристаллизации экрана путем смешивания 100 мкм IKK1 с 200 мкм ингибитор и Инкубируйте на 18-20 ° C за 30-40 мин центрифуга эту смесь на > 15000 x g на 2 мин при комнатной температуре. Сохраните супернатант для кристаллизации экрана.
  4. Использование коммерчески доступных кристаллизации экраны (см. Таблицу материалов).
  5. Пипетка 80-100 мкл Реагента каждого кристаллизации (водохранилище решения), используя многоканальные пипетки или робот, в водохранилище, 96-луночных плиты. Пластину теперь готов для установки капли. Убедитесь, что пластины могут разместиться кристаллизации 2-3 капли, так что 2-3 ингибиторы могут проверяться в одной пластине.
  6. С помощью робота кристаллизации, обойтись и смесь 0,2 – 0,25 мкл IKK1:inhibitor комплекс с такой же объем водохранилища решения.
    Примечание: Скрининг может выполняться вручную с использованием больших объемов падение (0,5-1,0 мкл IKK1:inhibitor комплекс с такой же объем водохранилища решения). Однако использование робота поможет сохранить ценные реагентов.
  7. Уплотнение пластины сразу же после установки капли с оптически ясно фильмов, чтобы избежать испарения. Уплотнение должным образом с помощью соответствующих аппликатор. Сделайте пластины реплики для каждого набора ингибитора. Инкубируйте одной пластины на 18 ° C, а другой в холодной комнате (температурный диапазон ~ 4 – 6 ° C). Убедитесь, что инкубаторы не подвержены вибрации.
  8. Используйте стереомикроскопом с поляризатора для проверки внешний вид кристаллов в каждой капле каждый день в течение первых семи дней, а затем на более длительные интервалы. Систематически внимание и оценка этих наблюдений.
    Примечание: Используйте стереомикроскопом с поляризатором, так что можно визуально оценить рост дефекты в кристаллах. Здесь кристаллы появился в состоянии где водохранилище решения содержится 3% w/v декстран сульфата натрия соли Mr 5000, 0,1 М BICINE рН 8,5, 15% w/v полиэтиленгликоль 20000. Кристаллы IKK1 вырос только в присутствии IKK-ингибитор XII.

5. Кристалл роста оптимизации29,33

  1. Подготовка запасов решений.
    1. Подготовка 30% w/v решения декстран сульфата разной молекулярной массы (Avg. МВт 5000, 8000, 15000, 40000 да) в дейонизированной H2O. фильтр решение с использованием фильтров 0,22 мкм.
    2. Подготовка 1 М или 0,5 М запасов различных буферов в диапазоне pH от 6,5 до 9. Фильтр решения с использованием фильтров 0,22 мкм.
    3. Подготовка 25% или 50% (w/v) ПЭГ решения разной молекулярной массы (Avg. MW:1000, 1500, 3350, 4000, 6000, 8000, 10000, 12000, 20000 да). Фильтр решения с использованием фильтров 0,22 мкм.
    4. Выполните сетки экрана изменяя систематически рН, тип буфера, концентрации и тип привязки и декстран сульфата.
  2. Оптимизация проверки как на 18 ° C, так и в холодной комнате (температурный диапазон ~ 4-6 ° C).
  3. Mix равное количество IKK1:Inhibitor комплекс хорошо раствором и инкубировать также решения в закрытой среде. Этот шаг может быть выполнена вручную или с помощью робота дозирования.
    Примечание: Здесь, крупнейший и четко кристаллы (по оценкам однородного цвета под поляризатор, которая указывается форма роста) были получены при следующих условиях: 100 мм BisTris pH 7.0, 2.8-3,5% декстран сульфата (средняя 15 МВт кДа), 20 PEG 8,5-10% кДа в холодной комнате.

6. выращивания кристаллов в больших количествах

  1. Подготовить следующие решения запасов и их фильтрации через 0,22 мкм фильтр.
    1. Подготовьте 0,5 М BisTris pH 7.0 и BisTris пропан pH 7.0 и 7.5.
    2. Подготовка 30% (w/v) декстран сульфата (средняя МВт ~ 15 кДа). Хранить при 4 ° C.
    3. Подготовка 50% ПЭГ (средняя МВт ~ 12 кДа).
  2. Использование 24 хорошо висит падение пластины.
  3. Наносите смазку герметик на поднятые кольца каждой скважины.
  4. Подготовить хорошо решение следующим образом (конечная концентрация): 100 мм 2,8 – 3,5% декстран сульфата ~ 15 кДа, BisTris рН 7,0-7,5, 8,5-10% PEG ~ 12 кДа. Подготовьте хорошо 1 мл раствора в 1,5 мл пробирок.
    Примечание: Незначительные изменения состояния кристаллизации было отмечено, в зависимости от пакета белка, и/или декстран сульфата, таким образом пробу узкого круга рекомендуется. BisTris и BisTris пропан буферов же рН доходность монокристаллов.
  5. Храните хорошо решения и смазанную маслом тарелки в холодной комнате для по крайней мере 1 час.
  6. Подготовка IKK1:Inhibitor комплекс, как описано в разделе 4.3. Трансфер хорошо решения от 1.5 мл пробирок отдельных скважин 24 хорошо пластины.
  7. Чистой силиконизированный (коммерческие или внутренних (siliconization/silanization)) стеклянная крышка скользит с помощью безворсовой салфетки и применить воздушных форсунок высокого давления pinpointed использование коммерчески доступных аэрозоля тряпкой.
  8. Место 1 – 1.5 мкл раствора хорошо на чистой крышка выскальзования. Пипетка равный объем IKK1:inhibitor комплекс, осторожно перемешать, закупорить вверх и вниз 3 - 4 раза. Повернуть стекло крышки выскальзования и место на соответствующих хорошо с щипцами и печать также, нажав на смазку.
  9. После настройки все капли пластины 24-Ну, Инкубируйте пластину в холодной комнате в темноте. Время от времени проверяйте капли под микроскопом появление и рост кристаллов.
    Примечание: Это не тестировалась ли инкубации хрустальные пластины под свет будет изменить результат. Важно, однако, что пластины инкубируют в среде с минимальной/нет вибрации.

7. крио защиты кристаллов

  1. Подготовка крио решений.
    1. Подготовить Cryo A (~ 2% декстран сульфата, ~ 10% PEG 12000, 60 мм BisTris пропан (Всего же рН как решение предназначенных хорошо), 5 мм трис рН 7,5, 40-50 мм NaCl, 2,5% глицерина).
    2. Подготовить Cryo B (~0.3% декстран сульфата, ~ 10% PEG 12000, 60 мм BisTris пропан (Всего же рН как решение предназначенных хорошо), 5 мм трис рН 7,5, 40-50 мм NaCl, 20 или 25% глицерина или 20 или 25% этиленгликоля).
      Примечание: Испытания различных крио буферные помимо глицерина и этиленгликоля (например, ПЭГ 200, ПЭГ-400, ЗАБОЛТАТЬ 550 MME, 1000, ПЭГ).
  2. Аккуратно удалите скольжения крышка стекла, содержащие кристалл и поместите его на твердую поверхность с кристалл падение вверх. Аккуратно добавить 10 мкл Cryo A решения поверх падение и осторожно перемешать, закупорить так что кристалл не тронули.
    Примечание: Это очищает поверхности кристалла мусора и помочь сбалансировать кристалла с первоначального крио буфера. Избегайте механических и термических напряжений для кристалла. Выполните все последующие под микроскопом, чтобы избежать повреждения кристалла.
  3. Медленно удалить некоторые жидкости из хрусталя и держать около 5-8 мкл раствора. Избегайте обезвоживания кристалла. Принять крайней осторожностью, чтобы избежать механического напряжения и обезвоживания кристалла на всех последующих этапах.
  4. Аккуратно добавить 2,5 – 4 мкл раствора Cryo B на падение, очень осторожно перемешать, закупорить. Крышка с небольшой Петри, чтобы избежать прямого воздушного потока через кристалл. Подождите 5 минут всегда будьте осторожны, что кристалл не страдают быстрые изменения осмотического давления или обезвоживания.
  5. Повторите шаг 7.4 четыре раза медленно акклиматизировать кристалл в крио раствор.
  6. Держите 10 – 20 мкл раствора крио на данном этапе (т.е., позволяют кристалл, чтобы быть купались в около 20-25% крио Протравитель содержащих раствор). Замочите в течение различных периодов времени (5 мин до 1 часа) в крио решение.
  7. Заморозить несколько кристаллов в различные моменты времени.
  8. Тщательно выберите один кристалл от падения в соответствующей крио цикл монтируется на надлежащей базы и Плунге замораживание в жидкости N2. Выполните этот шаг, плавно и быстро чтобы избежать образования льда на кристалл.
    Примечание: Выберите кристалл, с помощью петли диаметром чуть больше, чем длинная ось кристалла, так что он может быть установлен в роботизированной гониометр, используемые в расширенный источник фотон, Аргоннской национальной лаборатории.
  9. Магазин хрусталя, содержащие крио петель шайбы, погружен в жидкость N2. Храните эти шайбы в жидкости N2 Дьюара до тех пор, пока они готовы к отгрузке для рентгеновской дифракции на синхротрона. Перейти к дифракции рентгеновских лучей сбора и обработки данных (разделы 8 и 9).
    Примечание: Дифракции данных IKK1 кристаллов из дома рентгеновских источников не были достаточно высокого разрешения для испытаний определение структуры, хотя это качество кристаллов проверяться на синхротронную. Все дифракции данные были собраны в разных излучение (преимущественно 19ID) заранее Фотон источник, Аргоннская национальная лаборатория, США.

8. рентгеновская сбора данных

  1. Сбор данных рентгеновской дифракции на ID19 излучение источника синхротронного APS, с использованием данных дистанционного сбора программного обеспечения34.
    Примечание: Свыше 100 кристаллов были протестированы для их свойств дифракции. Кристаллы обычно дифрагированных резолюции 7-11 Е, только редк кристаллы, которые дифрагированных за 5 Å были наблюдаемых и только один большой кристалл дифрагированных за 4.5 Å. Поскольку кристаллы распались быстро во время сбора данных, наборы данных в разных частях же кристалл были собраны. Это стало возможным, поскольку большие кристаллы (больше чем 400 мкм), и диаметр пучка используется 100 мкм.

9. рентгеновская обработка данных

  1. Слияние всех наборов данных, собранных на различных частях же кристалл34.
    Примечание: семь наборов данных были объединены из лучших кристалл, и полученные данные было 93% завершения. В целом я / σ ~ 6.8) и Rmerge составила 89% в высокой резолюции бин (5,4-4.5 Å).
  2. Наборы данных процесса с34 HKL2000 для получения пространства группа, размеры клеток, содержание растворителей и правдоподобными состав асимметричного подразделения.

10. Структура решение

  1. Подготовка моделей поиска
    1. На основании имеющихся структурных моделей hIKK2 (pdb идентификатор 4E3C и 4KIK35), генерировать серию димеры с различными ориентациями KD N-терминальный (что делает открытие 30 и 62 Å, между P578 два КД в димер). Ни одна из этих моделей выбраны молекулярной замена Поиск решения после обширных испытаний.
    2. Создание карты IKK1 от одной частицы крио ет данных33.
    3. Создать модель человека IKK1 от высоких резолюция структуры IKK2 (pdb id 4KIK).
    4. Закрепите отдельные домены человека IKK1 модели в крио EM плотность карта человека IKK1 с помощью ЛЫСУХА36. Это поворачивается KD ориентации около 24 градуса и изменение открытия до ~ 58 Е N-терминала.
    5. Применить KD ориентации крио ет установлены модели (мономер) для всех димеры сгенерирована 10.1.1.
  2. Молекулярные замена
    1. Использование димеры 10.1.1 и 10.1.5 как поиск моделей в программах PHASER37, MOLREP38 и39,ЦНС40.
      Примечание: Здесь, используя один из димеров от 10.1.5 (52 открытие Å) как a поиск модели, шесть димеров (два hexamers) были расположены в группе асимметричных с помощью MOLREP. 52 Å, открытие в модели поиска похож на 49-50 Å открытие димеров (все шесть димеры) в структуре изысканный.

11. Структура уточнение

  1. Процедура уточнения структуры
    1. Исправить ориентации и положения этой первоначальной модели изысканностью твердого тела в ЦНС (cns_solve_1.3)39,40.
    2. Уточнение структуры, далее с помощью минимизации и имитации отжига с максимального правдоподобия целевой функции и коррекция плоской оптом растворитель, используя ЦНС системы39,40.
    3. Построить модель, основанная на 2FO-FC и Fo-ФК карты с использованием Xtalview41.
      Примечание: Применяется при содействии ден уточнение42 и NCS сдерживать во время уточнения для улучшения точности модели. Действительно ден уточнение значительно улучшились геометрии и R-факторов структуры и R-фактор составил 22,2% и бесплатные R-фактор был 27,8% для окончательной модели. Резкое улучшение бесплатные R должно быть вызвано высокой точности модели IKK1 доменов, которые были получены из модели IKK2 (4KIK).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клонирование и выражения различных конструкций IKK1/α
Полная длина, которую человеческий IKK1/α был клонирован в pFastBacHTa вектор бакуловирусы выражение в его EcoRI и Ноти места ограничения для получения N-терминальный гекса гистидина с меткой IKK1. Тег может быть удалены ТэВ протеазы пищеварение. Так как полная длина IKK1/α содержит гибкие регионов на обоих концах, и гибкие регионы обычно обрабатывают белок сложных кристаллизуются, мы клонированные различные фрагмен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Производство, кристаллизации и структура решение двух родственных белков IKK
Мы задались целью определить рентгеновского Кристаллическая структура IKK1/α с понятием, что было бы относительно просто упражнения, учитывая наш опыт работы с IKK2/β производства белка, кристаллизации и определения структуры. Однако мы были весьма удивлены тем, что эти два родственных белков повел себя очень по-разному отношении легкость кристаллизации. Несмотря на усилия, от нескольких громких лаборатории определение структ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что без финансовых интересов или другие конфликты интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим сотрудников на излучение 19ID, 24ID и 13ID на расширенный источник фотон, Лемонт, Иллинойс, для поддержки во время сбора данных о различных кристаллов. Мы благодарны Lyumkis Дмитрий, Солка институт для выборки нас низким разрешением крио Эм карта на ранних стадиях Эм карта/построения модели, которая использовалась для построения начального IKK1 молекулярные замена Поиск модели. Исследований, приведших к эти результаты получил финансирование от НИЗ грантов, AI064326, CA141722 и GM071862 гг. SP в настоящее время Добро пожаловать доверять DBT Индии промежуточных парень.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cellfectin/Cellfectin IIThermo Fisher Scientific10362100Cellfectin в настоящее время снят с производства, заменен на Cellfectin II
Sf900 III Среда для клетокнасекомых Thermo Fisher Scientific12658-027
SF9 cellsThermo Fisher Scientific12659017
антитело против IKK1Novus BiologicalsNB100-56704Ранее продавалось Imgenex
анти-PentaHis антителоQiagen34460
PVDF мембранаMilliporeIPVH00010Nitroцеллюлоза также может быть использована
Ni-NTA агарозаQiagen30210
Bradford анализ реактивBioRad500001
Superdex 200 колонкаGE Healthcare28989335
концентратор AmiconMilliporeUFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Соединение ABayer
Calbiochem IKK-ингибитор XIICalbiochem401491
StaurosporineSIGMAS4400
MLN120BMilleniumПодарочный товар
AMPPNPSIGMAA2647
Сульфат декстранаSIGMA51227, 42867, 31404,
сульфат декстранаAlfa AesarJ62101
PEGSIGMA93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172Некоторые из них являются новыми Cat # в каталоге SIGMA. То, что у нас было, было родом от Fluka, у которого был другой Cat #.
Кристаллизационные сита
Crystal Screen I и II (Crystal Screen HT)Hampton ResearchHR2-130
Index HTHampton ResearchHR2-134
PEG/Ion и PEG/Ion2 (PEG/Ion HT)HamptonResearch HR2-139
PEGRX 1 и PEGRx 2 (PEGRx HT)Hampton ResearchHR2-086
SaltRx 1 и SaltRx 2 (SaltRx HT)Hampton ResearchHR2-136
Crystal MountsHampton ResearchHR8-188, 190, 192, 194
СинхротронУсовершенствованный источник фотонов (APS) в Министерстве энергетики США' s Аргоннская национальная лабораторияBeamline 19 IDУсовершенствованный источник фотонов (APS) в Министерстве энергетики США' s Аргоннская национальная лаборатория поставляет сверхяркие, высокоэнергетически аккумулирующие кольцевые рентгеновские пучки для исследований практически во всех научных дисциплинах.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xia, Y., Shen, S., Verma, I. M. NF-kappaB, an active player in human cancers. Cancer immunology research. 2 (9), 823-830 (2014).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140 (6), 883-899 (2010).
  3. Ben-Neriah, Y., Karin, M. Inflammation meets cancer, with NF-kappaB as the matchmaker. Nature immunology. 12 (8), 715-723 (2011).
  4. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO reports. 15 (1), 46-61 (2014).
  5. Karin, M., Ben-Neriah, Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-[kappa]B activity. Annu Rev Immunol. 18, 621-663 (2000).
  6. Ghosh, S., Karin, M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 109, Suppl . S81-S96 (2002).
  7. Sun, S. C. The noncanonical NF-kappaB pathway. Immunol Rev. 246 (1), 125-140 (2012).
  8. Bonizzi, G., Karin, M. The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol. 25 (6), 280-288 (2004).
  9. DiDonato, J. A., Hayakawa, M., Rothwarf, D. M., Zandi, E., Karin, M. A cytokine-responsive IkappaB kinase that activates the transcription factor NF-kappaB. Nature. 388 (6642), 548-554 (1997).
  10. Werner, S. L., Barken, D., Hoffmann, A. Stimulus specificity of gene expression programs determined by temporal control of IKK activity. Science. 309 (5742), 1857-1861 (2005).
  11. Zandi, E., Rothwarf, D. M., Delhase, M., Hayakawa, M., Karin, M. The IkappaB kinase complex (IKK) contains two kinase subunits, IKKalpha and IKKbeta, necessary for IkappaB phosphorylation and NF-kappaB activation. Cell. 91 (2), 243-252 (1997).
  12. Rothwarf, D. M., Zandi, E., Natoli, G., Karin, M. IKK-gamma is an essential regulatory subunit of the IkappaB kinase complex. Nature. 395 (6699), 297-300 (1998).
  13. Yamaoka, S., et al. Complementation cloning of NEMO, a component of the IkappaB kinase complex essential for NF-kappaB activation. Cell. 93 (7), 1231-1240 (1998).
  14. Li, Z. W., et al. The IKKbeta subunit of IkappaB kinase (IKK) is essential for nuclear factor kappaB activation and prevention of apoptosis. J Exp Med. 189 (11), 1839-1845 (1999).
  15. Hayden, M. S., Ghosh, S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell. 132 (3), 344-362 (2008).
  16. Sun, S. C., Chang, J. H., Jin, J. Regulation of nuclear factor-kappaB in autoimmunity. Trends Immunol. 34 (6), 282-289 (2013).
  17. Claudio, E., Brown, K., Park, S., Wang, H., Siebenlist, U. BAFF-induced NEMO-independent processing of NF-kappa B2 in maturing B cells. Nat Immunol. 3 (10), 958-965 (2002).
  18. Senftleben, U., et al. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF-kappa B signaling pathway. Science. 293 (5534), 1495-1499 (2001).
  19. Coope, H. J., et al. CD40 regulates the processing of NF-kappaB2 p100 to p52. EMBO J. 21 (20), 5375-5385 (2002).
  20. Dejardin, E., et al. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity. 17 (4), 525-535 (2002).
  21. Xiao, G., Fong, A., Sun, S. C. Induction of p100 processing by NF-kappaB-inducing kinase involves docking IkappaB kinase alpha (IKKalpha) to p100 and IKKalpha-mediated phosphorylation. The Journal of biological chemistry. 279 (29), 30099-30105 (2004).
  22. Xiao, G., Harhaj, E. W., Sun, S. C. NF-kappaB-inducing kinase regulates the processing of NF-kappaB2 p100. Molecular cell. 7 (2), 401-409 (2001).
  23. Qing, G., Qu, Z., Xiao, G. Stabilization of basally translated NF-kappaB-inducing kinase (NIK) protein functions as a molecular switch of processing of NF-kappaB2 p100. J Biol Chem. 280 (49), 40578-40582 (2005).
  24. Zarnegar, B. J., et al. Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol. 9 (12), 1371-1378 (2008).
  25. Vallabhapurapu, S., et al. Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol. 9 (12), 1364-1370 (2008).
  26. Annunziata, C. M., et al. Frequent engagement of the classical and alternative NF-kappaB pathways by diverse genetic abnormalities in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 115-130 (2007).
  27. Keats, J. J., et al. Promiscuous mutations activate the noncanonical NF-kappaB pathway in multiple myeloma. Cancer cell. 12 (2), 131-144 (2007).
  28. Staudt, L. M. Oncogenic activation of NF-kappaB. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2 (6), a000109(2010).
  29. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS Biol. 11 (6), e1001581(2013).
  30. Hinz, M., Scheidereit, C. The IkappaB kinase complex in NF-kappaB regulation and beyond. EMBO Rep. 15 (1), 46-61 (2014).
  31. Scheidereit, C. IkappaB kinase complexes: gateways to NF-kappaB activation and transcription. Oncogene. 25 (51), 6685-6705 (2006).
  32. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. J Virol. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  33. Polley, S., et al. Structural Basis for the Activation of IKK1/alpha. Cell reports. 17 (8), 1907-1914 (2016).
  34. Otwinowski, Z. aM., W, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. Methods in Enzymology. 276 (Macromolecular Crystallography, part A), 307-326 (1997).
  35. Liu, S., et al. Crystal structure of a human IkappaB kinase beta asymmetric dimer. J Biol Chem. 288 (31), 22758-22767 (2013).
  36. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  37. McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. Journal of applied crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
  38. Vagin, A. T., Teplyakov, A. MOLREP: an automated program for molecular replacement. J. Appl. Cryst. 30, 1022-1025 (1997).
  39. Brunger, A. T. Version 1.2 of the Crystallography and NMR system. Nature protocols. 2 (11), 2728-2733 (2007).
  40. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta crystallographica. Section D, Biological. 54 (Pt 5), 905-921 (1998).
  41. McRee, D. E. XtalView: a visual protein crystallographic software system for X11/Xview. J. Mol Graph. 10, 44-47 (1992).
  42. Schroder, G. F., Levitt, M., Brunger, A. T. Super-resolution biomolecular crystallography with low-resolution data. Nature. 464 (7292), 1218-1222 (2010).
  43. Polley, S., et al. A structural basis for IkappaB kinase 2 activation via oligomerization-dependent trans auto-phosphorylation. PLoS biology. 11 (6), e1001581(2013).
  44. Christopher, J. A., et al. The discovery of 2-amino-3,5-diarylbenzamide inhibitors of IKK-alpha and IKK-beta kinases. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 17 (14), 3972-3977 (2007).
  45. Karplus, P. A., Diederichs, K. Linking crystallographic model and data quality. Science. 336 (6084), 1030-1033 (2012).
  46. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IKK1 AlphaProtein ExpressionInsect CellsBaculovirus SystemProtein PurificationSize Exclusion ChromatographyProtein CrystallizationX ray CrystallographyMolecular ReplacementStructure Determination

Похожие статьи