В C. elegans Excretory канал как модель для внутриклеточного люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза в одной ячейке: маркировка GFP-расплавы, RNAi взаимодействие экрана и изображений

Nan Zhang; Edward Membreno; Susan Raj; Hongjie Zhang; Liakot A Khan; Verena Gobel

doi:10.3791/56101

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В C. elegans Excretory канал как модель для внутриклеточного люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза в одной ячейке: маркировка GFP-расплавы, RNAi взаимодействие экрана и изображений

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56101

⸱

3 октября 2017 г.

Nan Zhang¹^,² , Edward Membreno¹ , Susan Raj¹ , Hongjie Zhang¹^,³ , Liakot A Khan¹ , Verena Gobel¹

¹Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children, Harvard Medical School, ²College of Life Sciences, Jilin University, ³Faculty of Health Sciences, University of Macau

В этой статье

Краткое содержание

В C. elegans выделительной канал является уникальный одноячеечной модели для анализа визуальных в vivo биогенеза de novo поляризованной мембраны. Этот протокол описывает сочетание стандартных генетических/RNAi и изображений подходы, пригодных для идентификации и определения характеристик молекул, направляя одноклеточные tubulogenesis и апикальном мембрана и Люмене биогенеза.

Аннотация

Четыре C. elegans выделительной каналы являются узкие трубки продлен через длину животного из одной клетки, с почти одинаково далеко расширенной внутриклеточных endotubes, что строить и стабилизировать люмен с мембраной и submembraneous Цитоскелет апикальной характера. Выделительной ячейки расширяет его длина около 2 000 раз для создания этих каналов, делая эта модель уникальной в естественных условиях оценки de novo поляризованной мембраны биогенеза, внутриклеточный люмен морфогенеза и одноклеточные tubulogenesis. Протокола, представленные здесь показано, как объединить стандарта маркировки, выгоды и потери из функцию - генетических или РНК-интерференции (RNAi)-и микроскопический подходы использовать эту модель для визуально анализировать и функционально анализа этих процессов на молекулярном уровне. Как пример маркировки подхода Протоколе излагаются поколения трансгенных животных с флуоресцентные синтез белков для живой анализа tubulogenesis. Как пример генетического подхода в нем освещаются ключевые моменты визуальный РНК-интерференции на основе взаимодействия экран предназначен для изменения фенотипа кистозных канал усиления функции. Конкретные методы, описанные в как: ярлык и визуализировать каналов, выражая флуоресцентных белков; построить библиотеку целевых RNAi и выработать стратегию RNAi скрининг для молекулярного анализа канал морфогенеза; визуально оценить изменения канала фенотипов; Оценка их путем рассечения микроскопии флуоресцирования; характеризуют канал субцеллюлярные компоненты с более высоким разрешением, confocal микроскопии; и количественно визуальных параметров. Этот подход полезен для следователя, кто заинтересован в использовании преимуществ в C. elegans выделительной канал для выявления и классификации генов, участвующих в филогенетически сохранены процессах внутриклеточного просвета и одноклеточные трубка морфогенеза.

Введение

Все внутренние органы состоят из трубок, решающее значение для их много разных функций, таких как транспорта и обмен газов, жидкостей и питательных веществ и выведение метаболических отходов. Их поляризованный характер, с собственный апикальной и lumenal мембраны, приспособлен для этих конкретных функций, и дефекты в биогенеза их систем эндо - и плазматической мембраны являются частой причиной человеческих болезней¹^,². Большинство трубок сосудистую и внутренних органов многоклеточных и формируют просвет intercellularly; Однако одноклеточными трубок, которые формируют просвета внутриклеточно, можно например, пр....