Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56169

⸱

9 апреля 2018 г.

 ,  , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

В этой статье

Краткое содержание

Представлен подробный протокол мыши модели для энтерогеморрагические E. coli (EHEC) колонизации с помощью биолюминесценции меченых бактерий. Обнаружение этих биолюминесцентных бактерий неинвазивные в vivo imaging системы в живых животных можно заранее нашего нынешнего понимания особенностей ЭГКП колонизации.

Аннотация

Энтерогеморрагические E. coli (EHEC) O157: H7, который является пищевых патогенов, causesdiarrhea, геморрагический колит (СС), и гемолитический уремический синдром (ГУС), колонизации кишечного тракта человека. Чтобы изучить подробные механизм ЭГКП колонизации в естественных условиях, важно иметь животных моделей для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации. Мы демонстрируем здесь модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, превращая биолюминесцентных выражая плазмиды к инфекции ЭГКП для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации в жизни хозяев. Животные привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП Показать интенсивной биолюминесцентных сигналов в мышей обнаружения с неинвазивные в vivo imaging системы. После того, как 1 и 2 дней после инфицирования, биолюминесцентных сигналы могут по-прежнему быть обнаружены в зараженных животных, который свидетельствует о том, что ЭГКП колонизировать в hosts для по крайней мере 2 дней. Мы также продемонстрировать, что эти биолюминесцентных ЭГКП locate для мыши кишечника, особенно в слепой кишки и толстой кишки, от ex vivo изображений. Эта модель колонизации мыши ЭГКП может служить в качестве инструмента для продвижения текущий набор знаний о механизме колонизации ЭГКП.

Введение

EHEC O157: H7 является возбудителя, который вызывает понос1, HS2, Гус3и4 даже острая почечная недостаточность через загрязненной воды или пищи. ЭГКП является патогенным enterobacterium и колонизирует желудочно-кишечного тракта человека1. Когда впервые ЭГКП придерживаться принимающей кишечного эпителия, они впрыскивают факторов колонизации в клетки хозяина через систему секреции типа III (T3SS), которая функционирует как молекулярные шприц вызывая присоединения и их стирания (A/E) поражения впоследствии для обеспечения адгезия (колонизация)5. Эти гены, участвующих в формировании A/E поражения кодируются Локус энтероцитах самоотречение (ли) патогенности остров5.

Биолюминесценции — свет производителей химическая реакция, в которой Люцифераза катализирует ее люциферин субстрат для создания видимый свет6. Это ферментативный процесс часто требует присутствия кислорода или аденозинтрифосфатом (АТФ)6. Биолюминесценции изображений (BLI) позволяет исследователям визуализации и квантование хост возбудитель взаимодействий в живых животных7. BLI могут характеризовать цикла бактериальной инфекции в живых животных, следуя биолюминесцентных бактерий, как они мигрируют к и вторгнуться в7различных тканей; Это показывает динамический прогрессирования инфекции. Кроме того бактериальной нагрузки в животных связана с биолюминесцентных сигнал8; Таким образом он является удобным показателем для оценки патологических условиях экспериментальных животных в простой и прямой путь.

Плазмиды, здесь содержится Оперон Люцифераза, luxCDABE, который от бактерии Photorhabdus luminescens , который кодирует его собственный Люцифераза субстрата7,9. Путем преобразования этого выражения Люцифераза плазмида в бактерии, колонизации и инфекции процессы может контролироваться путем наблюдать эти биолюминесцентных бактерий в живых животных. В целом BLI и биолюминесценции меченых бактерий позволяют исследователям для мониторинга бактериальных числа и местоположения, бактериальных жизнеспособности с антибиотиков терапии и выражение гена бактериальной инфекции/колонизации6, 7. поступили многочисленных патогенных бактерий, что Экспресс luxCDABE Оперон для изучения их выражение цикла и/или гена инфекции в инфекции. Эти бактерии, включая uropathogenic E. coli10, ЭГКП8,11,12,13, энтеропатогенные E. coli (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, Salmonella typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, и холерный вибрион20, документально подтверждены.

Некоторые экспериментальные модели были разработаны для содействия изучению колонизации ЭГКП in vitro и in vivo22,-21,23. Однако есть отсутствие подходящих животных моделей для изучения ЭГКП колонизации в естественных условияхи, таким образом, результирующая нехватка деталей. Чтобы облегчить изучение ЭГКП колонизации механизм в естественных условиях, он ценен для построения животных моделей для наблюдения и количественно ЭГКП колонизации в живых животных неинвазивным методом.

Эта рукопись описывает модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, которая использует систему биолюминесцентных выражая для мониторинга ЭГКП колонизации со временем в жизни хозяев. Мышей intragastrically привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП и биолюминесцентных сигнала в мышах с неинвазивные в vivo imaging системы13. Мышей, инфицированных биолюминесценции меченых ЭГКП, показали значительные биолюминесцентных сигналов в их intestine после 2 дней после инфекции, которая предлагает что эти бактерии колонизировали в кишечнике хоста через 2 дня после заражения. Ex vivo данные изображения показали, что этот колонизации специально в слепой кишки и толстой кишки мышей. С помощью этой модели мыши-инфекции ЭГКП, биолюминесцентных колонизации ЭГКП могут быть обнаружены в узле жизни в естественных условиях imaging системы, чтобы изучить подробные механизмы колонизации кишечных бактерий, которые могут способствовать дальнейшему пониманию в ЭГКП индуцированной физиологические и патологические изменения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Предупреждение: EHEC O157: H7 представляет собой биобезопасности уровня 2 (BSL-2) возбудителя по данным центров по контролю над заболеваниями и профилактике (CDC) Инструкция по биобезопасности (https://www.cdc.gov/). Таким образом должны выполняться все экспериментальные процедуры с участием ЭГКП в объекте BSL-2. Носите пальто лаборатории и перчатки при выполнении эксперимента. Работа в сертифицированных биобезопасности кабинета (BSC). Продезинфицируйте экспериментальный стенд до и после экспериментальной процедуры с 70% этиловом спирте. Все инструменты или оборудование, что контакт (или потенциально контакта) ЭГКП должен быть вылечен с 70% этанол или отбеливатель. Загрязненных (или потенциально загрязненной) отходов должны быть опечатаны и автоклавного тщательно. Носите маску, защита глаз, двойные перчатки или комбинезон, при необходимости. Самок мышей C57BL/6 6 week-old были приобретены и поддерживается на лабораторных животных центр национальных Ченг Кунг-университета (NCKU). Эксперименты на животных были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета NCKU (номер 104-039 утверждения).

1. Bioluciferase меченых ЭГКП бактерий поколение

  1. Mix 50 нг дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), 1 мкл 10 мкм вперед и назад грунтовки, deoxynucleotides 2,5 мм 2 мкл (дНТФ), 2 мкл 10 x буфер, 0.2 мкл ДНК-полимеразы и стерильные двойной дистиллированной воды (ddH2O) окончательный объем 20 мкл усилить анти канамицин кассеты, nptII гена24. Шаблон ДНК-pBSL18024, которое закупается из национального проекта Биоресурс (NBRP). Условия PCR, перечислены в таблице 1 и последовательность праймера доступен в таблице 2.
  2. Перевязать продукты PCR коммерческие клонирования вектор после комплект протокола (см. Таблицу материалы).
  3. Акцизный фрагмента гена nptII от клонирования вектор НСИИ и ссии и клонировать в pBBR1MCS4, которая усваивается НСИИ и ScaI от9 pAKlux2 для создания устойчивых канамицин плазмида, pWF27813.
  4. Акцизный luxCDABE Оперон от Люцифераза, выражая плазмида9, pAKlux2, SpeI-HF и ScaI и клон SpeI-HF и ссии переваривается pWF278 для генерации канамицин устойчивостью и Люцифераза, выражая плазмида, pWF27913.
    Примечание: Для экстракции плазмиды и очищения подакцизным фрагмент, используйте извлечения коммерческих плазмиды и комплект извлечения геля, соответственно. Пищеварение энзима смешать 100 нг ДНК, 1 мкл 10 x буфер, 1 мкл каждого выбранного энзима ограничения, и стерильные ddH2O до общего объема 10 мкл и инкубировать при 37 ° C для 2,5-3 ч.
  5. Превратить плазмида pWF279 кишечной палочки O157: H7 EDL933 сведущие клетки путем электропорации с 2500 V для 4 мс.
  6. Инкубируйте преобразованные бактерий клеток в среде Бертани Лурия (LB) 1 мл при 37 ° C в течение 1 ч.
  7. Пластина бактерий на плите агар LB дополнена 50 мкг/мл при 37 ° C для 16-18 ч канамицин.
  8. Проверьте биолюминесцентных сигнал пластины, в естественных условиях imaging машины на следующий день. Выбрать один колонии от плиты и культура в 3 мл LB дополнена 50 канамицин мкг/мл при 37 ° C для 16-18 ч.
  9. Подготовить бактериальных акций средних путем разбавления 100% глицерина в стерильных ddH2O сделать 30% раствором глицерина.
  10. Заморозить канамицин устойчивые бактерии e.coli O157: H7 EDL933, укрывательство Люцифераза плазмида как бактериальный запас в cryovial колпачок в соотношении 1:1 бактерии культуры и 30% раствора глицерина-80 ° c. Конечная концентрация глицерина составляет 15%.

2. биолюминесцентных ЭГКП бактерий подготовка устных прививка

Примечание: Схема шкалы времени экспериментальных процедур для подготовки ЭГКП и пероральная затравка мыши представлен в Рисунок 1 помощь в подготовке экспериментальных.

  1. Бактерии e.coli O157: H7 EDL933 полоска укрывательство Люцифераза плазмида на агар плиту LB с 50 мкг/мл канамицин от-80 ° C складе. Рост бактерий для 16-18 ч при 37 ° C.
  2. Выберите один колонии от ночи пластины и культуры в 3 мл LB среде с 50 мкг/мл канамицин для 16-18 ч в инкубаторе 37 ° C на 220 об/мин.
  3. Субкультура бактерий (разбавления 1: 100) в канамицин (50 мкг/мл), содержащий LB отвара для 2,5-3 ч в инкубаторе 37 ° C на 200 об/мин. (Например, добавьте 2 мл на ночь культивированный бактерий до 200 мл LB среднего с канамицин (50 мкг/мл) дополнены).
  4. Инкубировать бактерий для 2,5-3 ч и измерения оптической плотности значение 600 Нм (600OD) до значения составляет от 0,9 до 1. В плотность около 108 колонии формируя единиц (CFU) являются бактериальных клеток / мл.
  5. Центрифуга для повторного культивировали бактерий на 8000 x г за 30 мин., 4 ° C.
  6. Отменить супернатант без агитацию Пелле бактерий и помыть лепешка с 100 мл 0,9% стерильный физиологический, нежный агитации.
  7. Повторите шаги 2.5 и 2.6 один раз.
  8. После стирки центрифуга бактериальной культуры на 8000 x г за 30 мин., 4 ° C и аккуратно удалить супернатант.
  9. Конденсат гранулы в 100-кратного с стерильный физиологический 0,9%. Например если 200 мл бактерии центрифугируется, добавьте 2 мл физиологическим приостановить гранулы.
  10. Подтвердите бактерии CFU (она должна быть около 10 кое/100 мкл9 после конденсации, в нормальное saline), покрытие концентрации бактерий через десятикратного последовательного растворения25.

3. мыши пероральная затравка инфекции ЭГКП

  1. Лечить 6 week-old самок мышей C57BL/6 с водой (5 г/Л) стрептомицина за 24 ч.
  2. После 24 часов переключитесь на регулярные питьевой воды для другой 24 часа до кормления. После лечения с очередной воды за 24 часа, мышей готовы пероральная затравка инфекции ЭГКП.
  3. Заполните шприц с 100 мкл Бактерии ЭГКП, потянув обратно на поршень. Убедитесь, что нет пузырьков воздуха в шприц. Удалите пузыри, щелкая шприц с пальцами.
  4. Аккуратно поднимите животного и поместите его на верхней части клетки с осторожностью.
  5. Взяв хвост мыши тщательно, и животное ручка в верхней части клетки и пытаться уйти.
  6. Нежно сдерживать мыши, держа дряблая кожа шеи и задней животное с большим и указательным пальцами, чтобы предотвратить перемещение головы мыши.
  7. Удерживайте кнопку мыши в вертикальном положении, чтобы вставить иглу кормления и гарантировать, что глава мыши иммобилизованных и вертикальные.
  8. Вставьте иглу затравки в после крыши рот рот мыши и двигаться вниз в пищевод и желудок.
  9. При вставленной иглы половину или две трети длины в мышь, придать 100 мкл ЭГКП бактерий, которые содержат приблизительно 109 CFU клетки.

4. Визуализация

  1. После пероральная затравка обнаружить биолюминесцентных сигналы на 1 и 2 дня.
  2. Перед изучением биолюминесцентных сигналы животных, анестезировать их, поместив их в камеру 2,5% изофлюрановая с кислородом 1,5 Л/мин.
  3. Ждать 2-5 мин, до тех пор, пока все мыши становятся бессознательное и остановить перемещение. Животные готовы в естественных условиях обнаружения биолюминесценции.
  4. Обнаружение и изображения биолюминесцентных сигналы животных в естественных условиях изображений системы. Пожалуйста, смотрите раздел 5 «Сбор данных» для эксплуатации программного обеспечения. В процессе обработки изображений все животные находятся под продолжение поставок 2,5% изофлюрановая с кислородом 1,5 Л/мин.
    1. Нажмите Файл > жить и вручную сосредоточиться на мыши.
    2. Выберите время и лазерной интенсивности воздействия.
    3. Нажмите кнопку приобрести > захват.
  5. Для ex vivo изображений, усыпить мышей, вывих шейного и удалить весь intestine зараженных мышей. Поместите кишечника в чашке Петри 9-cm и изображения, в естественных условиях imaging системы. Параметр является таким же, как в естественных условиях изображений за исключением поле зрения устанавливается как A/B. Для подробной информации смотрите раздел 5 «Сбор данных».
    Примечание: Метод для шейки матки дислокации: сдерживать мышей на верхней части клетки, держа хвост с одной стороны, так что животные сцепление клетке. Поместите маркер ручка или палец и первым пальцем другой руки против задней части шеи у основания черепа. Быстро вперед рукой или объект запрещая головы и тянуть назад с рукой, держа хвост.
    Проверьте внимательно, чтобы подтвердить дыхания и нет пульса.

5. сбор данных

Примечание: Программное обеспечение, используемое для получения данных указана в Таблице материалов.

  1. Для захвата изображений откройте панель управления приобретение программного обеспечения (рис. 2).
  2. Выберите «Светящийся», «фотография» и «Наложение».
  3. Задать время экспозиции как «Auto». Установите биннинга как «Среднее».
  4. Установите ƒ/стоп как 1 для люминесцентных и 8 для фотографий. Ƒ/стоп контроля количество света получено датчик CCD.
  5. Установите поле зрения на основе поля изображения, которые представляют интерес для приобретения. Опция «D» может поместиться пять 6 week-old мышей и изображения их все одновременно. «C» можно изображения три 6-week-old мышей в одном поле.
  6. Как только мышей/образцы готовы для обработки изображений, нажмите кнопку «Приобрести» для захвата изображений.
  7. Откройте данные изображения, который был приобретен.
  8. Откройте палитру инструментов панель (рис. 3).
  9. Выберите Инструменты ROI. Мы рекомендуем круг (один слева), чтобы диапазон биолюминесцентных области изображения (рис. 4).
  10. Нажмите кнопку «Мера ROI» (значок карандаша) для измерения поверхности биолюминесцентных интенсивности (рис. 3). Панель измерения ROI и количественная оценка значения появляются (рис. 5).
  11. Используйте настройки измерения в левом углу панели ROI измерения для выбора значения/необходимую информацию (Рисунок 6), в противном случае нажмите кнопку «Экспорт», чтобы экспортировать эту таблицу данных и сохранить как CSV-файл (Рисунок 5).
  12. Используйте значения столбца «Всего потока (p/s)» как количественная оценка биолюминесцентных интенсивности в CSV-файле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы ведении помечены биолюминесценция ЭГКП (~ 109 бактериальной клетки) для 6 - неделю старых самок мышей C57BL/6 пероральная затравка. После устного прививка ЭГКП мышам в течение 1 ч животные были рассмотрены биолюминесцентных сигнала система электронного фотографирования в естественных условиях как показано на рисунке 7. Результаты показали сильный сигнал биолюминесцентных затравки мышей с помечены биолюминесценция ЭГКП. Мы изучили сигнал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сообщается, что ЭГКП преобразована с Люцифераза плазмида была использована для изучения его локализации в hosts или выражение гена в vivo8,,1112. Для обнаружения инфекции ЭГКП колонизировали сроков и локализации в мышиных хост8поступили также мышиных модели продемонстрировали здесь. Тем не менее мы предоставляем детали протокола как управлять ЭГКП прививка для мышей intragastrically и как подгото...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы признаем Чи-Чун Чен из департамента медицинских исследований, Chi Mei медицинский центр (Тайнань, Тайвань) за помощь в мыши, инфекции, а также поддержку от лабораторных животных центра национального университета Cheng Kung. Эта работа поддерживается министра науки и технологии (большинство) предоставляет CC (наиболее 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006--011,-005 and106-2321-B-006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шейкеринкубатор YIH DERLM-570Rинкубации бактерий 
Орбитальный встряхивающий инкубаторFIRSTEKS300для инкубации бактерий 
pBSL180источник гена nptII
pAKlux2источник luxCDABE operon
T& Набор для клонированияYeastern BiotechFYC001-20Pдля клонирования ТА 
Nsi INEBR0127Sиспользование для клонирования плазмид 
Sca INEBR0122Sиспользовать для клонирования плазмид 
Spe I-HFNEBR0133Sиспользование для клонирования плазмид 
Sma I NEBR0141Sиспользование для клонирования плазмид 
Использование Т4-лигазыNEBM0202Sдля клонирования плазмид 
Ex TaqTaKaRaRR001Aиспользование для амплификации ПЦР
10X Ex Taq БуферTaKaRaRR001Aиспользование для амплификации ПЦР
dNTP Mix TaKaRaRR001Aиспользование для ПЦР амплификации
ПЦР машинноеприменение Biosystem 2720 Термоамплификатор   для амплификации ПЦР
ГлицеринSIGMAG5516-1Lиспользовать для хранения бактерий
раствор NaClSigma31434-5KG-Rхимикат для приготовления LB среды, 10 г/л
ТриптонCONDA pronadisaCat 1612.00химикат для приготовления LB среды, 10 г/л
Порошок дрожжевого экстрактаAffymetrix23547-1 KGхимикат для приготовления LB среды, 5 г/л
АгарCONDA pronadisaCat 1802.00химикат для производства LB агара
канамицина СигмаК4000-5Gантибиотики, применение для сесецитона
стрептомицина АнтибиотикиSigma S6501-100G, устраняют микробиоту у мышей
компетентная клетка Домашнийнаходится в дополнительном документе;
ЭлектропораторMicroPulserдля электропорации
Кюветы для электропорацииGene Pulser/MicroPulser1652086для электропорации
Высокоскоростная центрифугаBeckman CoulterAvanti, J-26S XPиспользование для центрифугирования бактерий 
Ротор с фиксированным угломBeckman CoulterJA25.5для центрифугирования бактерий 
Ротор с фиксированным углом наклонаBeckman CoulterJLA10.5используется для центрифугирования бактерий 
центрифугные бутылкиBeckman CoulterREF357003использования для центрифугирования бактерий 
центрифуга флаконыThermo Fisher scientific3141-0500использование для центрифугирования бактерий 
Eppendorf Biophotometer Plus eppendorfAG 22331 hamburgдля измерения значения OD600 у
бактерий мышей C57BL/6 Центр лабораторных животных НЦКУ
лабораторный халат, перчаткидля защиты персонала 
изофлуран Панион и Панион BF Biotech Inc.G-8669для мышиной анестезии, фармацевтический
шприц 1 млиспользование для орального зондирования мышей
Многоразовая игла для кормления 22 г с шариковым наконечником 0,9 мм X Д 50 ммиспользование для орального зондирования мышей
хирургические  ножницы использование для эксперимента на мышах
Xenogen IVIS 200 imaging systemPerkin ElmerIVIS использование спектрадля захвата биолюминесцентных изображений 
Программное обеспечение Living Image дляPerkin Elmerверсии 4.1используется для количественной оценки данных изображения
для метод EDL933 наклона ;

Ссылки

  1. Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
  2. Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
  3. Tarr, P. I., Gordon, C. A., Chandler, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and haemolytic uraemic syndrome. Lancet. 365 (9464), 1073-1086 (2005).
  4. Obrig, T. G. Escherichia coli Shiga Toxin Mechanisms of Action in Renal Disease. Toxins (Basel). 2 (12), 2769-2794 (2010).
  5. Nguyen, Y., Sperandio, V. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 90(2012).
  6. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol Biol. 574, 137-153 (2009).
  7. Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9 (10), 2315-2322 (2007).
  8. Rhee, K. J., et al. Determination of spatial and temporal colonization of enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli in mice using bioluminescent in vivo imaging. Gut Microbes. 2 (1), 34-41 (2011).
  9. Karsi, A., Lawrence, M. L. Broad host range fluorescence and bioluminescence expression vectors for Gram-negative bacteria. Plasmid. 57 (3), 286-295 (2007).
  10. Lane, M. C., Alteri, C. J. S., Smith, S. N., Mobley, L. H. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (42), 16669-16674 (2007).
  11. Roxas, J. L., et al. Enterohemorrhagic E. coli alters murine intestinal epithelial tight junction protein expression and barrier function in a Shiga toxin independent manner. Lab Invest. 90 (8), 1152-1168 (2010).
  12. Siragusa, G. R., Nawotka, K., Spilman, S. D., Contag, P. R., Contag, C. H. Real-Time Monitoring of Escherichia coli O157:H7 Adherence to Beef Carcass Surface Tissues with a Bioluminescent Reporter. , (1999).
  13. Kuo, C. J., et al. Mutation of the Enterohemorrhagic Escherichia coli Core LPS Biosynthesis Enzyme RfaD Confers Hypersusceptibility to Host Intestinal Innate Immunity In vivo. Front Cell Infect Microbiol. 6, 82(2016).
  14. Wiles, S., et al. Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium. Cell Microbiol. 6 (10), 963-972 (2004).
  15. Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium. Infect Immun. 74 (9), 5391-5396 (2006).
  16. Contag, C. H., Contag, P. R., Mullins, J. I., Spillman, S. D., Stevenson, D. K., Benaron, D. A. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18 (4), 593-603 (1995).
  17. Hardy, J., Francis, K. P., DeBoer, M., Chu, P., Gibbs, K., Contag, C. H. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder. Science. 303 (5659), 851-853 (2004).
  18. Kaniga, K., Sory, M. P., Delor, I., Saegerman, C., Limet, J. N., Cornelis, G. R. Monitoring of Yersinia enterocolitica in Murine and Bovine Feces on the Basis of the Chromosomally Integrated luxAB Marker Gene. Appl Environ Microbiol. 58 (3), 1024-1026 (1992).
  19. Trcek, J., Fuchs, T. M., Trulzsch, K. Analysis of Yersinia enterocolitica invasin expression in vitro and in vivo using a novel luxCDABE reporter system. Microbiology. 156 (Pt 9), 2734-2745 (2010).
  20. Morin, C. E., Kaper, J. B. Use of stabilized luciferase-expressing plasmids to examine in vivo-induced promoters in the Vibrio cholerae vaccine strain CVD 103-HgR. FEMS Immunol Med Microbiol. 57 (1), 69-79 (2009).
  21. Law, R. J., Gur-Arie, L., Rosenshine, I., Finlay, B. B. In vitro and in vivo model systems for studying enteropathogenic Escherichia coli infections. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (3), a009977(2013).
  22. Ritchie, J. M. Animal Models of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection. Microbiol Spectr. 2 (4), EHEC-0022-2013(2014).
  23. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cell Microbiol. 15 (1), 82-97 (2013).
  24. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tnl 0 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of Gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  25. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
  26. Pansare, V., Hejazi, S., Faenza, W., Prud'homme, R. K. Review of Long-Wavelength Optical and NIR Imaging Materials: Contrast Agents, Fluorophores and Multifunctional Nano Carriers. Chem Mater. 24 (5), 812-827 (2012).
  27. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  28. Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).
  29. Frangioni, J. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 626-634 (2003).
  30. Collins, J. W., et al. Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota. Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).
  31. Mallick, E. M., et al. A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli. J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).
  32. Petty, N. K., et al. The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli. J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).
  33. Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M. II, Peterson, K. M. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
  34. Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA. Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).
  35. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).
  36. Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS). BMC Med. 10, (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

энтерогеморрагическая кишечная палочкабиолюминесцентная визуализациявизуализация in vivoмодель колонизации мышейметод перорального зондированияколичественное определение люминесценцииколонизация слепой кишкиколонизация ободочной кишкивизуализация ex vivoнеинвазивное обнаружение
Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.