Method Article

Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона

DOI:

10.3791/56214

⸱

August 9th, 2017

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длинные волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные, реального времени нейронные крест миграции в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) zebrafish эмбриона.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врождённая глаз и черепно-лицевых аномалий отражают сбои в нейронные крест, переходных населения мигрирующих стволовых клеток, которые порождают многочисленные типы клеток по всему телу. Понимание биологии нейронные крест был ограниченным, что отражает отсутствие генетически шансов справиться с возникающими моделей, которые могут быть изучены в естественных условиях и в режиме реального времени. Данио рерио представляет собой особо важное значение развития модель для изучения популяций мигрирующих клеток, например нейронные крест. Для изучения миграции нейронные крест в развивающихся глаз, сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата видео с высоким разрешением, трехмерные, реальном времени развивающихся глаза в трансгенных данио рерио эмбрионов, а именно: Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP), как sox10 и foxd3 было показано в многочисленных животных моделей для регулирования раннего нейронные крест дифференциации и вероятно представляют маркеры для гребня нейронные клетки. Мульти Фотон покадровой изображения была использована для различить поведение и миграционные процессы двух нейронные крест клеточных популяций способствуют раннему развитию глаз. Этот протокол предоставляет информацию для создания покадровой видео во время миграции данио рерио нейронные крест, как, например и может применяться для визуализации раннего развития многих структур в данио рерио и других модельных организмов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Врожденных глазных болезней может привести к слепоте детство и часто из-за аномалий черепа нейронные крест. Гребень нейронные клетки являются переходные стволовые клетки, которые возникают от нервной трубки и образуют многочисленные тканях по всему телу. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 гребень нейронные клетки, производный от переднего мозга и среднего мозга, привести к кости и хряща средней зоны лица и лобной области, Ирис, роговицы, Трабекулярная сеть, и склеры в переднего сегмента глаза. 4 , 6 , 7 , 8 гребень нейронные клетки от ромбовидный мозг форма, которую Фарингальные арки, челюсти и сердечной отток тракта. 1 , 3 , 4 , 9 , 10 исследования показали вклад нейронные крест для глазной и Периокулярная развития, подчеркивая важность этих клеток в развитии позвоночных глаз. Действительно нарушению миграции клеток нервной гребень и дифференциации привести к краниофациальных и глазные аномалии наблюдаются в Axenfeld Ригер синдром и синдром плюс Питерс. 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 таким образом, полное понимание миграции, пролиферации и дифференцировки клеток эти нейронные крест даст понимание сложностей, лежащих в основе врожденных глазных заболеваний.

Данио рерио представляет собой мощную модель организм для изучения развития глазной, как структуры глаза у рыбок данио похожи на млекопитающих их коллегами, и многие гены эволюционно консервируют между данио рерио и млекопитающих. 18 , 19 , 20 Кроме того, данио рерио эмбрионов являются транспарентными и яйцекладущие, облегчения визуализации развития глаз в режиме реального времени.

Расширение на ранее опубликованные работы,6,7,20 мигрирующих шаблон гребень нейронные клетки был описан с помощью нескольких Фотон флуоресценции покадровой изображений на линиях трансгенных данио рерио, помечены Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) под контролем transcriptional SRY (секс определение региона Y)-коробке 10 (sox10) или Forkhead поле D3 (foxd3) ген регулирования регионов. 21 , 22 , 23 , 24. несколько фотонных флуоресценции покадровой изображений является мощная техника, которая сочетает в себе передовые оптические технологии лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны мульти Фотон флуоресценции возбуждения для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные образцов, отмеченных флуорофоров. 25 , 26 , 27 использование лазера мульти Фотон имеет явные преимущества над стандартным confocal микроскопии, в том числе рост тканей проникновения и снижение Флюорофор отбеливания.

С помощью этого метода, два отдельных популяций нейронные крест клеток разного времени миграции и миграционных путей были дискриминации, а именно foxd3-позитивных гребень нейронные клетки в Периокулярная Мезенхима и развивающихся глаз и нейронные крест sox10-положительных клеток в краниофациальных мезенхимы. С помощью этого метода вводится подход к визуализации миграции глазной и черепно-лицевых невральной гребень миграции в данио рерио, что делает его легко наблюдать регулируемых нейронные крест миграции в режиме реального времени во время разработки.

Этот протокол содержит сведения для создания покадровой видео во время раннего развития глаз в тг (sox10:EGFP) и трансгенных данио рерио тг (foxd3:GFP), в качестве примера. Этот протокол может применяться для высокого разрешения, трехмерные, в реальном времени визуализации на ранних стадиях развития любой глазной и краниофациальной структуры, производные от гребня нейронные клетки в данио рерио. Кроме того этот метод также может применяться для визуализации развития других тканей и органов в данио рерио и других животных моделях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь протокол был выполнен в соответствии с рекомендациями по гуманному обращению с лабораторными животными, установленными Комитетом Мичиганского университета по использованию и уходу за животными (UCUCA).

1. Сбор эмбрионов для покадровой визуализации

  1. Между 3 и 9 часами вечера посадите самца и самку взрослых Tg(sox10:EGFP) или Tg(foxd3:GFP) трансгенных данио-рерио в разделенном аквариуме для парного спаривания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбы Tg(sox10:EGFP) и Tg(foxd3:GFP), добрые подарки от Томаса Шиллинга и Мэри Халлоран, соответственно, были скрещены в фон Каспера (roy -/-, перламутровый -/-) для уменьшения автофлуоресценции и интерференции с пигментацией.
    1. Соберите резервуар для разведения (щелевой внутренний бак + сплошной внешний бак) и заполните его водой системы обратного осмоса (RO).
    2. Пересадите до 3 самок и 3 самцов в противоположные стороны аквариума, разделенные перегородкой; в одном аквариуме можно разводить до 6 рыб попарно.
    3. На следующее утро снимите разделитель вскоре после того, как в виварии загорится свет.< или > ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании свет работает по 14-часовому циклу света (включается в 9 утра) и 10 часов в темноте (выключается в 11 вечера).
    4. Дайте спокойному спариванию в течение 20 минут или до тех пор, пока не будет произведено достаточное количество эмбрионов; эмбрионы будут находиться на дне аквариума для разведения. Когда вы увидите икру, поднимите внутренний аквариум с щелью вместе с рыбами и быстро поместите их (рыб и внутренний аквариум) в чистый твердый внешний аквариум, наполненный водой обратного осмоса.
  2. Приготовьте стандартную среду для эмбрионов 1X, добавив на 1 л воды обратного осмоса: 0,287 г (4,9 мМ) NaCl, 0,127 г (0,17 мМ) KCl, 0,048 г (0,33 мМ) CaCl2,2H 2O, 0,04 г (0,33 мМ) MgSO4 (безводный). Размешайте раствор до полного растворения солей.
    1. Добавьте 100 мкл 0,1% метиленового синего в качестве фунгицида. Добавьте 0,25 г гидрокарбоната натрия, чтобы довести pH до 7,75. Хранить в среде при комнатной температуре.
  3. Соберите яйца из внешнего резервуара с помощью сита для сбора яиц и перенесите яйца в чашки Петри (~50 эмбрионов на чашку), содержащие 30 мл 1X эмбриональной среды. Собранные яйца инкубировать при температуре 28,5 °C.
  4. Подготовка эмбрионов
    1. Tg(sox10:EGFP) эмбрионов.
      1. Для эмбрионов Tg(sox10:EGFP) через 12 ч после оплодотворения (HPF) удалите мертвые яйцеклетки и оцените стадию развития эмбрионов. Скрининг GFP-положительных эмбрионов с помощью препарирующего флуоресцентного стереомикроскопа со стандартным фильтром полосового возбуждения 460-490 нм. С помощью щипцов удалите хорионы из 3-4 эмбрионов, экспрессирующих GFP, и перенесите эти эмбрионы в отдельную чашку Петри, содержащую 30 мл свежей среды для эмбрионов 1X.
    2. Tg(foxd3:GFP) эмбрионы.
      1. Для эмбрионов Tg(foxd3:GFP) при 22-24 hpf удаляют мертвые яйцеклетки и оценивают стадию развития эмбрионов. Скрининг положительных эмбрионов с помощью препарирующего флуоресцентного стереомикроскопа со стандартным фильтром полосового возбуждения 460-490 нм. С помощью щипцов удалите хорионы у 3-4 эмбрионов, экспрессирующих GFP.
      2. Приготовьте стоковый раствор 1000X фенилтиомочевины (ПТУ), растворив 0,75 г (3%) ПТУ в 25 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Аликвотируйте и храните исходный раствор при 4 °C. Добавьте 30 мкл стокового раствора 1000X PTU (3%) к 30 мл 1X эмбриональной среды для получения 0,003% раствора PTU.
      3. Поместите скрининговые и дехорионированные GFP-положительные эмбрионы в 0,003% раствор PTU для подавления пигментации. Не начинайте лечение эмбрионов ПТУ до 20 HPF, так как раннее лечение (при <20 HPF) может оказать неблагоприятное воздействие на нервный гребень и развитие нейроэпителия. 28
    3. Перед проведением эксперимента с интервальной съемкой наблюдайте за эмбрионами с помощью визуализации в реальном времени с помощью стандартного стереомикроскопа с интервалом 12-24 часа в сравнениях по возрасту в качестве контроля температурного дрейфа.

2. Монтирование эмбриона для покадровой визуализации

  1. Приготовление покадровой съемочной среды для эмбрионов
    1. Приготовьте стандартный 0,4% раствор трикаина, добавив 0,004 г трикаина на 100 мл воды обратного осмоса. Аликвоту (~1 мл) изготовить раствор в свежие центрифужные пробирки объемом 1,5 мл и хранить при температуре -20 °С.
    2. Готовят покадровую среду для эмбрионов (50 мл 1Х эмбриональной среды, 0,016% трикаина) путем добавления 2 мл 0,4% раствора трикаина к 48 мл 1Х эмбриональной среды. При использовании эмбрионов >22 hpf, то также добавьте 50 μL 3% исходного раствора PTU (конечная концентрация .003% PTU) в среду для эмбрионов.
  2. Приготовление 2%-ной низкоплавкой агарозы
    1. Добавьте 0,4 г малоплавкого агарозного порошка к 20 мл 1X зародышевой среды. Нагревать 1-2 минуты или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным и все частицы не растворятся. <бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение процентного содержания агарозного геля уменьшает пористость матрицы, что может физически препятствовать росту и развитию эмбриона. Поэтому раствор агарозы можно понизить до 1,5%, чтобы свести к минимуму эти эффекты. Однако, когда возбуждающий луч остается неподвижным во время лазерной сканирующей микроскопии, может произойти больший нагрев, быстро увеличивающийся в логарифмической зависимости со временем. В этом протоколе нагревание за счет поглощения флуорофора сильно локализовано в очаговой области. Таким образом, в интересующей области температура может повышаться до значения, достаточно высокого (≥ 30 °C), чтобы расплавить растворы агарозы, полученные в процентном соотношении ниже 1,5, тем самым подвергая эмбрион прямому воздействию лазера или создавая условия, при которых эмбрион выплывает из фокальной плоскости. По этой причине не рекомендуется использовать растворы агарозы ниже 1,5%.
    2. Аликвоту (~1 мл) раствор агарозы в свежие центрифужные пробирки объемом 1,5 мл для хранения. Избыток раствора агарозы хранить в жидком виде на тепловом блоке (60-70 °С) в течение 2-3 недель.
  3. Установка эмбриона
    1. Чтобы установить камеру открытой ванны, нанесите небольшое количество высоковакуумной смазки на основание открытой камеры ванны. Поместите круглый стеклянный покровный стеклоподъемник на основание и прикрутите верхнюю часть открытой камеры ванны к основанию до упора ( Рисунок 1A, B).
    2. Пипетка (~500-700 μл) 2% раствора агарозы (60-70 °C) в открытую камеру ванны до тех пор, пока основание не заполнится на ~3/4 ( Рисунок 1C). Обратите внимание, что как только раствор агарозы оказывается в открытой камере ванны на лабораторном столе, температура раствора снижается примерно на 1 °C/с.
    3. Подождите 30 секунд, чтобы агароза немного остыла (~30-40 °C), не полимеризуясь полностью, а затем перенесите один зародыш в центр основания ( Рисунок 1D, E).
    4. Под флуоресцентным стереомикроскопом расположите эмбрион с помощью наконечника микропипетки объемом 1-10 мкл, убедившись, что эмбрион расположен близко к дну агарозы, так как эмбрион может уплыть при покрытии средой для эмбрионов, если он будет размещен слишком близко к поверхности агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На представленных видео (Видео 1-3) эмбрионы ориентированы латерально, но в зависимости от области интереса, эмбрионы могут быть ориентированы вентрально или дорсально.
    5. Следите за ситуацией и перемещайте зародыш до тех пор, пока агароза не застынет. После того, как агароза застынет, используйте передаточную пипетку, чтобы полностью заполнить собранную открытую камеру покадровой эмбриональной средой ( Рисунок 1F).
    6. Поместите открытую камеру ванны в быстросменную платформу, которая подходит для адаптера сцены ( Рисунок 1G). Поместите всю установку (эмбрион, открытую камеру для ванны, быстросменную платформу и адаптер для столика) на столик микроскопа непосредственно над конденсатором ( Рисунок 1H).

3. Настройка микроскопа для покадровой съемки

  1. Определение настроек лазера
    1. Определение длины волны лазера для использования. Используйте длину волны, которая в два раза больше длины волны возбуждения интересующего флуорофора (например, длина волны от 880 до 940 нм для GFP).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании длина волны для GFP составляла от 880 до 940 нм. Чем выше длина волны, тем ниже выходная мощность лазера.
    2. Определение лазерного излучения. Высокий процент лазерного пропускания убьет эмбрион, используйте самый низкий уровень пропускания (рекомендуется). В течение 24–48 часов покадровых исследований, представленных в настоящем документе, удерживайте передачу на уровне ниже 5%.
    3. Определите системы обнаружения под микроскопом и убедитесь, что установлены правильные фильтры для флуорофора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для многофотонных микроскопов существует несколько систем детектирования с различной чувствительностью излучаемой флуоресценции. Как правило, внутренняя система обнаружения имеет меньшую чувствительность, чем внешняя система обнаружения. Для трансгенных линий с высоким уровнем экспрессии GFP достаточно внутренней системы детектирования. Для трансгенных линий с низкими уровнями экспрессии GFP или с другими флуорофорами (например, красным флуоресцентным белком) может потребоваться внешняя система детектирования для поддержания процента лазерного пропускания на разумном уровне. Независимо от используемой системы обнаружения, должны быть установлены правильные фильтры для флуорофора.
  2. Настройка параметров программного обеспечения на многофотонном микроскопе
    1. Используя объектив 5X, найдите эмбрион. Вручную поднимите предметный столик в самое высокое положение и с помощью точной фокусировки расположите эмбрион в центре диапазона микроскопа.
    2. Вручную опустите столик и замените объектив 5X на объектив погружения в воду 25X (числовая апертура NA, 0,95). Осторожно поднимите сцену, чтобы вернуть эмбрион в фокус.
    3. В программном обеспечении нажмите на режим "xyzt" для получения нескольких изображений через временные интервалы (t) в плоскости x-y на глубине "z". Используйте эпифлуоресцентный или светлопольный вид, чтобы найти глубину резкости в области интереса, которая будет разграничивать Z-стек.
      1. В программном обеспечении нажмите кнопку «начать»; для этих экспериментов боковой край глаза был началом Z-стека. Нажмите на кнопку "Завершить"; средняя линия эмбриона была концом Z-стека.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Размер шага составлял 0,3-0,6 мкм, а всего было ~200 шагов для размера z-стека от 60 до 120 мкм).
    4. Нажмите на меню для настройки времени сбора данных и частоты съемки. Для данной системы ~200 шагов требуется примерно 5 минут для каждого захвата z-стека. Для адекватного восстановления флуорофора и выживания эмбриона необходимо обеспечить соотношение не менее 1:3 между получением z-стека (включение лазерного питания) и временем восстановления (выключенное лазерное питание).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, z-стеки собираются каждые 20 минут, при этом 5 минут — на получение z-стека и 15 минут — на восстановление. Для этого протокола можно получить более крупные z-стеки, но это соответствующим образом увеличит время между захватом z-стека, что приведет к меньшему количеству изображений в ходе покадровой съемки.
      1. При наличии подходящего времени для восстановления эмбрионов установите время между z-стеками в соответствующем окне. Задайте общую продолжительность эксперимента в соответствующем окне.
    5. Окончательная настройка программного обеспечения, лазера и эмбриона.
      1. Включите настройку изображения в реальном времени, чтобы внести окончательные корректировки в настройки лазера. Отрегулируйте лазерное излучение (см. 3.1.2), ползунки усиления и смещения в программном обеспечении для оптимизации флуоресцентного изображения. Кроме того, при необходимости корректируйте ориентацию эмбриона в зависимости от продолжительности эксперимента, предполагаемого роста эмбриона и т.д. Убедитесь, что область интереса остается в кадре на протяжении всего эксперимента.
      2. Выключите эпифлуоресцентный источник света, так как он больше не нужен во время покадровой съемки. Накройте столик лазерным сейфом ( Рисунок 1I). При использовании внутренней системы обнаружения лазерный защитный бокс достаточен для защиты от фонового света. Нажмите "пуск".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Однако при использовании более чувствительных внешних систем обнаружения лазерный защитный бокс не блокирует достаточное количество фонового света, и требуются дополнительные крышки для предотвращения нарушения получения изображения.

4. Во время покадровой съемки

  1. Заполняйте открытую камеру ванны покадровой средой для эмбрионов каждые 8-12 часов (не менее 2 раз в день) во время покадровой съемки через раздвижные дверцы на лазерном сейфе ( Рисунок 1I).
  2. Прежде чем открывать дверцы лазерного сейфа, убедитесь, что микроскоп не получает изображение активно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование нагревателей и систем циркуляционных сред не является необходимым для экспериментов с покадровой визуализацией продолжительностью от 24 до 48 часов. Действительно, температуру как столиковых, так и встроенных нагревателей трудно контролировать, и во время получения изображения эмбрион демонстрирует достаточную скорость развития в диапазоне температур от 25-28 °C. Кроме того, системы циркуляционных сред имеют тенденцию к переполнению и потенциальному повреждению оборудования. Таким образом, все эмбрионы обычно проходят стадию после приобретения.

5. Обработка после сбора

данных
  1. В программном обеспечении нажмите на меню «Файл» и выберите «Сохранить».
  2. Откройте файл в программе обработки изображений (см. Таблицу материалов). Выделите правильный ряд изображений. В программном обеспечении выберите меню «Процесс». Нажмите на 3D Deconvolution и нажмите "Apply", чтобы деконволюционировать каждый z-стек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файл большой; Поэтому этот шаг может занять много часов.
  3. В программном обеспечении в меню "Процесс" нажмите на "Максимальная проекция". Нажмите "Применить", чтобы запустить максимальную проекцию для создания 1 изображения на z-стек. Экспортируйте каждый максимально проецируемый файл (1 изображение на z-стек) в формате tiff.
  4. Импортируйте отдельные файлы tiff в программу обработки видео. Выделите все файлы tiff и перетащите их в видеоредактор. Отрегулируйте длину каждого изображения в видео до 0,1 секунды. Экспортируйте видео в формате mov или mp4.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мульти Фотон флуоресценции покадровой изображений создаются серию видеофильмов, которые показали миграционных черепной нейронные крест клеток, которые порождают черепно-лицевых структур и переднего сегмента глаза в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) у рыбок данио линии. Например sox10 -положительных гребень нейронные клетки между 12 и 30 hpf мигрируют от края нервной трубки в челюстно-лицевой области (видео 1, рис. 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мульти Фотон покадровой изображений позволяет отслеживать в естественных условиях переходных и мигрирующих клеточных популяций. Эта мощная техника может использоваться для исследования эмбриональных процессы в режиме реального времени, и в настоящем исследовании, результаты этого метода расширения текущих знаний гребень нейронные клетки миграции и развития. Предыдущие исследования покадровой изображений обычно используют Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. 29 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была финансовую поддержку через гранты от Национальный глазной институт национальных институтов здравоохранения (K08EY022912-01) и видение исследования Core (P30 EY007003).

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Томас Шиллинг за любезно дар рыбы Tg (sox10:eGFP) и Мэри Хэллоран для любезно дар Tg рыбы(foxd3:GFP) .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Аквариумы для разведения с разделителямиАкванерингZHCT100Кроссинг Бак Комплект (1,0 литра) Прозрачный поликарбонат с крышкой и вкладышем
M205 FA Combi-Scope LeicaMicrosystems CMS GmbHСтереофлуоресцентный микроскоп - FusionOptics и TripleBeam
Sodium ChlorideMillipore (EMD)7760-5KGДвойной полиэтиленовый мешок. CAS No 7647-14-5, EC No 231-598-3
Миллипоры хлорида калия(EMD)1049380500Хлорид калия 99.999 Супрапур. CAS No 7447-40-7, номер EC 231-211-8.
Дигидрат хлорида кальцияFisher ScientificC79-500Poly флакон; 500 г. CAS No 10035-04-8
Сульфат магния (безводный)Millipore (EMD)MX0075-1Poly флакон; 500 г. CAS No 7487-88-9, EC Number 231-298-2
Метиленовый синиймиллипор (EMD)284-12Стеклянный флакон; 25 г. Порошок, сертифицированный биологический краситель
бикарбоната натрияМиллипор (EMD)SX0320-1Поли бутылка; 500 г. Порошок, GR ACS. CAS No 144-55-8, номер EC 205-633-8
N-фенилтиомочевинаSigmaP7629-25G>98%. CAS No 103-85-5, номер EC 203-151-2
ДиметилсульфоксидSigmaD8418-500MLМарка молекулярной биологии. CAS No 67-68-5, номер EC 200-664-3
Трикаин метансульфонатWestern Chemical Inc.MS222Tricaine-S
Низкоплавкая агарозаISC BioexpressE-3112-25GeneMate Sieve GQA Низкоплавкая агароза, 25 г
Открытая ванна КамераWarner InstrumentsRC-40HPВысокопрофильные
стеклянные покровные стеклаFisher Scientific12-545-102Круглая защитная пленка. Диаметр 25 мм
Высоковакуумная смазкаFisher Scientific14-635-5CТрубка 2,0 фунта. DOW CORNING CORPORATION
1658832
Платформа быстрой заменыWarner InstrumentsQE-135 мм
Адаптер столикаWarner InstrumentsSA-20LZ-AL16,5 x 10 см
TC SP5 MP многофотонный микроскопLeica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire LaserSpectraPhysics
Лазерный сейфLeica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X)  Программное обеспечениеLeica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 версии 13.0 x64 программное обеспечениеAdobe
iMovie версии 10.1.4 Программное обеспечениеApple

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
  2. Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-4208 (2005).
  3. Minoux, M., Rijli, F. M. Molecular mechanisms of cranial neural crest cell migration and patterning in craniofacial development. Development. 137, 2605-2621 (2010).
  4. Trainor, P. A. Specification of neural crest cell formation and migration in mouse embryos. Sem Cell Dev Biol. 16, 683-693 (2005).
  5. Johnston, M. C., Noden, D. M., Hazelton, R. D., Coulombre, J. L., Coulombre, A. Origins of avian ocular and periocular tissues. Exp Eye Res. 29, 27-43 (1979).
  6. Bohnsack, B. L., Kahana, A. Thyroid hormone and retinoic acid interact to regulate zebrafish craniofacial neural crest development. Dev Biol. 373, 300-309 (2013).
  7. Chawla, B., Schley, E., Williams, A. L., Bohnsack, B. L. Retinoic acid and pitx2 regulate early neural crest survival and migration in craniofacial and ocular development. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. , (2016).
  8. Trainor, P. A., Tam, P. P. L. Cranial paraxial mesoderm and neural crest cells of the mouse embryo-codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in branchial arches. Development. 121 (8), 2569-2582 (1995).
  9. Hong, C. S., Saint-Jeannet, J. P. Sox proteins and neural crest development. Sem Cell Dev Biol. 16, 694-703 (2005).
  10. Steventon, B., Carona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Sem Cell Dev Biol. 16, 647-654 (2005).
  11. Dressler, S., et al. Dental and craniofacial anomalies associated wth Axenfeld-Rieger syndrome with PITX2 mutation. Case Report Med. , 621984(2010).
  12. Ozeki, H., Shirai, S., Ikeda, K., Ogura, Y. Anomalies associated with Axenfeld-Rieger syndrome. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 237 (9), 730-734 (1999).
  13. Strungaru, M. H., Dinu, I., Walter, M. A. Genotype-phenotype correlations in Axenfeld-Rieger malformation and glaucoma patients with FOXC1 and PITX2 mutations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 228-237 (2007).
  14. Tumer, Z., Bach-Holm, D. Axenfeld-Rieger syndrome and spectrum of Pitx2 and Foxc1 mutations. Eur J Hum Genet. 17, 1527-1539 (2009).
  15. Schoner, K., et al. Hydrocephalus, agenesis of the corpus callosum, and cleft lip/palate represent frequent associations in fetuses with Peters plus syndrome and B3GALTL mutations. Fetal PPS phenotypes, expanded by Dandy Walker cyst and encephalocele. Prenat Diagn. 33 (1), 75-80 (2013).
  16. Aliferis, K., et al. A novel nonsense B3GALTL mutation confirms Peters plus syndrome in a patient with multiple malformations and Peters anomaly. Ophthalmic Genet. 31 (4), 205-208 (2010).
  17. Lesnik Oberstein,, S, A., et al. Peters Plus syndrome is caused by mutations in B3GALTL, a putative glycosyltransferase. Am J Hum Genet. 79 (3), 562-566 (2006).
  18. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53, 835-850 (2009).
  19. Bohnsack, B. L., Kasprick, D., Kish, P. E., Goldman, D., Kahana, A. A zebrafish model of Axenfeld-Rieger Syndrome reveals that pitx2 regulation by retinoic acid is essential for ocular and craniofacial development. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (1), 7-22 (2012).
  20. Williams, A. L., Eason, J., Chawla, B., Bohnsack, B. L. Cyp1b1 regulates ocular fissure closure through a retinoic acid-independent pathway. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (2), 1084-1097 (2017).
  21. Curran, K., Raible, D. W., Lister, J. A. Foxd3 controls melanophore specification in the zebrafish neual crest by regulation of Mitf. Dev Biol. 332 (2), 408-417 (2009).
  22. Dutton, K., Dutton, J. R., Pauliny, A., Kelsh, R. N. A morpholino phenocopy of the colourless mutant. Genesis. 30 (3), 188-189 (2001).
  23. Dutton, K. A., et al. Zebrafish colourless encodes sox10 and specifies non-ectomesenchymal neural crest fates. Development. 128 (21), 4113-4125 (2001).
  24. Kucenas, S., Takada, N., Park, H. C., Woodruff, E., Broadie, K., Appel, B. CNS-derived glia ensheath peripheral nerves and mediate motor root development. Nat Neurosci. 11, 143-151 (2008).
  25. Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  27. Denk, W., Delaney, K. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  28. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle developmnt to changes in retinoic acid and insulin-like growth factor signaling. PLoS ONE. 6, e22991(2011).
  29. Gfrerer, L., Dougherty, M., Laio, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10:kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. J Vis Exp. (79), e50525(2013).
  30. Lopez, A. L. R., Garcai, M. D., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Live confocal microscopy of the developing mouse embryonic yolk sac vasculature. Methods Mol Biol. 1214, 163-172 (2015).
  31. McGurk, P. D., Lovely, C. B., Eberhart, J. K. Analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4D confocal microscopy. J Vis Exp. (83), e51190(2014).
  32. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods Enzymol. 476, 351-377 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multi Photon ImagingTime Lapse MicroscopyNeural Crest CellsZebrafish EmbryosSox10 EGFPFoxd3 GFPLaser Scanning MicroscopyFluorescence ImagingEmbryo MountingZ Stack Acquisition

Related Articles