Сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длинные волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата изображений с высоким разрешением, трехмерные, реального времени нейронные крест миграции в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) zebrafish эмбриона.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мульти Фотон время Замедленная съемка изображений для визуализации в режиме реального времени разработки: Визуализация миграции клеток нервной гребень в Zebrafish эмбриона
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Врождённая глаз и черепно-лицевых аномалий отражают сбои в нейронные крест, переходных населения мигрирующих стволовых клеток, которые порождают многочисленные типы клеток по всему телу. Понимание биологии нейронные крест был ограниченным, что отражает отсутствие генетически шансов справиться с возникающими моделей, которые могут быть изучены в естественных условиях и в режиме реального времени. Данио рерио представляет собой особо важное значение развития модель для изучения популяций мигрирующих клеток, например нейронные крест. Для изучения миграции нейронные крест в развивающихся глаз, сочетание передовых оптических методов лазерной сканирующей микроскопии с длиной волны возбуждения флуоресценции мульти ФОТОН был реализован для захвата видео с высоким разрешением, трехмерные, реальном времени развивающихся глаза в трансгенных данио рерио эмбрионов, а именно: Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP), как sox10 и foxd3 было показано в многочисленных животных моделей для регулирования раннего нейронные крест дифференциации и вероятно представляют маркеры для гребня нейронные клетки. Мульти Фотон покадровой изображения была использована для различить поведение и миграционные процессы двух нейронные крест клеточных популяций способствуют раннему развитию глаз. Этот протокол предоставляет информацию для создания покадровой видео во время миграции данио рерио нейронные крест, как, например и может применяться для визуализации раннего развития многих структур в данио рерио и других модельных организмов.
Введение
Врожденных глазных болезней может привести к слепоте детство и часто из-за аномалий черепа нейронные крест. Гребень нейронные клетки являются переходные стволовые клетки, которые возникают от нервной трубки и образуют многочисленные тканях по всему телу. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 гребень нейронные клетки, производный от переднего мозга и среднего мозга, привести к кости и хряща средней зоны лица и лобной области, Ирис, роговицы, Трабекулярная сеть, и склеры в переднего сегмента глаза. 4
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанный здесь протокол был выполнен в соответствии с рекомендациями по гуманному обращению с лабораторными животными, установленными Комитетом Мичиганского университета по использованию и уходу за животными (UCUCA).
1. Сбор эмбрионов для покадровой визуализации
- Между 3 и 9 часами вечера посадите самца и самку взрослых Tg(sox10:EGFP) или Tg(foxd3:GFP) трансгенных данио-рерио в разделенном аквариуме для парного спаривания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбы Tg(sox10:EGFP) и Tg(foxd3:GFP), добрые подарки от Томаса Шиллинга и Мэри Халлоран, соответственно, были скрещены в фон Каспера (roy -/-,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мульти Фотон флуоресценции покадровой изображений создаются серию видеофильмов, которые показали миграционных черепной нейронные крест клеток, которые порождают черепно-лицевых структур и переднего сегмента глаза в Tg (sox10:EGFP) и тг (foxd3:GFP) у рыбок данио линии. Например sox10 -положительных гребень нейронные клетки между 12 и 30 hpf мигрируют от края нервной трубки в челюстно-лицевой области (видео 1, рис. 2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мульти Фотон покадровой изображений позволяет отслеживать в естественных условиях переходных и мигрирующих клеточных популяций. Эта мощная техника может использоваться для исследования эмбриональных процессы в режиме реального времени, и в настоящем исследовании, результаты этого метода расширения текущих знаний гребень нейронные клетки миграции и развития. Предыдущие исследования покадровой изображений обычно используют Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. 29 ,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Эта работа была финансовую поддержку через гранты от Национальный глазной институт национальных институтов здравоохранения (K08EY022912-01) и видение исследования Core (P30 EY007003).
Благодарности
Авторы благодарят Томас Шиллинг за любезно дар рыбы Tg (sox10:eGFP) и Мэри Хэллоран для любезно дар Tg рыбы(foxd3:GFP) .
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аквариумы для разведения с разделителями | Акванеринг | ZHCT100 | Кроссинг Бак Комплект (1,0 литра) Прозрачный поликарбонат с крышкой и вкладышем |
| M205 FA Combi-Scope Leica | Microsystems CMS GmbH | Стереофлуоресцентный микроскоп - FusionOptics и TripleBeam | |
| Sodium Chloride | Millipore (EMD) | 7760-5KG | Двойной полиэтиленовый мешок. CAS No 7647-14-5, EC No 231-598-3 |
| Миллипоры хлорида калия | (EMD) | 1049380500 | Хлорид калия 99.999 Супрапур. CAS No 7447-40-7, номер EC 231-211-8. |
| Дигидрат хлорида кальция | Fisher Scientific | C79-500 | Poly флакон; 500 г. CAS No 10035-04-8 |
| Сульфат магния (безводный) | Millipore (EMD) | MX0075-1 | Poly флакон; 500 г. CAS No 7487-88-9, EC Number 231-298-2 |
| Метиленовый синий | миллипор (EMD) | 284-12 | Стеклянный флакон; 25 г. Порошок, сертифицированный биологический краситель |
| бикарбоната натрия | Миллипор (EMD) | SX0320-1 | Поли бутылка; 500 г. Порошок, GR ACS. CAS No 144-55-8, номер EC 205-633-8 |
| N-фенилтиомочевина | Sigma | P7629-25G | >98%. CAS No 103-85-5, номер EC 203-151-2 |
| Диметилсульфоксид | Sigma | D8418-500ML | Марка молекулярной биологии. CAS No 67-68-5, номер EC 200-664-3 |
| Трикаин метансульфонат | Western Chemical Inc. | MS222 | Tricaine-S |
| Низкоплавкая агароза | ISC Bioexpress | E-3112-25 | GeneMate Sieve GQA Низкоплавкая агароза, 25 г |
| Открытая ванна Камера | Warner Instruments | RC-40HP | Высокопрофильные |
| стеклянные покровные стекла | Fisher Scientific | 12-545-102 | Круглая защитная пленка. Диаметр 25 мм |
| Высоковакуумная смазка | Fisher Scientific | 14-635-5C | Трубка 2,0 фунта. DOW CORNING CORPORATION 1658832 |
| Платформа быстрой замены | Warner Instruments | QE-1 | 35 мм |
| Адаптер столика | Warner Instruments | SA-20LZ-AL | 16,5 x 10 см |
| TC SP5 MP многофотонный микроскоп | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Mai Tai DeepSee Ti-Sapphire Laser | SpectraPhysics | ||
| Лазерный сейф | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Leica Application Suite X (LAS X) Программное обеспечение | Leica Microsystems CMS GmbH | ||
| Photoshop CS 6 версии 13.0 x64 программное обеспечение | Adobe | ||
| iMovie версии 10.1.4 Программное обеспечение | Apple |
Ссылки
- Barembaum, M., Bronner-Fraser, M. Early steps in neural crest specification. Sem Cell Dev Biol. 16, 642-646 (2005).
- Gage, P. J., Rhoades, W., Prucka, S. K., Hjalt, T. Fate maps of neural crest and mesoderm in the mammalian eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (11), 4200-....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
