Представлен метод для масс-спектрометрических анализа эндогенных пептидов в человека спинномозговой жидкости (CSF). Применяя молекулярный вес отключения фильтрации, хроматографического до фракционирования, масс-спектрометрических анализа и последующего сочетание стратегий идентификации пептид, удалось расширить известные ФГО peptidome почти в десять раз по сравнению с предыдущими исследованиями.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Пробоподготовки для анализа Endopeptidomic в цереброспинальной жидкости человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол описывает метод для выявления эндогенного пептидов в человека спинномозговой жидкости (CSF). Для этой цели ранее разработанный метод, основанный на молекулярный вес производства (MWCO) фильтрации и масс-спектрометрических анализ в сочетании с шагом до фракционирования ВЭЖХ автономной высоком рН обратной фазы.
Секреция в спинномозговой жидкости является основным каналом для удаления молекул пролить клетки центральной нервной системы. Таким образом многие процессы в центральной нервной системе, отражены в спинномозговой жидкости, что делает его ценным диагностическим жидкости. CSF имеет сложные композиции, содержащие белки, которые охватывают диапазон концентрации 8-9 порядков. Кроме белков предыдущие исследования также продемонстрировали наличие большого числа эндогенного пептиды. В то время как менее широко изучены чем белков, они также может проводить потенциальный интерес как биомаркеров.
Эндогенные пептиды были отделены от содержание белка в спинномозговой жидкости через MWCO фильтрации. Удаляя большинство содержание белка из примера, можно увеличить объем образца учился и таким образом также общее количество эндогенного пептиды. Сложность смесь фильтруют пептид был рассмотрен, включая фазу обратный шаг до фракционирования ВЭЖХ (RP) в щелочной рН до анализа LC-MS. Фракционирование в сочетании с простой конкатенации схема, где 60 фракций были объединены в 12, потребление времени анализа может быть уменьшено таким образом все еще в значительной степени избегая совместное Элюирующий.
Автоматизированный пептид идентификации была выполнена с помощью трех разных пептидных/белков идентификации программ и впоследствии объединения результатов. Различные программы были взаимодополняющими, а не сопоставимы с менее чем 15% идентификаций, перекрываются между тремя.
Введение
Биомаркеры в спинномозговой жидкости (CSF) в настоящее время превращения исследований в нейродегенеративных расстройств. В болезни Альцгеймера, наиболее распространенных нейродегенеративных расстройств, влияющих на более чем 60 миллионов человек во всем мире1,2, биомаркер триплет, состоящий из пептида амилоида бета, стабилизации микротрубочек белка Тау и фосфорилированных Тау формы, можно обнаружить болезнь с высокой чувствительностью и специфичностью и была включена в диагностических исследований критерии3. В других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и рассея....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Описанные ниже протокол является изысканной версии используется в предыдущем исследовании, где большое количество эндогенных пептиды были определены в человека ФГО15. Обновления для исходного протокола включают незначительные изменения к химической предварительной обработки спинномозговой жидкости, а также оптимизация градиента, используемого для автономных высоком рН RP HPLC до фракционирования.
Этические соображения
Все исследования шведского пациента и контроля материалов были одобрены этические комитетам: St. Йёран (ref. 2005-554-31/3). Образцов спинномозговой жидкости....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Метод, описанный здесь применялся и оценены в трех исследованиях до введения образца до фракционирования (таблица 1). Первое исследование используется автономный LC для пятнать ФГО дроби на тарелку целевой MALDI и привели к11730 выявленных эндогенного пептиды. В двух следующих исследований было занято Изобарический маркировки. Главным образом в случае/управления исследования для идентификации и характеризации потенциальных биомаркеров в спинномозговой жидкости endopeptidome и протеом одновременно<.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Введение к ранее разработанный протокол для восстановления эндогенного пептидов шаг RP HPLC предварительно фракционирование высоком рН молекулярный вес ультрафильтрации11 снижение относительной выборки сложности и таким образом позволяет для 5 раз больше объем образца необходимо изучить. Это, в свою очередь, увеличение концентрации подмножество пептидов в каждой фракции и тем самым улучшить шансы обнаружения низкого обильные пептиды.
Выполняя стратегию идентификации для.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Не поступало никаких конкурирующие интересы, финансовые или иные, между авторами.
Благодарности
Большое спасибо Танвир Батт и коллег за Советом в создании метода предварительно фракционирования.
Эта работа была поддержана финансирование от шведского исследовательского совета, Валлстрём и Шеблум фонд, пистолет и Бертиль СТОГНЕ фонд Stiftelse, Магнус Bergwall фонд, Фонд Åhlén, Alzheimerfonden, Demensförbundet, för Стифтельсен Gamla Tjänarinnor, кнут и Фонд Рауля Валленберга Алиса, Frimurarestiftelsen и Götalandsregionen FoU-Västra.
Основными получателями финансирования для этого проекта были Kaj Blennow, Хенрик Зеттерберг и Йохан Gobom.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 м Триэтиламмоний бикарбонат | Флюка, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Гуанидиния гидрохлорид | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)фосфина гидрохлорид | Pierce | 20490 | TCEP |
| Йодоацетамид | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Гидроксиламин 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Ацетонитрил, дальний УФ, градиент ВЭЖХ класса | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Муравьиная кислота | Флюка, Сигма-Олдрич | 56302-1ML-F | FA |
| Трифторуксусная кислота | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| раствор гидроксида аммония | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Центробежный фильтрующий блок Amicon Ultra-15 с мембраной Ultracel-30 | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-фильтр |
| Sep-Pak C18, 100 мг | воды | WAT023590 | SPE-колонна |
| Resprep 12-портовый коллектор SPE | Restek | 26077 | Вакуумный коллектор |
| TMT10plex Изобарическая этикетка Набор реагентов | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Онлайн разделение образцов |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Бинарная система | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Оффлайн высокоpH-фракционирование |
| Orbitrap Fusion Tribrid масс-спектрометр | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Масс-спектрометр для анализа проб |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Поисковик протеомики |
| Секвестр HT | Thermo | - | Поисковик протеомики |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Поисковик протеомики |
| Acclaim PepMap 100, 75 и микро; м x 2 см, C18, 100 & размер пор, 3 и микро; m размер частиц | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Колонна ловушки (нано ВЭЖХ) |
| Acclaim PepMap C18, 75 &; м х 500 мм, 100Å размер пор, 2 & микро; m размер частиц | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Разделительная колонка (нано ВЭЖХ) |
| Высокопроизводительные концентраторы Savant SpeedVac | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Вакуумный концентратор |
| XBridge Peptide BEH C18 Колонка, 130Å, 3,5 &; м, 2,1 мм x 250 мм | Водяная | 186003566 | сепарирующая колонна (микро ВЭЖХ) |
Ссылки
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
