Этот протокол описывает характеристики синтеза ДНК-полимеразы измененных ДНК путем наблюдения изменений в ближней ИК-области дневно обозначенные ДНК с помощью электрофореза геля и гель изображений. Акриламид Гели используются для отображения с высоким разрешением разделения коротких нуклеиновых кислот, которые мигрируют по различным ставкам в зависимости от размера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
ДНК-полимераза деятельности пробирного с использованием флуоресцентных помечены ДНК ближней ИК-области визуализирована электрофорезом геля акриламида
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для любого ферментов надежные, количественные методы необходимы для характеризации как родного, так и инженерии ферментов. Для ДНК-полимеразы синтез ДНК можно охарактеризовать с помощью в vitro ДНК синтеза assay следуют электрофореза геля полиакриламида. Цель этого анализа заключается в количественном определении синтеза ДНК природных и модифицированных ДНК (M-ДНК). Эти подходы являются особенно полезными для урегулирования олигонуклеотиды с резолюцией единичных нуклеотидных, позволяя наблюдения отдельных шагов во время синтеза олигонуклеотида ферментативные. Эти методы были применены к оценке массива биофизических и биохимических свойств, таких как измерение константы скорости установившегося отдельных этапов синтеза ДНК, ошибка скорость синтеза ДНК и ДНК сродство. С помощью изменения компонентов, включая, но не ограничиваясь, модифицированных нуклеозидов трифосфаты (NTP), M-ДНК, и/или мутант полимераз, относительной полезности субстрата ДНК-полимеразы, которую можно эффективно оценивать пар. Здесь мы подробно assay, включая изменения, которые должны быть сделаны для размещения нетрадиционных грунтовка ДНК маркировки таких стратегий, как инфракрасный дневно помечены ДНК. Кроме того мы подробно важнейшие технические шаги для заливки гель акриламида и запуск, который часто может быть технически сложным.
Введение
Полимераз выполняют точные и эффективные синтез ДНК и необходимы для поддержания целостности генома. Способность синтезировать сотни нуклеотидов в секунду без внесения ошибок также делает ДНК полимеразы необходимыми инструментами в молекулярной биологии и биотехнологии. Однако эти свойства также ограничить приложения для M-ДНК субстратов; вообще говоря, природные полимераз не может синтезировать многие потенциально ценные М-ДНК субстратов, вероятно из-за высокой селективного давления против использования нестандартных субстратов в естественных условиях. Многие группы разработали направленной эволюции подходов для создания мутантных полимераз способны M-ДНК си....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. деятельности пробирного
Примечание: существует два типичных видов анализов, которые часто выполняются характеризовать полимераз, используя методы, описанные здесь. Они отличаются ли они качественно характеризуют общую синтеза (охватывающей многие шаги синтеза ДНК) или ли они количественно сосредоточить внимание на отдельных шагах. Мы описывают шаги, необходимые для каждой из них ниже.
Примечание: Поскольку Ассамблея материалов являются относительно сложными, для времени чувствительные эксперименты, мы рекомендуем заранее собраны все материалы. Рецепты всех важнейших компонентов assay, перечислены ниже. Коммерческие поставщики компо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Показаны успешные геля полиакриламида анализ качественную характеристику общей активности (описано в разделе 2.1, рис. 1) и кинетики устойчивого состояния (описанный в записке на завершение раздела 2.1, рис. 2). Анализ неудачного геля полиакриламида также показано (рис. 3).
Обратите внимание, что используется не коммерчески доступных лестни.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описали assay характеризовать синтеза ДНК полимеразы опосредованной M-ДНК. С помощью ближней ИК меткой ДНК грунты, а использование денатурируя электрофореза геля полиакриламида решить по-разному размера олигонуклеотиды, мы можем получить единичных нуклеотидных резолюции на олигонуклеотиды, позволяя точное измерение синтеза. Эти подходы могут использоваться либо измерить общую активность фермента (раздел 2.1) или для измерения параметров Михаэлиса-Menten отдельных шагов (Обратите внимание на следующий шаг 2.1). Н.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Эта работа была поддержку корпорацией исследований для научного прогресса (Коттрелл колледж Scholar премии #22548) и TriLink биотехнологий (ResearchReward Грант #G139).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2Fisher | Scientific | BP214-500 | |
| Ацетилированный BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Дитиотреитол (т.е. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Этилендиаминтетрауксусная кислота (т.е. ЭДТА) (0,5М раствор) | Sigma | 03690-100mL | |
| Глицерин | Sigma | G5516 | |
| Формамид | Акрос | AC42374-5000 | |
| оранжевый G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Бромофенол синий | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTP (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTP (все другие модифицированные NTP) | TriLink Biotechnologies | ассорти | |
| праймер 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | Мы используем краситель IR700, который можно приобрести в качестве индивидуального синтеза. Обычно мы покупаем олигонуклеотиды ВЭЖХ очищенные. Последовательность 5'-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | Обычно мы покупаем олигонуклеотиды ВЭЖХ, очищенные от ВЭЖХ. Последовательность 5'-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38,67% акриламида и 1,33% бис-акриламида |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Мочевина сверхчистая | Research Products International | U20200 | |
| Гелевая лента | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Большой белый пружинный зажим полипропилен | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Персульфат аммония (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Тетраметилэтилендиамин (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0,75 мм прокладки | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Набор пластин с зазубринами на стекле | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Клиновая пластина-сепаратор | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Гребень для гель-электрофореза | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Установка для гель-электрофореза | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| сверхчистая вода | мы используем систему Milli-Q из Millipore | ||
| DNA полимеразы | Мы готовим их в нашей лаборатории, используя опубликованные протоколы. |
Ссылки
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
