Методическая статья

Регенерация выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в реальном времени ячейки

DOI:

10.3791/56250

⸱

12 марта 2018 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Pharmacy, Nanjing Medical University, 3State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, College of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing Tech University, 4Department of Medical Oncology, Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Institute of Cancer Research, The Affiliated Cancer Hospital of Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает общую стратегию, для повторного создания коммерческих выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для метки бесплатный мобильный анализатор, направленных на экономию на высокой работает на основе ofmicrochip анализов затрат. Пищеварение трипсина, полоскание с этанол и вода и спиннинг шаг, который позволяет повторное использование микросхем включает в себя процесс регенерации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этикетка бесплатно на основе ячеек пробирного выгодно для биохимического исследования из-за него не требует использования экспериментальных животных. Из-за его способности предоставлять более динамичной информации о клетки в физиологических условиях, чем классическая биохимических анализов этот assay лейбл бесплатно реального времени клетки, основанного на принципе электроимпедансной привлекает больше внимания в течение последних десятилетия. Однако его практического использования могут быть ограничены из-за относительно высокой стоимостью измерения, в котором дорогостоящих расходных одноразовых золотые микросхемы используются для анализатор клеток. В этом протоколе мы разработали общую стратегию для регенерации выстроились золото микроэлектродов, оборудованных для анализатора в коммерческих лейбл свободных клеток. Пищеварение трипсина, полоскание с этанол и вода и спиннинг шаг включает в себя процесс регенерации. Предложенный метод был испытания и показали свою эффективность для регенерации и повторного использования коммерческих электронных плит по крайней мере три раза, который поможет исследователям сохранить на высокой стоимости работает в реальном времени клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Из-за его эффективное и менее трудоемкий процесс экспериментальной лейбл свободной ячейки-технологии на основе стал свидетелем быстрого роста за последнее десятилетие в целях как аналитической, так и отбора таких как в аспекте протеомики1,2 , препарат доставки3, и т.д.4,5 по сравнению с традиционными биохимических методов, направленных на анализ клеток, assay этикетка бесплатно реального времени клетки с прототип, разработанный Giaever и coworkers ранее6 основана на принципе регистрации изменений электрического сигнала на поверхности клеток придает микрочипы, которые допускают непрерывного измерения роста клеток или миграции в количественном выражении. Следуя этой стратегии был запущен в реальном времени ячейки электронной зондирования (RT-КЕС) системы, используя принцип электрическое сопротивление на основе обнаружения был представлен7,8 и совсем недавно коммерческой реального времени ячейки анализатор (RTCA) для лабораторных исследований9.

Главным образом, коммерческие реального времени ячейки анализатор считывает клеток вызвали сигналы электрического сопротивления, которые приводят к от физиологических изменений инкубирован клеток, включая пролиферацию клеток, миграции, жизнеспособность, морфология и соблюдение на поверхность микросхемы,1011. Такие электрические сигналы далее преобразуются Безразмерный параметр с именем индекса ячейки (CI) для оценки состояния ячейки в анализатор. Изменение сопротивления микросхемы отражает главным образом местных ионных окружающей среды покрыты клеток в интерфейсе электрода/решения. Таким образом аналитическая производительность анализатор клеток полагается на ядро зондирования блок, одноразовые микросхемы (то есть, так называемые электронные пластины, например, 96/16/8-Ну), изготовленные из выстроились золото микроэлектродов lithographically печать в нижней части скважины инкубации. Золото микроэлектродов собрать в формате круг на линия (рис. 1) и покрывают большую часть площади поверхности инкубации скважин, которые позволяют для обнаружения динамических и чувствительных прилагаемый клетки3,12,13 ,14. CI увеличит в случае более поверхности покрытия клеток на чипе и уменьшаться, когда клетки подвергаются токсикант, что приводит к апоптозу. Хотя анализатор реального времени клетки часто использовался для определения цитотоксичность11 и нейротоксичность15 и предоставить больше кинетическая информации, чем классическая конечных точек метод, одноразовые электронные пластины являются дорогостоящая Расходные материалы.

До сих пор были не доступны методы для регенерации электронных пластины, которая, вероятно, объясняется тем, что суровые регенерации условия, такие как пираньи решения или уксусной кислоты являются участие16,17, 18, которые могут изменить состояние электрических золотые микросхемы. Таким образом мягкий и эффективный метод для удаления адэрентных клеток и других веществ с поверхности золотые фишки будет желательным для процесса регенерации электронных пластины. Мы недавно разработали протокол, направленный на регенерацию одноразовых электронных плит с использованием неагрессивных реагентов и регенерированный фишки характеризовались электрохимический, а также оптические методы19. С помощью легко доступных и умеренные лабораторных реагентов, включая трипсина и этанола, мы создали общий метод для повторного создания коммерческих электронных пластину без побочных эффектов, который успешно применяется для регенерации два основных типа электронные пластины (16 и L8) используется для RTCA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: В общем, процесс регенерации включает Пищеварение трипсина и полоща шаг с этанол и вода. Пищеварение время меняется в зависимости от количество ячеек, которые используются, и тип и количество ячеек, которые используются могут отличаться в зависимости от экспериментальных целях. Рекомендуется проверить регенерированный микросхемы с помощью оптических и электрохимические методы для оптимизации условий регенерации. В ходе эксперимента растворимых и нерастворимых химических веществ могут быть вовлечены, и здесь описаны эти два типичных случаев регенерации процедур.

1. Подготовка регенерации растворов

Примечание: Подготовка и обрабатывать все решения в стерильных условиях.

  1. Готовить свежий раствор трипсин 0.25% (g/v). Трипсина могут быть приобретены или свежеприготовленные следующим образом.
    1. Растворите 0,25 g трипсина в 100 мл физиологического раствора фосфатного буфера рН 7,4 (PBS).
    2. Перемешайте раствор, пока трипсина полностью растворится в 4 oC. перемешать раствор на низкой скорости, заботясь, чтобы избежать каких-либо формирования пузыря.
    3. Фильтр решение с 0,22 мкм фильтром в капюшоне биобезопасности.
  2. Подготовьте 75% этанола с помощью абсолютного этанола. Налить 75 мл абсолютного этанола в объемной колбу и Добавьте деионизированной воды до тех пор, пока объем достигает 100 мл. При необходимости выполнения дальнейшей стерилизации.

2. инкубации и пролиферации A549 клеток в электронных плит

Примечание: Электронные пластины типы 16 и L8 оба сделаны из выстроились золото микроэлектродов lithographically напечатаны в нижней части скважины инкубации. Электронные пластины 16 имеет 16 скважин, а электронные пластины L8 8 скважин. Уэллс электронной пластины 16 раунда пока скважин электронной пластины L8 прямоугольников со скругленными углами. Объем каждой электронной пластины 8 хорошо составляет около 830 мкл и каждый электронный планшет 16 хорошо около 270 мкл.

  1. Культура клеток A549
    1. Культура A549 клетки в Розуэлле парк Мемориальный институт-1640 среднего (RPMI 1640) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллин стрептомицина в клеточной культуре блюдо.
    2. Проход клетки, когда плотность клеток достигает ~ 75% затем вымыть слоя адэрентных клеток с 1 × PBS и trypsinize с 0,25% раствор трипсина за 1 мин на 37 oC. центрифуги клетки на 179 г × 5 мин для удаления трипсина. Ресуспензируйте клетки в 10 мл среды для дальнейшего культуры или других экспериментов.
      Примечание: Здесь решение клеток высокомобильна в среде обозначается как буфер подвеска клетки.
    3. Взять 10 мкл и подсчитать ячейки с помощью Горяева. Используйте средство RPMI 1640 для дальнейшего разбавления буфер подвеска клетки подготовить 30 000-80 000 клеток/мл клеток подвеска буфер для экспериментов.
  2. Распространение/цитотоксичность эксперимент и сбора данных
    1. Добавьте 50 мкл (150 мкл для электронных плиты L8) клеток средних каждого инкубации также электронные пластины 16 и оставить на 30 мин в области биобезопасности капот для уравновешивания. Вставка электронной пластины 16 вручную в реальном времени ячейки анализатора CO2 инкубатора на 37 oC.
    2. Запуск реального времени ячейки анализатор операции программы на компьютере. По умолчанию эксперимент шаблон настройки страницы, выберите «Эксперимент модель» и имя работает assay.
    3. На своей странице макета выберите соответствующий скважин, которые включены в эксперимент и ввести информацию, как тип, номер и наркотиков названия ячеек в поля ввода. На своей странице Расписание добавьте экспериментальные шаги, а затем выберите время работы (например, 12, 24 или 48 ч) каждый шаг и интервал сбора данных в реальном времени.
      Примечание: Здесь, интервал шага 1 и 2 являются 1 мин и 15 мин после этого.
    4. Сохраните файл и нажмите кнопку «Пуск» для измерения импеданса фон СМИ на своей странице индекса ячейки; полученные данные будут автоматически вычитаться. На своей странице хорошо граф можно посетить все хорошо кривых. На его участок страницы, добавьте скважин и график время ячейки индекса будет показан.
    5. Для эксперимента распространения клеток во-первых, нажмите кнопку «Пауза» для приостановки выполнения программы. Затем вынуть пластину электронных и добавьте 100 мкл A549 клеток подвеска буфера за хорошо при комнатной температуре. Оставьте пластину на 30 мин в биобезопасности капот, чтобы поселиться в нижней части скважины инкубации клеток.
    6. Вставка электронной пластины в реальном времени ячейки анализатор станции вручную. Нажмите кнопку «Пуск», чтобы продолжить эксперимент.
      Примечание: На странице сюжет, анализатор постоянно записывает значения индекса ячейки или кривых на протяжении всего эксперимента.
    7. Когда эксперимент завершится, введите странице сюжет и откройте файл эксперимент. Затем выберите все протестированные инкубации скважины и результирующий индекс ячейки кривых, которые могут быть в среднем или нормализации в последний раз перед добавлением фармацевтических препаратов или изменения средних и уменьшить различия между анализов. На странице анализа данных можно рассчитать ЭК50 или IC50

3. регенерация электронных плит

Примечание: Для каждого полоща шаг, решение в электронных плита была тщательно перемешивают (5 - 10 раз) с помощью пипетки.

  1. Случай 1: для оценки цитотоксичность анти -рак наркотиков
    1. Семя A549 клеток на электронные пластины как описано в разделе 2.
    2. Растворите в борьбе с раком наркотиков Доксорубицина гидрохлорид (DOX) в среде ячейки сначала. Медленно добавьте DOX клетки (конечная концентрация DOX-30 мкг/мл) с помощью пипетки. Запись CI, как описано в разделе 2.
      Примечание: Электронный тарелка была заново сразу же после завершения эксперимента. В этом случае, как DOX растворимый химическая регенерации электронных пластины после протокол относительно прост в обращении и дополнительные действия не требуются.
    3. Регенерация
      1. Примите вне электронной пластины, содержащие клетки от станции анализатор реального времени ячейки. Место используется электронный пластины в стерильных биобезопасности капюшон при комнатной температуре и смеси питательной среды, тщательно с помощью пипетки. Пипетка, все среды.
      2. Промойте электронные пластины с 200 мкл деионизированной водой в 3 раза при комнатной температуре.
      3. Дайджест оставшиеся ячейки на электронные пластины с трипсин 0.25% свежеприготовленных для 1-2 ч (200 мкл/а) в инкубаторе на 37 oC. По завершении пищеварение mix решение инкубации, 5 - 10 раз с помощью пипетки и пипетки все решения в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
      4. Промойте электронные пластины с 200 мкл этанола и 200 мкл воды, соответственно, следующим образом: деионизованной воды 2 раза, 100% этиловом спирте 2 раза; 75% этиловом спирте 2 раза; деионизированная вода 2 раза. Инверсия электронных пластину на стерильную марлю или папиросной бумаги декантировать оставшуюся воду при комнатной температуре.
      5. Ультрафиолетовой стерилизации регенерированный электронные пластины для 1-2 ч в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
        Примечание: Двойной объем всех решений для регенерации электронных пластины L8.
  2. Случай 2: поставки наркотиков с использованием мезопористых материалов.
    1. Использовать стержень как мезопористых кремнеземные материалы с средней поры 5.6 как матрицы доставки наркотиков, как сообщалось ранее20Нм.
      Примечание: Здесь, электронные пластины использовалась для контроля за наркотиками релиз эффект на клетки.
      1. Добавьте мезопористых материалов в инкубации решение каждой скважины электронных плит. Как кремнеземные материалы не растворимых и осадка в электронной пластины, промойте пластины следующим образом:
    2. Выполните шаги 3.1.3.1-3.1.3.3, как описано для случая 1.
    3. Промойте микросхемы с 200 мкл деионизированной водой один раз в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
    4. Промойте микросхемы с 200 мкл абсолютного этанола 2 раза при комнатной температуре.
    5. Один раз ополосните микросхемы с 200 мкл 75% этанола при комнатной температуре.
    6. 250 мкл 75% этанола в каждой скважине и печать электронных пластины с уплотнительной фильм при комнатной температуре.
    7. Спина на 114 x g на 2 мин и пустые электронные пластины. Инверсия электронных пластину на стерильную марлю или папиросной бумаги декантировать оставшуюся воду при комнатной температуре.
    8. Повторите шаг 3.2.5-3.2.7 раз.
    9. Ультрафиолетовой стерилизации регенерированный электронные пластины для 1-2 ч в капюшоне биобезопасности при комнатной температуре.
      Примечание: Двойной объем всех решения, когда полоскания L8 электронных плит.

4. Оценка эффекта регенерации

  1. Оптические характеристики регенерированный электронной поверхности
    1. Использование стальной ложку тщательно разбирать в нижней части инкубации также свежие и регенерации электронных пластина, которая содержит выстроил золото микроэлектродов. Ношение пластиковую перчатку, тщательно протирают микрочип содержащих часть от электронных пластину, используя стальные ложкой.
    2. Место обе части в центре стеклянных скольжениях микроскопа и собирать результирующий спектры комбинационного Раман Микроскоп оснащены CCD датчик21.
      Примечание: Спектрометр был оснащен 633 нм лазер и спектры был записан с интервалом 30 s лазерного воздействия на длине волны в диапазоне 500-3500 см-1. Оптических изображений были получены путем Раман микроскопа с помощью 10 x глаз объектив и 50 x цели. Рисунок 1A и Рисунок 1 c также были получены с помощью установленных Раман микроскопа аппарат.
    3. Оценки жизнеспособности прилагаемый клеток после поглощения анти рака наркотиков на свежий и регенерации электронных плит, использование конфокальный лазерный сканирующий микроскоп для мониторинга спонтанное флуоресценции DOX молекул поглощается A549.
      1. Для записи спонтанное флуоресценции всасывается DOX с помощью клетки (свежие и регенерации электронных пластины с A549 клетками), 63 X нефти объективные и 485 Нм как волны возбуждения.
  2. Электрохимическое поведение регенерированный электродов
    Примечание: Как ручной притворяться коммерческих электронных плиты является сложным и не подходит для оценки состояния поверхности электрические проверки, эффективность регенерации протокола была оценена с помощью обычных золото/стеклоуглерода электрода (СОО) как тест платформа, на которой была выполнена электрохимических импедансной спектроскопии (EIS). Диаметры Au электрода и GCE являются 3 мм. электрохимические данные были получены электрохимических анализатор с тремя электродами системой и сопротивление измерения проводились с помощью сигнала переменного тока (AC) 10 мВ амплитуда на широкий частотный диапазон от 100 кГц до 0,01 Гц.
    1. Перед измерением польский Au электрода и GCE к зеркальной поверхности с раствора глинозема на полировки тканью, после чего sonication в воде для удаления частиц.
    2. Так активировать Au электрод в 0,5 М H24. Получение данных EIS голые Au электрода и СОО в 10 мм раствор электролита KCl, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6] как описано22.
    3. Подготовьте раствор клеток A549 согласно 2.1.2 и 2.1.3. Падение 10 мкл суспензии клеток на поверхности электрода АС и сто. Инкубируйте Au электрода и GCE, изменение с ячейками в 37 oC инкубатор для 3 h. получить EIS данных АС электрода и GCE, изменение с ячейками 10 мм раствор электролита KCl, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6].
    4. Регенерировать электродов, используя протокол и мера EIS.
      1. Погружают электрод АС и GCE изменен с ячейками в трипсин 0.25% 0,5-2 ч. Промойте Au электрода и GCE мягко с водой 4 раза. Ополосните электроды мягко с абсолютного этанола, в 4 раза. Погружайте Au электрода и GCE в 75% этанола для ~ 5 минут сполосните фишки мягко с 75% этанола 4 раза.
      2. Получение данных EIS регенерированный Au электрода и СОО в раствор электролита KCl 10 мм, содержащие 1 мм K3[Fe(CN)6].

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Свойств поверхности золота микросхемы: регенерации процедуры, используемые в настоящем протоколе были изложены на рисунке 1. На рисунке 2 показан микроскопических поверхности фотографии свежей и обновленной электронной пластины оптический микроскоп. Как показано на рисунке 2A и Рисунок 2 c, микроскопические наблюдения свидетельствуют, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы кратко несколько доступных методов17,23,24,25,26 для регенерации микросхемы в таблице 1. В основном эти методы участвует относительно суровые экспериментальных условий для достижения полной регенерации чипы из-за присутствия сильной молекулы молекула взаимодействий как иммунный комплекс используется для чипов СРП. Однако эти суровые экспери...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа была поддержана национальной естественных наук фонд Китая (U1703118), проект, финансируемый приоритет академической программы развития из Цзянсу высшее образование учреждений (PAPD), Цзянсу Shuangchuang программы, открытые фонды государственного ключа Лаборатория для химиотерапии/Biosensing и хемометрике (2016015) и национальной лаборатории биомакромолекулах (2017kf05) и профессор Jiangsu Specially-Appointed проекта, Китай.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Крыса: Sprague-DawleyCharles RiverCat# 400
мышиный антикрысиный CD11b моноклональный (клон OX42)Bio-RadCat# MCA275Rпанорамирование: 1:1,000; Окрашивание: 1:500
Козий поликолональный анти-Iba1 AbcamCat# AB5076Окрашивание: 1:500
Кролик поликлональный анти-Ki67 Абкам Cat# AB15580Окрашивание: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Mouse 594InvitrogenCat# 11055Окрашивание: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488InvitrogenCat# A-21203Окрашивание: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647InvitrogenCat# A-31573Окрашивание: 1:500
Triton-X (моющее средство в окрашивании ICC)Thermo FisherCat# 28313
Гепаран сульфатГален Лабораторные принадлежностиCat# GAG-HS01
ГепаринСигма Cat# M3149
Пептон из сухих веществ молокаSigmaCat# P6838
TGF-β 2PeprotechCat# 100-35B
Мышиный ИЛ-34R& D SystemsCat# 5195-ML/CF
Холестерин овечьей шерстиAvanti Polar LipidsCat# 700000P
Коллаген IVCorning Cat# 354233
Олеиновая кислотаCayman Chemicals Кат# 90260
11(Z)Эйкозадиеновая (гондоевая) кислотаCayman Chemicals Cat# 20606
Кальцеин AM красительInvitrogenCat# C3100MP
Ethidium гомодимер-1InvitrogenCat# E1169
DNaseIWorthingtonCat# DPRFS
Percoll PLUSGE HealthcareCat# 17-5445-02
Trypsin SigmaCat# T9935
DMEM/F12GibcoCat# 21041-02
Пенициллин/СтрептомицинGibcoCat# 15140-122
ГлутаминGibcoCat# 25030-081
N-ацетил цистеин SigmaCat# A9165
ИнсулинSigmaCat# 16634
Апо-трансферрин SigmaCat# T1147
Селенит натрияSigmaCat# S-5261
DMEM (с высоким содержанием глюкозы)GibcoCat# 11960-044
Dapi Fluoromount-GSouthern BiotechCat# 0100-20 
Поли-D-лизин SigmaCat# A-003-E
Пластины Primaria VWRCat# 62406-456
Stock reagents  <стронг>восстановление  <сильный>Используемая концентрация<сильный>Хранение
Апо-трансферрин10 мг/мл в PBS 1:100-20&d; C
N-ацетилцистеин5 мг/мл в H2O 1:1,000-20&d; C
Селенит натрия2,5 мг/мл в H2O 1:25,000-20° C
Collagen IV200 μ г/мл в PBS 1:100-80° C
TGF-b220 μ г/мл в PBS 1:10,000-20&d; C
ИЛ-34100 μ г/мл в PBS 1:1,000-80&d; C
Холестерин овечьей шерсти1,5 мг/мл в 100% этаноле1:1,000-20&d; C
Гепарана сульфат1 мг/мл в H2O1:1,000-20° C
Олеиновая кислота/Гондовая кислотаГондоевая: 0,001 мг/мл; Олеиновая: 0,1 мг/мл в 100% этаноле;1:1,000-20&d; C
Гепарин50 мг/мл в PBS 1:100-20&d; C
Solutions  Recipe  Комментарии
Perfusion Buffer50 μ г/мл гепарина в DPBS++ (PBS с Ca++ и Mg+ +)Использовать при ледяном
Douncing Buffer200 μ L 0,4% DNaseI в 50 мл DPBS++Используйте при ледяном
панировочном буфере2 мг/мл пептона из сухих веществ молока в DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)DMEM/F12, содержащем 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкм; г/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина, 5 мкм; г/мл N-ацетилцистеина, 5 мкм; г/мл инсулина, 100 мкм; г/мл апотрансферрина и 100 нг/мл селенитанатрия Используйте ледяной MGM для очистки микроглии от иммнопанирующей посуды.
Коллагеновое покрытие для внутривенных вливанийMGM, содержащее 2 μ г/мл коллагена для внутривенного введения
буфера для разделения миелина9 мл Percoll PLUS, 1 мл 10x PBS без Ca++ и Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2Хорошо перемешать после добавления  CaCl2 и MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterolcontaining growth media (TIC) MGM, содержащий человеческий 2 нг/мл TGF-b2, 100 нг/мл мышиный IL-34, 1,5 мкм; г/мл холестерина овечьей шерсти, 10 мкм; г/мл гепарансульфата, 0,1 г/мкм; г/мл олеиновой кислоты и 0,001 мкм; г/мл гондевой кислотыОбязательно добавляйте холестерин в среды, подогретые до 37 °°; C и не прибавлять более 1,5 мкм; г/мл или он выпадет в осадок. Не фильтруйте холестеринсодержащие среды. Уравновешивайте среду TIC с 10% CO<суб>2 в течение 30–1 часа перед добавлением в клетки для обеспечения оптимального pH.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792(2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748(2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Trypsin DigestionEthanol RinseSpinning StepElectronic Plate RegenerationCell Proliferation AssayCytotoxicity EvaluationElectrochemical Impedance SpectroscopyConfocal Microscopy

Похожие статьи