Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Дифференцирование линий стволовых клеток мыши Предимплантационная эмбрионов

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56171

⸱

20 августа 2017 г.

 ,  , 
1Unitat de Biologia Cellular, Facultat de Biociències, Universitat Autònoma de Barcelona

В этой статье

Краткое содержание

Эта статья описывает протокол эффективно получать и культуры линии плюрипотентных стволовых клеток эмбрионов мыши на стадии бластоцисты.

Аннотация

Дифференцирование мыши эмбриональных стволовых клеток (mESC) это процесс, посредством которого плюрипотентных клеточных линий созданы с предимплантационной эмбрионов. Эти линии сохраняют способность самостоятельно обновить или дифференцировать при определенных условиях. Благодаря этим свойствам mESC являются полезным инструментом в регенеративной медицины, болезни моделирования и инженерные исследования тканей. Эта статья описывает простой протокол для получения mESC линии с высоким дифференцирование эффективности (60-80%), культивирование бластоцисты от штаммов разрешительной мыши на фидер клетки в определенной среде, дополнена лейкемия ингибирующего фактора. Протокол также может применяться эффективно получить mESC линии от не разрешительной мыши штаммов, путем простого добавления коктейль из двух малых молекул ингибиторов дифференцирование средний (2i средний). Предоставляются подробные процедуры по подготовке и культуры клеток фидер, сбор и культуры зародышей мыши, и дифференцирование и культуры mESC линий. Этот протокол не требует специализированного оборудования и может осуществляться в любой лаборатории с опытом культуры основных клеток млекопитающих.

Введение

Эмбриональные стволовые клетки (ESC) являются плюрипотентных клеток, полученных от Предимплантационная эмбрионов, которые сохраняют способность самостоятельно обновить или дифференцировать под конкретные условия1. На основе этих свойств, ESC стали полезным инструментом для регенеративной медицины, болезни моделирования и ткани, инженерных исследований2.

ESC в первый раз были получены эмбрионы Предимплантационная мыши, возникая мыши ESC (mESC) линии с низкой успех3,4. Лет дифференцирование эффективность оставалась низкой из-за сложности поддержания плюрипотентности в пробирке. Кроме того присутствие фидер клетки5, который улучшить эффективность дифференцирование, поощрение вложения колонии и повышения стабильности karyotypic6, несколько модификаций протокола приведет к улучшению обслуживания плюрипотентности. Наиболее важными являются добавлением лейкемия ингибирующего фактора (LIF) для mESC культуры среднего7,8, использование эмбрионов с разрешительной фон 129S29 и культуры mESC с средой, дополнена определены сыворотка, свободной от потенциальных факторов дифференциации10. Совсем недавно убедительных доказательств показал, что добавление коктейль из двух мелкомолекулярных модуляторы сигнальных путей на носитель культуры mESC (известный как 2i) является лучшим для поддержания плюрипотентности. 2i коктейль состоит из комбинации MEK ингибитором PD0325901, который уменьшает дифференциация сигналов путем ингибирования Митоген активированный протеин киназы (MAPK) путь, и GSK3β ингибитором CHIR99021, который повышает выживаемость клеток в низкой плотности Активировав путь Wnt11.

В настоящей статье мы опишем простой протокол эффективно получить mESC линии от мыши бластоцисты. Мы следуем стандартной процедуры, культивирование эмбрионов от разрешительной штаммов на фидер клетки в среде дифференцирование, дополненная LIF и замена сыворотке12. После этого протокола, mESC линии могут быть получены с КПД, эквивалентные тем, которые получили в среде 2i. Несмотря на это чтобы избежать возможных проблем с поддержания плюрипотентности или при работе с не разрешительной штаммы могут добавляться 2i.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

использование животных, описанных в приведенных ниже разделах утвержден Комитетом этики на животных и человека исследования Барселоны Universitat близлежащем автономном и кафедра d ' Pesca сельского хозяйства, Ramaderia, я Alimentació Женералитата Каталонии (протокол #8741).

1. инактивации клетки фидера и хранения

Примечание: фибробластов человека крайней плоти (HFF-1) были ранее заморожены в 1 мл замораживания раствора, состоящего из 90% плода Bovine сыворотки (ФБС) и 10% этанного сульфоксида ( ДМСО) и сохраняющихся в жидком азоте до использования.

  1. Оттепель криогенных флакон HFF-1 (1 мл), погружая флакона в ванну воды 37 ° C.
  2. Добавить Размороженный содержимое криогенных флакона подогретым Дульбекко ' s Modified Eagle ' s среднего (DMEM) с 10% FBS сделать 1:10 разрежения.
  3. Семя разреженных клетки (10 мл) в колбе T75 и культуры их при 37 ° C и 5% CO 2.
  4. Следующий день, измените средство для ликвидации остатков ДМСО. Удалите носитель и добавляют 10 мл подогретым DMEM дополнена 10% FBS.
  5. Культура HFFs и изменить носитель каждые 48 ч до тех пор, пока культура достигает стадии вырожденная. Это может занять примерно 7-10 дней.
  6. Подготовить решение инактивации, разбавить митомицин C в DMEM дополнена 10% FBS в конечной концентрации 10 мкг/мл. Инкубировать клетки с инактивации решение для 3 ч при 37 ° C и 5% CO 2.
  7. Удаление инактивации решения и промойте клетки трижды с 2 мл из Хэнкс сбалансированный соли раствора (HBSS) для ликвидации остатков митомицин C.
  8. Для отсоединения инактивированных клетки, добавить 1 мл раствора подогретым трипсина-ЭДТА и инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C и 5% CO 2.
  9. Наблюдать клетки под инвертированным микроскопом для обеспечения они отдельностоящий (цель 10 x с 0,3 числовая апертура или NA). Если они не являются, Инкубируйте их еще пару минут при 37 ° C и 5% CO 2. Проверьте клетки снова под инвертированным микроскопом.
  10. Пипетка решение с пипетка Пастера для того, чтобы разбить ячейки сгустки.
  11. Нейтрализовать ферментативные решение путем добавления 4 мл DMEM, дополненная 10% FBS и Ресуспензируйте.
  12. Взять Алиготе суспензию клеток и сделать разведение 1: 100 в HBSS. Чтобы определить количество клеток, загрузить 10 мкл разрежения в Нойбауэр ' s камеры. Подсчет количества ячеек, расположенных в одном из больших площадей камеры под инвертированным микроскопом (20 x цель с 0,45 NA).
    1. Повторить подсчета в общей сложности четыре больших площадей. Рассчитать общее количество клеток (N) как N = среднее количество клеток подсчитанных x общий объем x 4 разбавления x 10.
  13. Центрифуга остальная часть образца для 5 минут при 200 x g. удалить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с замораживания раствора в концентрации 10 6 клеток / мл.
  14. Алиготе подвеска в криогенных флаконов с 10 6 клеток (1 мл) каждый. Криогенных флаконов в замораживания контейнер и заморозить в -80 ° C.
  15. Следующий день, хранить криогенных флаконов в жидком азоте.

2. Культура клетки фидера

  1. одного до четырех дней перед началом процесса вывода, таяние криогенные флакон, содержащий 1 x 10-6 инактивированная HFF-1 клетки в водяной бане при 37 ° с.
  2. Сделать разведение 1:6 талой HFF-1 в предварительно разогретую DMEM, дополненная 10% FBS и держать температуру 37 ° C.
  3. Заполните каждый хорошо 4-ну плиты с 500 мкл подогретым 0,2% желатина из свиной кожи и сохранить пластины при 37 ° C на 10 мин
  4. Удалить 500 мкл желатина из скважин и 500 мкл HFFs разрежения. Осторожно покачайте пластину для обеспечения равномерного распределения HFFs в нижней части скважины. Избегайте круговыми движениями, в противном случае клетки будут сосредоточены в центре скважины.
  5. Инкубировать пластину по крайней мере 24 часа при 37 ° C и 5% CO 2 для получения монослоя инактивированных HFFs в каждой скважине.
  6. Следующий день, соблюдать клетки под инвертированным микроскопом (10 X цель с 0,3 NA) и проверьте, что они придают и равномерно распределены. Измените средство для ликвидации остатков ДМСО. Удалите носитель и 500 мкл подогретым DMEM дополнена 10% FBS.

3. Сбор эмбриона и культура

  1. , четыре дня до коллекции эмбриона, управлять 5 МЕ беременных Маре ' гонадотропина сыворотки s внутрибрюшинной инъекции до 6-12 неделя старый самок мышей.
    Примечание: Мы использовали женщины от 129S2 или B6CFAF1 штаммов, хотя женщины из других штаммов мыши могут быть использованы. Тем не менее, когда работает с женщинами от не разрешительной штаммов (например ЦБА), среднего должна быть дополнена 2i как указано в шаге 4.2.
  2. После 48 ч, управлять 5 ед хорионического гонадотропина человека внутрибрюшинной инъекции и мат женщин с мужчинами, по крайней мере 8 недель, в соотношении 1:1. Отдельные женщины от мужчины следующий день.
  3. За день до коллекции эмбриона, подготовить 35-мм клеточной культуры Петри с несколькими каплями 40 мкл KSOMaag среды с 4 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА) и заполнить пластину с минеральным маслом для полного покрытия капли. Инкубировать блюдо на 37 ° C и 5% CO 2 чтобы сбалансировать среднего.
  4. Подготовить эмбриона манипуляции пипетки, тепло тоньше частью Лонг накренилась стеклянная пипетка Пастера, с помощью горелки Бунзена. После того, как мягкие, снять с огня и тянуть друг от друга два конца. Разбейте его на желаемую длину. Внутренний диаметр кончика должно быть 100-150 мкм.
  5. Усыпить самок мышей от шейки матки дислокации 45-48 h пост coitum (p.c.).
  6. Вскрыть мышей подвергать брюшной полости путем разрезания кожи с гладкой изогнутые ножницами и брюшины прямо острыми ножницами. Захватить один из матки с щипцами, отрезать маточных труб, прямо острыми ножницами и поместить его в буфер Hepes CZB среднего (HCZB) 13 37 ° C. повторить этот процесс, чтобы удалить другие маточных труб.
  7. Флеш, яйцеводов с 1 мл шприц загружен с HCZB удерживается на месте часовщик щипцы для сбора 2-клеток эмбрионов.
    Примечание: Подготовить промывки взять иголку подкожных иглой 30 G, разрезать конец и основанием для тупых отзыв на абразивный камень.
  8. С помощью аппарата рот пипеткой, забрать эмбрионы, мыть их в HCZB и культуры их в ранее подготовленных эмбриона культуры блюдо на 37 ° C и 5% CO 2 до стадии бластоцисты. До 50 эмбрионы могут быть культивировали в каждой капле 40 мкл. Мониторинг развития эмбриона каждые 24 ч под стереомикроскопом.
    Примечание: в качестве альтернативы, эмбрионы могут быть собраны на стадии бластоцисты сократить в пробирке эмбрион культуры. В этом случае усыпить самок в день p.c. 3.5-4.5, вскрыть матки. и смыть с HCZB.

4. Дифференцирование стволовых клеток

  1. Подготовка вывода пластин
    1. в день посева эмбриона, подготовить среднего дифференцирование, дополняя среде DMEM с 100 мкм 2-β меркаптоэтанол, 1 x Non-Essential аминокислоты , 20% сыворотки замены, и 10 3 ед/мл LIF.
    2. По желанию, добавить 1 мкм MEK ингибитора PD0325901 и 3 мкм ингибитора GSK3 CHIR99021 для получения среднего 2i.
    3. Взять 4-ну тарелку с монослоя инактивированных HFFs (шаг 2.6) от инкубатор. Удаление среды и 800 мкл подогретым дифференцирование среднего для каждой скважины. Возвращение пластину в инкубатор.
  2. Вителлинового удаления и эмбриона посев
    1. подготовить 35 мм клеточной культуры Петри с тремя 30 мкл капель кислой Tyrode ' s решение 14 и капель три 30 мкл дифференцирование среды. Обложка капли с минеральным маслом и держать блюдо на 37 ° C.
    2. Взять эмбриона культуры блюдо из инкубатора. Один за другим, передачи бластоцисты от капель культуры к кислой Tyrode ' s решение падение с помощью пипетки манипуляции эмбриона. Если возможно, выберите только расширенный бластоцисты, чтобы начать процесс вывода.
    3. Монитор вителлинового пищеварение под стереомикроскопом. Как только исчезает zona pellucida, передачи бластоциста падение средних дифференцирование для того, чтобы промыть кислой Tyrode ' раствор ф.
    4. Взять 4-ну дифференцирование пластина из инкубатора и семян одна зона свободной бластоциста на фидер клеток в каждой скважине.
    5. Возвращение пластину 4-ну дифференцирование инкубатора и культуры при 37 ° C и 5% CO 2.
  3. Мониторинга роста стволовых клеток и среднего изменения
    1. мониторинга культур каждые 24 ч под инвертированным микроскопом (20 X цель с 0,45 NA). Важно отметить, есть ли признаки дифференцировки стволовых клеток, таких как опухшие рефракционной клетки окружающих нарост или даже нажимать фидер клетки сторону.
    2. Каждый день, измените среднего культуры. Взять 4-ну пластина из инкубатора, удалить носитель из каждой скважины и 800 мкл подогретым дифференцирование среднего дополнена LIF и 2i, если используется. Сохранение культуры, пока наросты наблюдаются (6-8 дней).

5. Клеточная культура и техническое обслуживание

  1. подготовить Колле как ручки и стволовых клеток манипуляции пипетки. Следуйте шаг 3.4 подготовить стволовых клеток манипуляции пипетки с внутренним диаметром на кончике 250-300 мкм. Используйте другой частью вытащил пипетка Пастера подготовить ручку Колле как. Тепло и формировать его до получения крючок.
  2. Взять пластину 4-ну культуры из инкубатора и найдите нарост под стереомикроскопом. Используйте ручку, чтобы оттолкнуть дифференцированных клеток и питатели, которые окружают нарост.
    Примечание: Чтобы избежать возможной дифференциации нарост, важно удалить все дифференцированных клеток от края нарост.
  3. Аспирационная нарост с пипеткой манипуляции стволовых клеток и поместить его в новое блюдо в капле трипсина ЭДТА 50 мкл.
  4. Использовать скальпель вырезать нарост в нескольких частях для того, чтобы разбить его как механически, так и ферментативно.
  5. Сразу, перевести фрагменты нарост на свежие капли среднего деривации для нейтрализации действий трипсина.
  6. Передачи фрагментов нарост новая 4-ну табличка с монослоя кормушки. Передача до 10 фрагментов на колодец и культуры их с дифференцирование среднего при 37 ° C и 5% CO 2.
  7. Сохранения стволовых клеток подобных культур для по крайней мере за шесть недель до рассмотрения mESC линии, установленной. Изменить носитель каждые день и субкультуры их один раз в неделю.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После этого протокола более 95% нарост формирования должно быть достигнуто после первой недели культуры (рис. 1A). Создание линий mESC после шести переправах переменная среди экспериментальных реплицирует, с средний успех 60-80%. Добавление 2i не значительно улучшить результаты при работе с разрешительной мыши штаммов, как те, с 129S2 фоном, но это необходимо при работе с не разрешительной штаммов.

...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Хотя mESC линии наследования является известным процедура обычно используется во многих лабораториях, его эффективность не всегда как высокими, как ожидалось, из-за многочисленных факторов, которые могут нарушить плюрипотентности обслуживания. В настоящей статье мы покажем, шаг за шагом, как установить mESC линии с высокой эффективностью, используя простой и надежный протокол. Эти эффективность аналогичны сообщениям в литературе.

Для обеспечения максимальной эффективности, важно контролировать...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарим Jonatan Лукас за его техническую помощь с подачи клеточной культуры, UAB-де-ла Estabulari обслуживание для ухода за животными и Мартин Domènec для записи видео. Эта работа была поддержана Ministerio де Economia y развитию AGL2014-52408-R и де Женералитата Каталонии 2014 SGR-524. MVC является бенефициаром PIF-ЗАО стипендий.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл sryringeBD 
2-&бета;-меркаптоэтанолLife Technologies31350-010
4-луночный планшетThermo Scientific Nunc176740
Раствор кислотного тирода Рецепт домашнего приготовлениясм. в Nagy et al, 2003. Для краткосрочного хранения (до 1 месяца) держите его при температуре 4ºC. В качестве альтернативы, для долгосрочного хранения держите его при -20ºC. Если эффективность раствора снижается, его следует подкислить путем добавления небольшой капли HCl 1M.
BSASigmaA3311
Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488Молекулярные зонды - InvitrogenA-21200разведение 1:500. Вторичные антитела к мышиным антителам Oct4, Tuj1, αSMA и AFP.
CHIR990212Axon Medchem 1386Восстановите 2,15 мл ДМСО на каждый мг порошка с получением 1 мМ исходного раствора. Аликвоту в нужном объеме и хранить при температуре -20°C. Избегайте циклов замораживания и размораживания.
CryoTubeThermo ScientificNunc 3754518
DMSOSigma41640
DMEMBioWestL0107
FBSBioWestS1810Перед использованием инактивируйте его путем нагревания в течение 30 минут при температуре 56°C. Аликвота и храните при -20°C; C
Игла для промывкиBD 304000Срежьте конец иглы и измельчите до тупого кончика на абразивном камне
желатин из свиной кожиFluka48724Разведите под 0,2% в дестиллированной воде и автоклавируйте его. Каждое разведение можно использовать в течение месяца.
Козий антикролик IgG, молекулярные зонды Alexa Fluor 594- InvitrogenA-11037разведение 1:500. Вторичное антитело к антителам к кролику Sox2. 
HBSSBioWestL0611
Хепес-буферный CZB Домашняякомпозиция в Chatot et al, 1989
Хорионический гонадотропин человекаDivasa-FarmavicVeterin-Corion 3000 UIразвести в NaCl 0,9% при 50 МЕ/мл. Аликвотировать его в 1 мл и хранить при -20°ordm; C на срок до двух месяцев. После размораживания больше не замораживайте. 
Фибробласты крайней плоти человекаATCCATCCSCRC-1041Для длительного хранения рекомендуется хранить их в жидком азоте.
Технологии замены сыворотки KnockOut  10828-028Светочувствительный. Рекомендуется выделять его в небольших объемах, например, по 10 мл и хранить при -20°М; C (проверьте срок годности). Избегайте циклов замерзания и оттаивания.     
KSOMaag EvolveZenith BiotechZEKS-050Добавка с 4 мг/мл BSA. Равновесие при 37º C и 5% CO2 за день до использования.
Фактор ингибирования лейкемииMerk MilliporeESG1106
мышей Чарльз Ривер/ХарланРекомендуется использовать мышей из разрешающего штамма с точки зрения производного mESC (например, 129S2 или C57BL). Однако инбредные штаммы менее эффективны в производстве эмбрионов. Поэтому рекомендуется использовать гибридный штамм, такой как 129S2 x C57BL или B6CBAF1, чтобы воспользоваться преимуществами гибридной силы.
Минеральное маслоSigmaM8410Embryo протестировано. Светочувствительный. 
Mitomycin CServa2980501Восстановите порошок с водой MilliQ в дозе 0,5 мг/мл. Хранить при 4º C в защищенном от света месте. Внимание, он вреден и подозревается в возникновении рака.
Мышиный антитубулин β III (Tuj1)BiolegendMMS-435P1:500 разведение
Мышиный моноклональный анти-&альфа;SMASigmaA52281:200 разведение
Мышиный моноклональный анти-AFPR& D SystemsMAB1368разведение 1:50
Мышиный моноклональный анти Oct3/4 Santa cruzSc-52791:50 разбавление
заменимых аминокислотLife Technologies11140-035
PD0325901Axon Medchem 1408Восстановите 2,08 мл ДМСО на каждый мг порошка с получением 1 мМ исходного раствора. Аликвот в желаемом объеме и хранить при температуре -20°C. Избегайте циклов замораживания и размораживания.
Чашка Петри (35мм)Thermo Scientific Nunc153066
чашка Петри (60мм)Thermo Scientific Nunc150288
Гонадотропин сыворотки беременной кобылыФолигонФолигон-1000 UIразвести в NaCl 0,9% при 50 МЕ/мл. Аликвотировать его в 1 мл и хранить при -20°ordm; C на срок до двух месяцев. После размораживания больше не замораживайте. 
Кролик поликлональный анти-Sox2Merck MilliporeAB56031:200 разведение
T75 falconThermo Scientific130190
Трипсин-ЭДТА 10xBioWestX0930развести 1:10 в HBSS для получения 1x раствора
309628

Ссылки

  1. Biswas, A., Hutchins, R. Embryonic stem cells. Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).
  2. Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).
  3. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  4. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  5. Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. PNAS. 72 (4), 1441-1445 (1976).
  6. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nat Prot. 9 (3), 559-574 (2014).
  7. Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336 (6200), 688-690 (1988).
  8. Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336 (6200), 684-687 (1988).
  9. Brook, F. A., Gardner, R. L. The origin and efficient derivation of embryonic stem cells in the mouse. Proc Nat Acad Sci U S A. 94 (11), 5709-5712 (1997).
  10. Ward, C. M., Stern, P., Willington, M. A., Flenniken, A. M. Efficient germline transmission of mouse embryonic stem cells grown in synthetic serum in the absence of a fibroblast feeder layer. Lab Invest. 82 (12), 1765-1767 (2002).
  11. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  12. Wakayama, S., et al. Efficient establishment of mouse embryonic stem cell lines from single blastomeres and polar bodies. Stem cells (Dayton, Ohio). 25 (4), 986-993 (2007).
  13. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium support development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil. 86, 679-688 (1989).
  14. Nagy, A., Vintersten, K., Behringer, R. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Lab Press. New York. (2003).
  15. Lee, K. H. Conditions and techniques for mouse embryonic stem cell derivation and culture. Pluripotent Stem Cells. , 85-115 (2013).
  16. Ma, Y., et al. Human foreskin fibroblast produces interleukin-6 to support derivation and self-renewal of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Res Ther. 3 (29), (2012).
  17. Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39 (2), 100-104 (2004).
  18. Chaudhry, M. A., Vitalis, T. Z., Bowen, B. D., Piret, J. M. Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58 (3), 173-179 (2008).
  19. Kawase, E., Suemori, H., Takahashi, N., Okazaki, K., Hashimoto, K., Nakatsuji, N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int. J. Dev. Biol. 38 (2), 385-390 (1994).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Embryonic stem cell culture conditions support distinct states associated with different developmental stages and potency. Stem Cell Rep. 7 (2), 177-191 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эмбриональные стволовые клетки мышикультивирование эмбрионовподготовка фидерных клетокполучение бластоцистлейкемия-ингибирующий факторсреда 2iудаление блестящей оболочкисубкультивирование стволовых клетокмаркеры плюрипотентностидифференцировка зародышевых листков
Дифференцирование линий стволовых клеток мыши Предимплантационная эмбрионов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.