Многие видение угрожая глазные заболевания связаны с неблагополучной сетчатки микрососудов. Таким образом измерение артериолы сетчатки ответов имеет важное значение для расследования основные патофизиологические механизмы. Эта статья описывает подробный протокол для мыши артериолы сетчатки изоляции и подготовке для оценки воздействия вазоактивных веществ на сосудистой диаметра.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Шаги подготовки для измерения реактивности в мыши артериол сетчатки Ex Vivo
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сосудистая недостаточность и изменения в нормального кровоснабжения сетчатки являются одним из основных факторов патогенеза различных зрение угрожая глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, гипертоническая ретинопатия и, возможно, глаукома. Таким образом сетчатки микрососудистой препараты являются ключевой инструменты для физиологических и фармакологических исследований очертить основные патофизиологические механизмы и дизайн терапии для лечения заболеваний. Несмотря на широкое использование мыши модели в офтальмологических исследований исследования сетчатки сосудистой реактивности не хватает в этой породы. Основной причиной этого несоответствия является сложной процедуры изоляции вследствие небольшого размера этих сетчатки кровеносных сосудов, которая является ~ ≤ 30 мкм в диаметре Люминал. Чтобы обойти эту проблему прямого изоляции этих сетчатки микрососудов для функциональных исследований, мы создали изоляции и подготовка техника, позволяющая ex vivo исследования сетчатки вазоактивных мыши вблизи физиологических условиях . Хотя настоящий экспериментальных препаратов будет специально ссылаются на артериолы сетчатки мыши, эта методология легко могут быть использованы микрососудов от крыс.
Введение
Беспорядки в сетчатки перфузии замешаны в патогенезе различных глазных заболеваний, таких как диабетическая ретинопатия, гипертонической ретинопатии и глаукома1,2,3. Таким образом исследования, направленные на измерение сосудистой реактивности в сетчатке важно понимать патофизиологию этих заболеваний и разрабатывать новые методы лечения подходов.
Благодаря возможности манипулирования генов в геноме мышиных мышь стала широко используемых животных модели для исследования сердечно-сосудистой системы4. Однако из-за малого размера сетчатки сосудов (≤ 30 мкм), измерение сосудистой реактивности в сетчатке мыши является сложной задачей. Например stereomicroscopic методы для измерения в vivo ограничены в их оптической резолюции и поэтому только позволяют точно определять изменения диаметра или крови поток в малой кровью диаметром ≤ 30 мкм при оснащении с менее Дополнительные сложных устройств, таких как конфокального микроскопа с помощью флуоресцентных красителей или Адаптивная оптика сканирование свет офтальмоскоп5,6. Кроме того толкование в естественных условиях измерений, направленных на выявление местных сигнальные механизмы в сетчатки сосудов может быть confounded с анестетиками, изменения системного артериального давления и влияния ретробульбарная кровеносных сосудов.
Поэтому мы разработали метод измерения реакции мыши сетчатки сосудов с высокой оптической резолюции ex vivo. Техника, представленная в настоящем документе позволяет визуализировать артериол сетчатки через передачи световой микроскопии. Этот метод, который может также использоваться в крыс, обеспечивает доступ к преимущества гена ориентации технологии в глазной сосудистых исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальные методы исследования были утверждены на животное уход Комитет из Рейнланд-Пфальц, Германия. Уход за животными соответствует институциональных руководящих принципов и ассоциации исследований в видение и офтальмологии (Арво) инструкции для использования животных в офтальмологических и видение исследования. Животные были обработаны согласно директиве ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных. Самцов мышей C57BL/6J (Лаборатория Джексон, Бар Харбор, ME, США) в возрасте 3-4 месяцев были использованы для экспериментов. Животные были размещены в стандартных условиях (температура 23 ± 2 ° C, влажность диапазона 55 ± 10% и 12 h свет/темно циклов) и имел доступ к стандартной мыши вода и Чоу ad libitum.
1. изоляция мыши сетчатки
- Место рассечение инструменты для подготовки таблицы и проверьте, если все документы полная возможность быстрого приготовления.
- Пожертвуйте мыши CO2 ингаляции.
- Обезглавить мыши стальной ножницами, вырезать череп sagitally на две половинки, используя же пару ножниц и удалить кожу и мозг, используя ножницы глаз (рис. 1).
- Отрежьте кости черепа оставить только орбитальной кости с помощью ножниц глаз.
- Перенесите орбиты в блюдо рассечение, содержащие ледяной Кребса-Henseleit буфера.
- Держите рассечение блюдо на льду или изменить буфера каждые 10 мин.
- Вырезать орбитальной кости с помощью ножниц глаз и аккуратно удалить глаз глобус вместе с орбитальных тканей, используя пинцет тип 4 точности и беззаботными Студенческая весна ножницы (рис. 2).
- Аккуратно удалите Harderian железы, соединительной ткани и наружных мышц, используя пинцет тип 5 точность и беззаботными Капсулотомия ножницы, стараясь не повредить основные ветви глазной артерии.
- Перевязать Орбитальные ветви глазной артерии и в конечном итоге проксимальный конец основной ветви глазной артерии, с использованием 10-0 нейлон швы (рис. 3).
- Перевести глаза глобус в чашку Петри, содержащие этанол 70% за 10 s с помощью типа 4 пинцеты прецизионные. Место земного шара глаз обратно в блюдо диссекции и замените буфер свежий раствор Кребс. Роговицы появится беловатые после воздействия этанола.
- Прокол периферийных роговицы с 30 иглы и вскрыть роговицы с помощью беззаботными Капсулотомия ножницы. Аккуратно отрезать ткани радужки, место одним острием беззаботными Капсулотомия ножницами между сосудистой оболочки и сетчатки и отрезали хориоидеи и склеры. Оставьте несколько склеры ткани вокруг зрительного нерва (рис. 4).
2. Монтаж сетчатки в зале перфузии
Примечание: Перфузии камеры, используемые для экспериментов артериолы сетчатки, домашний. Он состоит из прозрачной водохранилища с в - и отток трубки (рис. 5). Один конец трубки силиконовые приклеивается к нижней части камеры с histoacryl клей и другой конец придает трехходовой кран. Подключите шприц, содержащий свежие Кребс буфер трехходовой кран и заполнить трубу с буфером.
- Взять стакан микропипеткой с иглодержатель и задвиньте его в конце трубки в нижней части камеры перфузии. Затем разделите кончик микропипеткой с ножницы типа 4 для получения наконечник диаметром 100 мкм.
- Фокус на кончике микропипеткой и смыть через шприц подключен к трубе. Позаботьтесь, что капилляр не закрыта от мусора. В случае окклюзии удалите его, промойте трубы и вставить другой микропипеткой.
- Заполните перфузии камеры с холодной Кребс буфера и поставить камеру под микроскопом стерео.
- Место прозрачной пластиковой платформы в камеру перфузии. Эта платформа имеет отступ шириной 1,8 мм для зрительного нерва и глазной артерии и помещается на два стальных проволок диаметром 1,6 мм. Затем поместите кольцо из нержавеющей стали внутренний диаметр 2,8 мм и наружным диаметром 4.0 мм на платформу.
- Передача сетчатки, зрительного нерва и прилагаемый глазной артерии от вскрытия камеры в камеру перфузии с крайней осторожностью, с помощью ложки. Этот шаг имеет важное значение для предотвращения возможности растяжения тканей, как это может быть пагубным для эксперимента.
- Отрезать зашивается частью проксимальный конец глазной артерии, место два преформированных петель 10-0 нейлон шва на микропипеткой и иглу глазной артерии с микропипеткой. Галстук артерии к микропипеткой (рис. 6) и место сетчатки на прозрачной платформу с помощью штраф точка пинцет.
- Аккуратно слезу открытой передней линзы отолярингология пинцетом две прекрасные точки, вытяните объектив и отрезали отолярингология весь объектива, с помощью microscissors.
- Впоследствии сделать четыре радиальные надрезы в сетчатке половину расстояния от Парс plana зрительного нерва и поместите кольцо из нержавеющей стали на сетчатку исправить его на дно. Сетчатка теперь готов для эксперимента (рис. 7).
3. Подготовка артериол сетчатки для эксперимента
- Место перфузии камеры под микроскопом света. Цель – 100 X объектив погружения в воду.
- Подключите два трубки для в - и вне - flow с pericyclic насосом и распространяет камеры с буфером Кребс кислородом с 95% O2 и с 5% CO2 при 37 ° C. Используйте скорость потока между 100 и 120 мл/мин.
- Соединить Трубки силиконовые, который подключен к микропипеткой, водохранилище Силиконовый шланг через трехходовой кран. Затем заполните резервуар с буфером Кребс на высоту, соответствующую 50 мм Hg, но не открыть кран трехходовой еще.
- Просмотрите задачи микроскопа и сосредоточиться на поверхности сетчатки. Поиск для кровеносных сосудов или красные кровяные клетки. Вполне возможно, что кровеносные сосуды являются полностью рухнула, иногда только некоторые красные кровяные клетки являются видимыми.
- Когда найден кровеносный сосуд, сосредоточиться на нем и открыть кран трехходовой. Следует незамедлительно увеличить диаметр сосуда и красные кровяные клетки двигаться либо центробежно, если это артериолы, или centripetally в случае венулы. Артериолы, меньше в диаметре, по сравнению с венулы того же порядка.
- Найдя кровеносный сосуд с хорошо видны стены, он может быть использован для экспериментов после уравновешивания периода 30 мин (рис. 8). В период уравновешивания артериолы развиваются только слабые встроенные тон, что приводит к менее чем 10% сокращения Люминал диаметр.
4. Выполнение эксперимента
- Проверьте жизнеспособность судов с тромбоксана подражательный 9,11-катализированные 9α, 11α-methanoepoxy простагландина Ф2α (U46619), добавив его в раствор для ванн. Этот агент сужает артериол сетчатки мышь примерно 50% от отдыха диаметр в концентрациях ≥ 10-6 М.
- После того, как судно подтверждается жизнеспособным, мыть агонист из бани, циркуляционный насос и поставлять свежие Кребс буфера в ванну.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
U-46619 производства зависит от концентрации вазоконстриктора ответы в артериолы сетчатки от дикого типа мышей C57Bl/6J фона. В концентрации 10-6 М снижение Люминал диаметр был ≈50% от диаметра, отдыха. Рис. 9A показывает кривой представитель концентрации ответ один артериолы сетчатки. В артериол, preconstricted с U46619 накопительное администрации ацетилхолина вызвала увеличение концентрации зависимых Люминал диаметром до 25% от preconstricted диа...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Измерение сосудистых реакций в сетчатке мыши является сложной задачей из-за небольшого размера кровеносных сосудов сетчатки. С представленной техникой артериолы сетчатки визуализируются путем передачи световой микроскопии. Это возможно, потому, что изолированные сетчатки полупрозрачные. Преимуществом метода является высокое оптическое разрешение. Вычисляемые пространственное разрешение составляет 11 px/мкм. Однако реальные разрешения для этой оптической системы, которая использует белый свет находится между 200 и 300 Нм,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы имеют без финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантов от Эрнст und Berta Grimmke Stiftung и Deutsche Gesellschaft офтальмологические (собака).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стальные ножницы | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 мм |
| Глазные ножницы | Geuder | G-19390 | 1x прямой, 10,5 см |
| Прецизионный пинцет, прямой с тонкими наконечниками | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x тип 4 |
| Прецизионный пинцет, прямой с особо тонкими наконечниками | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x тип 5 |
| Капсулотомические ножницы | VannasGeuder | 19760 | 1x прямые, 77 мм |
| Student Vannas Пружинные ножницы | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x изогнутый, |
| Barraquer Иглодержатель | Geuder | G-17500 | 1x изогнутый, 120 мм |
| Игла | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Стеклянные капилляры (для производства микропипеток) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1,2 x 0,8 мм; внешний/внутренний диаметр) |
| Нейлоновый шовный материал | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Чашка для клеточной культуры Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 мм |
| диаметр Чашка для клеточной культуры Nunclon | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 мм диаметр |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 см |
| Histoacryl клей | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Название< | strong>Company | Каталожный номер | >Комментарии |
| Оборудование | |||
| Перициклический насос (ЦИКЛО II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Вертикальный съемник для пипеток Модель 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Микроскоп (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Водно-иммерсионный объектив LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Цифровая камера (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Перфузионная камера | собственного производства | 1x | |
| Name< | strong>Company | Номер в каталоге | Комментарии |
| >Лекарства и растворы | |||
| Этанол | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Дигидрат хлорида кальция (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Хлорид кальция (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Дигидрофосфат кальция (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Сульфат магния (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Хлорид натрия (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Гидрокарбонат натрия (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Моногидрат глюкозы | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-дидезокси-9α,11α-метаноэпоксидный простагландин F2α (У-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Ацетилхолина хлорид | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
Ссылки
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
