Методическая статья

RGB и спектральные корень изображений для растений фенотипа и физиологических исследований: экспериментальная установка и визуализации протоколы

17.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56251

⸱

8 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Agronomy, Department of Crop Sciences, University of Natural Resources and Life Sciences, 2Carinthian Tech Research AG, High Tech Campus Villach, 3Computational Science Center, University of Vienna, 4Simulationswerkstatt

В этой статье

Краткое содержание

Экспериментальный протокол представлен для оценки почвы выращенных растений корневой системы с RGB и гиперспектральных изображений. Сочетание RGB изображения время серии с chemometric информацией из гиперспектрального сканирует оптимизирует понимание динамики корня растений.

Аннотация

Лучшего понимания динамики корня растений имеет важное значение для повышения эффективности использования ресурсов сельскохозяйственных систем и увеличить сопротивление сортов сельскохозяйственных культур против экологическим стрессам. Экспериментальный протокол представляется для RGB и гиперспектральных изображений корневых систем. Этот подход использует rhizoboxes, где растения растут в естественной почве над более длинним временем соблюдать полностью развитых корневых систем. Экспериментальные параметры являются примером для оценки rhizobox растений под водный стресс и изучение роли корней. RGB изображений установки описан для дешевой и быстрой квантификации корень развития с течением времени. Гиперспектральных изображений улучшает сегментации корень от фона почвы по сравнению с порог цвета RGB. Особая сила гиперспектральных изображений является приобретение chemometric информацию о системе корень почвы для функционального понимания. Это проявляется с высоким разрешением воды содержание сопоставления. Спектральная томография, однако, является более сложным в захвата изображений, обработки и анализа, по сравнению с подходом RGB. Сочетание обоих методов можно оптимизировать всеобъемлющую оценку корневой системы. Примеры приложений, интеграции, корень и трава черты даны в контексте фенотипа и завод физиологические исследования растений. Дальнейшее совершенствование корневой изображений могут быть получены путем оптимизации качества изображения RGB с лучшего освещения, используя различные источники света и выдвижением методов анализа изображений для выведения на свойства корня зоны от спектральных данных.

Введение

Корни растений, таких как хранение предусматривают несколько основных функций усваивает, Анкоридж наземные растения в почве и поглощение и транспортировки воды и питательных веществ1. С эволюционной точки зрения формирования оси корня считается основным условием для происхождение наземных растений2. Несмотря на эту важную роль исторически корни занимали лишь маргинальное положение в биологических исследованиях. В более поздние времена однако, растет научный интерес в корневой системы растений как свидетельствует на рисунке 1.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Актуальность исследований корня растений наук.
Количество корневых соответствующих исследований в процентах всех опубликованных завод исследований в журналах SCI за последние десятилетия. Результат от Scopus, используя ключевые слова «завод» и «завод и корень» поиска. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Две основные причины можно предположить, чтобы лежат в основе последних достижений в исследованиях корня. Во-первых, наземной растительности подвергается более частых экологического стресса в результате глобальных изменений3. В контексте производства сельскохозяйственных культур предполагается, что во всем мире около 30% сельскохозяйственных площадей ограничены воды и фосфор4,5. Снижение стресса урожайности сельскохозяйственных культур являются главной причиной значительную доходность пробелы, которые оцениваются глобально в ниже 50% потенциальной продуктивности для неорошаемых агроэкосистемах6. Помимо наличия ограниченных ресурсов это также связано с бедных ресурсов эффективность использования, т.е. недостаточный потенциал для использования имеющихся ресурсов7завода. Это приводит к потерям мобильных ресурсов например, нитратов, которое может отрицательно повлиять на другие экосистемы. Эффективность использования текущей глобальной азота например оценивается в 47%8. Ресурсов лучше использовать эффективность посредством совершенствования методов управления и сортов поэтому большое значение как для устойчивого роста сельскохозяйственных мероприятий, а также экологической устойчивости. В этом контексте растений корни считаются ключевыми мишенью для улучшения сельскохозяйственных культур и выращивания сельскохозяйственных культур систем9,10.

Второй важный фон для бронирование интерес к корням растений — технологического прогресса в методах измерения. Корень методы давно были ограничены по две основные проблемы: для измерения корней растений, растущих в почве, они должны были быть изолированы для количественной оценки, главным образом путем промывания11, таким образом нарушая архитектурной расположение корневого осей. In-situ корень наблюдение с использованием раскопки методами, тем самым сохраняя естественный расположения корней в почве, были использованы для Ботаническое описание12. Еще они очень много времени и таким образом не соответствуют требованиям пропускной способности анализа сравнительной структурно функциональной корневой системы. С другой стороны методы высокой пропускной способностью для корневой архитектуры измерения были основном делается на искусственных средств массовой информации и для рассады растений13 где экстраполяции для окружающей среды естественного роста растений является сомнительной14.

Недавний бум корень исследований тесно связана с заранее в imaging методы15. Imaging подходы в корень исследования можно примерно сгруппировать три типа. Во-первых есть высокое разрешение 3D методов, таких как КТ и МРТ-16. Эти методы являются наиболее подходящими для исследования процессов взаимодействия корней растений с почвой, такие, как засуха индуцированной ксилема эмболии17. Обычно они применяются для сравнительно небольших образцов, где они позволяют подробные замечания. В18приводится сравнение КТ и МРТ для по-разному размера кастрюли и тонкой корень изображений. Во-вторых есть высок объём тепловизионные методы19,20. Эти методы являются главным образом на основе общих 2D RGB изображений корней, растущих на искусственных СМИ (гель, прорастание бумага), где высокая контрастность позволяет сравнительно просто диссекция между корнями и фон. Они подходят для высокой пропускной способности сравнения среди Рассада корень черты различных культур генотипов под стандартизированных искусственный рост условия13. Между этими двумя подходами являются rhizobox методы: они используют 2D изображений корни растущих в почве в течение длительного периода времени и средней пропускной способности21,22. Последние вызов (2D) корня изображений является захват также показатели корень функциональность помимо описания структуры23.

В настоящем документе мы представляем экспериментальные протоколы для изображений rhizobox рост корневой системы, используя (i дешевый и простой заказ RGB изображения установки и (ii более сложные визуализации установки НДК. Пример результатов, полученных от этих двух настроек отображаются и обсуждаются в контексте завод фенотипа и физиологические исследования растений.

Протокол

1. Ризобоксы для выращивания растений

ПРИМЕЧАНИЕ: В данной экспериментальной системе для выращивания растений с целью визуализации корней используются ризобоксы. Сначала описывается конструкция боксов и используемый субстрат, а затем приводятся подробные сведения о процедуре их заполнения.

  1. Конструирование ризобоксов
    1. Изготовьте ризобоксы (Рисунок 2), состоящие из задней панели и боковых рам из серого ПВХ толщиной 15 мм. Используйте короб размером 300 мм x 1000 мм. Для переднего окна используйте минеральное стекло толщиной 6 мм, которое крепится к ПВХ-раме с помощью металлических направляющих, привинченных к боковым стенкам.
    2. Просверлите три отверстия в нижней раме для отвода избытка воды. При необходимости эти отверстия можно закрыть пластиковыми пробками.
    3. Перед заполнением отрегулируйте внутренний диаметр ризобокса (в пределах от 10 мм до 30 мм), вставив листы многостенного поликарбоната. Для большинства культур рекомендуется оставлять внутреннее пространство 10 мм, чтобы уменьшить общий вес системы (вес ризобокса без почвы составляет 13,2 kg).

Схема конструкции стенки с ПВХ, стеклом, многослойными листами; схема дренажа; указаны размеры.
Рисунок 2: Экспериментальная система ризобокса и её компоненты.
На рисунке слева показаны размеры ризобокса, а на рисунке справа — его отдельные компоненты: серая задняя панель из ПВХ с боковой рамой, переднее минеральное стекло, многослойные листы для изменения внутреннего диаметра и металлические уголки для крепления переднего стекла к заднему отсеку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Субстрат
    1. Заполните ризобоксы полевой почвой (в данном эксперименте: алево-суглинистый верхний слой известкового чернозема), просеянной через сито с размером ячеек 2 mm.
    2. Откройте ризобоксы для заполнения субстрата во внутреннюю камеру (задняя панель с боковыми рамками) в горизонтальном положении, используя предварительно увлажненный субстрат. Заполняйте горизонтально, чтобы избежать расслоения и сегрегации мелких и крупных частиц, которые возникают при заполнении в вертикальном положении путем засыпания субстрата через верхнее отверстие.
    3. Увлажните субстрат перед заполнением. В зависимости от типа субстрата (особенно от содержания ила и глины), не превышайте влажность 0.12-0.18 cm3*cm-3, чтобы избежать размазывания и деградации структуры. Разницу между начальной и целевой влажностью добавьте после заполнения ризобоксов субстратом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заполнение (воздушно-сухим) субстратом с последующим добавлением всего объема воды не рекомендуется, так как это может привести к сильной осадке субстрата и образованию крупных трещин.
  2. Пошаговый пример заполнения
    1. Определите целевое содержание воды. В данном случае оно изначально установлено на уровне 80% доступной для растений воды (PAW), при которой растения не испытывают дефицита влаги.
    2. Определите полевую влагоемкость (FC) и точку постоянного увядания (PWP) субстрата. В данном случае определите FC, используя ПВХ-трубку эквивалентной высоты (100 cm), как у ризобоксов.
      1. Закройте трубку снизу пробкой с небольшими дренажными отверстиями, добавьте 1 cm гравия, чтобы предотвратить закупорку отверстий более мелкими частицами субстрата, и заполните субстратом до достижения той же объемной плотности, что и для ризобоксов (1.3 g cm-3).
      2. Насытите трубку водой до начала дренажа и оставьте на два дня для уравновешивания (полученное содержание воды по определению эквивалентно полевой влагоемкости), прикрыв верхнее отверстие пищевой пленкой для предотвращения испарения. Значение полевой влагоемкости, достигнутое для почвы в этом эксперименте, составило 0.357 cm3 cm-3.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание воды в точке PWP должно быть известно заранее из стандартных методов физики почв (например, измерений на мембранной установке24) или из педотрансферных функций на основе гранулометрического состава25. Для использованной здесь почвы оно равно 0.12 cm3 cm-3.
      3. При измерении FC с помощью мембранной экстракции берите содержание воды при матричном потенциале h=-100 hPa, а не h=-330 hPa, чтобы это соответствовало геометрии ризобокса (высота 100 cm = 100 hPa).
      4. Рассчитайте содержание воды (WC) при 80% PAW: WC (cm3 cm-3) = 0.80 (FC-PWP) + PWP. Для гидравлических пределов используемой здесь почвы это дает объемное содержание воды при 80% PAW равное 0.31 cm3 cm-3.
      5. Рассчитайте количество воды для объема ризобокса 2850 cm3 (ширина 30 cm, внутреннее пространство 1 cm, высота 95 cm, при этом верхние 5 cm остаются свободными от субстрата для полива). Это дает объем воды 883.5 cm3, что равно 883.5 g при плотности воды 1.0 g cm-3 при 20 °C.
    3. Определите объемную плотность (db) для заполнения ризобоксов. В данном случае она установлена на уровне 1.3 g cm-3, что соответствует значениям, обычно встречающимся в сельскохозяйственных полевых почвах. Количество сухого субстрата, необходимого для заполнения объема ризобокса 2850 cm3 при данной db, составляет 3705 g сухой почвы.
    4. Предварительно увлажните сухую почву до гравиметрической влажности 0.108 g g-1 (что соответствует объемной влажности 0.14 cm3 cm-3), добавив 400 g воды на 3705 g сухой почвы, и осторожно перемешайте для получения однородного распределения воды. Вручную разбейте крупные агрегаты, чтобы размер частиц был ≤ 2 mm.
    5. Заполните предварительно увлажненную почву в открытые ризобоксы и осторожно уплотните ее, используя полистирольный лист (30 x 10 x 1.5 cm), чтобы покрыть внутренний объем бокса, тем самым обеспечив однородную db 1.3 g cm-3.
    6. Добавьте оставшееся количество воды (483.2 g) для достижения целевого содержания воды 0.31 cm3 cm-3, распыляя ее на поверхность из пульверизатора. Обеспечьте малый размер капель, чтобы избежать деградации структуры поверхности и добиться однородного увлажнения. Во время распыления держите бокс на весах, чтобы контролировать количество воды, фактически добавленной в субстрат.
    7. Дайте воде перераспределиться в течение 10 минут, затем прижмите стекло к поверхности и зафиксируйте его боковыми металлическими направляющими. Средний конечный вес ризобоксов с увлажненным субстратом составил 17818 ± 68 g (13230 g вес ризобокса + 3705 g сухой почвы + 883 g воды).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Однородное содержание воды, внесенное в горизонтальные боксы, перераспределится, когда боксы будут установлены в конечное положение, в соответствии с возникающим градиентом потенциала. Это физический процесс во всех горшках для выращивания растений в зависимости от их геометрии (высоты), и экспериментаторы должны учитывать гидравлику своих горшков26.

2. Подготовка климатической камеры

  1. Оснастите климатическую камеру (Рисунок 3>) 8 светодиодными лампами, обеспечивающими однородное освещение интенсивностью 450 μmol m-2 s-1 со спектральными пиками на 440 (синий) и 660 (красный) нм для оптимального роста растений.

Схема эксперимента по стрессу растений; установка с LED-освещением, метеостанция, график устьичной проводимости и дефицита влажности.
Рисунок 3: Климатическая камера с ризобоксами для эксперимента по стрессу.
(A) Вид слева на всю камеру с LED-освещением, метеостанцией и ПК (используемым здесь для регистрации данных гигрометров листьев); вид справа с увеличенным изображением металлического каркаса, удерживающего ризобоксы под наклоном 45 °, и деревянных пластин, используемых для защиты стеклянного окна ризобокса от света. (B) Эксперимент по стрессу сахарной свеклы, объединяющий четыре стадии с воздействием стресса вследствие различного атмосферного спроса (высокий/низкий) и доступности почвенной влаги (высокая/низкая). Зеленые столбцы средней устьичной проводимости указывают на стрессовую реакцию растений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Установите параметры окружающей среды в соответствии с потребностями растений и условиями эксперимента. В данном случае используйте световой режим с 14 часами света и 10 часами темноты. В период укоренения растений и до начала стрессовых воздействий поддерживайте температуру 20° C днем и 15° C ночью, а относительную влажность воздуха на уровне 50 ± 8%.
  2. Разместите ризобоксы под наклоном 45°, используя подходящий металлический каркас. Это обеспечит максимальный рост корней по направлению к стеклянной поверхности за счет гравитропизма.
  3. Накройте стеклянное окно деревянной пластиной, чтобы корневая зона находилась в темноте и предотвратить рост водорослей из-за проникновения света через стеклянную поверхность.

3. Пример настройки и обработки сахарной свеклы

  1. Проведите предварительное проращивание семян сахарной свеклы на влажной фильтровальной бумаге в течение трех дней при 20 °C в инкубаторе до появления корешка. Это обеспечит посев жизнеспособными растениями.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительное проращивание не требуется для растений с высокой всхожестью, что позволяет избежать риска повреждения корешка при посеве. Однако для семян сахарной свеклы с толстым перикарпием риск наличия нежизнеспособных семян высок, и предварительное проращивание значительно ускоряет появление корешка по сравнению с прямым посевом в почву.
  2. С помощью отвертки проделайте небольшое отверстие глубиной около 1.5 cm в центре ризобокса; используя пинцет, поместите в него одно семя корешком вниз и вплотную к стеклянному окну (это улучшит начальную видимость), затем осторожно засыпьте его почвой.
  3. Нанесите сверху на почву слой мелкого гравия (2-4 mm) толщиной 0.5 cm, чтобы защитить почвенные агрегаты от разрушения при поливе и уменьшить потери на испарение. Чтобы облегчить всходы, оставьте поверхность почвы без гравия в месте, где было расположено семя.
  4. Добавьте 10 g воды для улучшения укоренения.
  5. В период укоренения и раннего роста, до начала экспериментальных стрессовых воздействий, поливайте ризобоксы каждые 2-4 дня, чтобы поддерживать начальное содержание влаги на уровне 80% PAW.
    1. Определяйте необходимое количество поливной воды путем взвешивания ризобоксов и добавления воды до достижения исходного веса каждого отдельного бокса. При ручном поливе используйте пипетку, чтобы избежать разрушения структуры поверхности при поливе.
  6. Разместите ризобоксы в климатической камере согласно установленному плану. Описанный здесь протокол основан на эксперименте с шестью сортами сахарной свеклы в пяти повторностях по схеме полной рандомизации (CRD).
    1. Переставляйте ризобоксы каждый раз, когда вынимаете их из металлического держателя для взвешивания и полива. Это позволит избежать влияния остаточной неоднородности (освещенности) внутри климатической камеры.
  7. Определите время начала стрессовых воздействий и тип стресса. Здесь используются следующие параметры (Рисунок 4).
    1. Начните измерения на стадии BBCH 15 (развернуто пять листьев), когда корни охватывают около 75% глубины ризобокса, а листовой аппарат достаточно развит для проведения измерений на листьях. Удерживайте каждую стадию не менее трех дней, чтобы обеспечить адаптацию к новым условиям, и проведите измерения.
    2. Для контрольных наблюдений (без стресса) сохраняйте исходные настройки с оптимальной влажностью почвы (80% PAW) и условиями окружающей среды (температура 20° C/15° C, rH 50 ± 8%), что обеспечивает дневной дефицит давления пара (VPD) 1.28 ± 0.1 kPa (см. Рисунок 3 C).
    3. Увеличьте атмосферный спрос до дневного VPD 2.45 ± 0.4 kPa, повысив температуру до 27°C/20°C и снизив rH до 35%, сохраняя при этом влажность почвы на уровне 80% PAW.
    4. Затем доведите ризобоксы до состояния высыхания до 40% PAW, что эквивалентно влагосодержанию 0.215 cm3 cm-3, прекратив полив. Восстановите исходные условия окружающей среды с низким атмосферным спросом (VPD 1.28 kPa).
    5. Совместите стрессовые факторы, увеличив атмосферный спрос до VPD 2.45 kPa и поддерживая влажность почвы на уровне 40% PAW.

4. Методы визуализации корней

  1. Комбинируйте методы визуализации, чтобы использовать соответствующие преимущества каждого в зависимости от целевой информации.
    1. Применяйте RGB-визуализацию в VIS-диапазоне для отслеживания роста, архитектуры и морфологии корней с течением времени, что подразумевает необходимость частых измерений. Преимущества RGB-визуализации: (i) низкая стоимость, (ii) высокая скорость получения изображений, (iii) низкие требования к объему памяти жесткого диска (размер изображения: 48 MB) и (iv) высокое разрешение (3648 x 5472 пикселей).
    2. Используйте гиперспектральную визуализацию (HSI) в NIR-диапазоне, когда требуются хемометрические характеристики корня и почвы. Преимуществами являются (i) наличие спектральных признаков для сегментации корней на фоне почвы и (ii) доступ к физико-химическим свойствам системы (например, влажность почвы, возраст корня). Недостатками являются (i) большее время сканирования (около 16 минут на один ризобокс), (ii) большой размер наборов данных (13.7 GB на одно изображение ризобокса), (iii) более низкое разрешение NIR-камеры (320 x 256 пикселей) и (iv) большая сложность анализа данных.
  2. RGB-визуализация корней
    1. Используйте камеру-бокс (Рисунок 4), который экранирует от внешнего света и фиксирует положение камеры; он представляет собой металлический каркас шириной 1 м и высотой 1 м с боковыми стенками, обклеенными оргалитом. Спереди закрепите камеру в двух положениях на расстоянии 80 cm от ризобокса.
      1. Прикрепите измерительную ленту к раме ризобокса с помощью прозрачной клейкой ленты и поместите ризобокс в держатель камер-бокса.
      2. Осветите ризобокс с помощью четырех люминесцентных ламп мощностью 24 W, закрепленных на расстоянии 80 cm от ризобокса. Также установите четыре УФ-лампы мощностью 15 W на расстоянии 20 cm от ризобокса в качестве альтернативного освещения, использующего автофлуоресценцию корней, в случае низкого контраста между корнем и (светлым) фоном субстрата.
      3. Сделайте два снимка (верхнее и нижнее положение), чтобы охватить верхнюю и нижнюю половины ризобокса с перекрытием около 3 cm.
    2. Получите RGB-изображения с помощью цифровой однообъективной зеркальной камеры, которая фиксируется быстросъемными пластинами в соответствующих положениях камер-бокса.
      1. При использовании люминесцентных ламп применяйте следующие настройки. Адаптируйте эти примеры настроек под любые изменения в габаритах и освещении, а также под модель камеры.
        1. Отключите автофокус и стабилизатор на объективе камеры. Переведите камеру в ручной режим.
        2. Установите значение ISO на 500. Установите выдержку на 13. Установите диафрагму на 5.6.
        3. Отключите блокировку зеркала. Установите баланс белого в режим Auto White Balance.
      2. Для освещения УФ-лампами используйте следующие настройки:
        1. Отключите автофокус и стабилизатор на объективе камеры. Переведите камеру в ручной режим.
        2. Установите значение ISO на 1000. Установите выдержку на 13. Установите диафрагму на 5.6.
        3. Отключите блокировку зеркала. Установите баланс белого в режим Fluorescence.
    3. Объедините RGB-изображения верхней и нижней частей ризобокса в один снимок в фоторедакторе (например, Adobe Photoshop). Используйте измерительную ленту на боковой раме ризобоксов и контролируйте перекрывающиеся объекты (элементы корня и почвы).
      1. Скопируйте два отдельных изображения, каждое размером 3648 x 5472 пикселей, в новый файл размером 3648 x 10944 пикселей с белым фоном.
      2. Снизьте непрозрачность одного слоя до 60% и совместите перекрывающиеся части изображений (измерительную ленту, объекты). После этого верните непрозрачность слоя до 100%.
      3. Ориентируясь по линейке на изображении, добавьте две красные линии длиной ровно 1 cm в верхней части снимка там, где нет корней. Эти линии будут использоваться позже при анализе изображений для масштабирования снимка до корректных линейных размеров.
      4. Объедините все слои и удалите части изображения за пределами окна, заполненного почвой, с помощью инструмента обрезки.
      5. Сохраните изображение в формате tiff для последующего анализа.
      6. Для снимков с УФ-освещением перед сохранением переведите цвета в градации серого, используя панель инструментов Adjustments-Black & White и выбрав предустановленный фильтр High Contrast Blue.
    4. Для сегментации корней на фоне почвы, а также для количественной оценки интересующих признаков корня (например, длины, поверхности, диаметра, ветвления), используйте любое программное обеспечение для анализа корней (см. www.plant-image-analysis.org для ознакомления с доступными инструментами). В данном случае используется WinRhizo.
      1. Откройте tiff-изображение ризобокса в программе.
      2. Откалибруйте масштаб длины изображения, используя добавивленные на снимок калибровочные отрезки.
      3. В меню Analysis выберите Based on Color, затем выберите Root & Background Distinction.
      4. Создайте калибровочный файл с цветовыми классами, соответствующими корням и почве (фону). Для используемых здесь примеров изображений (см. Рисунок 8>) определены три цветовых класса корней (старые боковые, молодые боковые, стержневой корень) и три цветовых класса почвы.
      5. Для изображений в градациях серого (УФ-освещение) выберите в меню Root & Background Distinction пункты (i) Based on grey levels и (ii) Pale Root on Black Background и используйте локальный порог интенсивности Лагарда для сегментации.
      6. Откройте файл данных для сохранения результатов.
      7. Запустите анализ и затем проверьте, нет ли ошибочно определенных областей (например, по краям). В этом случае определите область исключения и перезапустите анализ. Для неклассифицированных корней добавьте дополнительные цветовые классы и перезапустите анализ. Для элементов, ошибочно классифицированных как корни, активируйте или усильте параметры фильтрации Debris & Rough Edges.

Установка для визуализации растений с УФ- и галогенными лампами; держатель ризобокса, крепления камер для анализа корней и кроны.
Рисунок 4: Камера для получения RGB-изображений ризобоксов.
Слева представлен вид передней стороны, где закреплены ризобоксы для съемки с источниками света внутри; справа — вид задней стороны, где установлена камера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Гиперспектральная визуализация корней
    1. Настройка оборудования
      1. Используйте систему гиперспектральной визуализации корней (Рисунок 5), состоящую из (i) монохромной БИК-камеры с 14-битным разрешением и термоэлектрическим охлаждением, спектральным диапазоном от 900 nm до 1700 nm, разрешением 320 x 256 пикселей и частотой кадров 100 Hz, и (ii) спектрографа с спектральным диапазоном от 900 nm до 2500 nm и спектральным разрешением 3.6 nm. Расположите галогенный линейный источник освещения (четыре галогенных прожектора по 50 W) в геометрии 45°/-45°. Установите датчик изображения на двухкоординатную систему позиционирования. Окно сканирования имеет размер 240 x 1000 mm, то есть по 30 mm с каждого края ризобокса не попадают в область изображения.
      2. Управляйте системой с помощью скрипта Matlab для (i) получения эталонов белого и темного, (ii) установки времени интеграции камеры, (iii) выбора пространственного разрешения (размер пикселя 0.1 mm; размер пикселя 1.0 mm) и спектрального разрешения (все 222 спектральные полосы с разрешением 3.6 nm; сглаженный спектр с 54 полосами и разрешением 14.8 nm), а также (iv) определения области сканирования ризобокса.
      3. Сохраняйте изображения в виде SIF-файлов. Чтобы избежать проблем при сохранении больших файлов, разделяйте каждый проход сканирования изображения (9 проходов на ризобокс) на четыре сегмента (три длиной по 300 mm, один длиной 100 mm) и сохраняйте их отдельно с уникальным именем файла, состоящим из номера прохода (от 1 до 9) и части (от 1 до 4), а также даты и времени (ГГГГ.ММ.ДД ЧЧ:ММ:СС). Сканирование одного ризобокса целиком требует 13.7 GB места на жестком диске.
    2. Получение и анализ изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На Рисунке 6 показаны этапы получения, сегментации и анализа изображений.
      1. Получение изображения включает выбор настроек камеры для обеспечения оптимального качества изображения и определение параметров сканирования.
        1. Определите время интеграции камеры для сканирования ризобокса и эталона белого в программном обеспечении камеры.
          1. Откройте графический интерфейс визуализации и переместите камеру в позицию ризобокса, где присутствуют корни.
          2. Отрегулируйте время интеграции камеры, нацелившись на светлый объект (т. е. корень), таким образом, чтобы на гистограмме, отображаемой программным обеспечением, использовалось примерно 85% полного динамического диапазона камеры. Повторите процедуру для эталона белого, переместив систему позиционирования камеры на эталон белого. Затем закройте программное обеспечение камеры.
        2. Откройте графический интерфейс визуализации Matlab и выполните все настройки для текущего сканирования ризобокса. Для данных, представленных здесь, используйте следующие настройки:
          Время интеграции эталона белого: 1000
          Время интеграции ризобокса: 4000
          Спектральное разрешение: Полное разрешение (т. е. 222 узкополосные спектральные полосы)
          Полное пространственное разрешение (размер пикселя 0.1 mm)
          1. Получайте эталоны темного и белого перед каждым сеансом визуализации, например, раз в день. Эталон темного представляет шум камеры, а эталон белого дает максимальную отражательную способность. Эти данные необходимы для нормализации изображения при предварительной обработке.
          2. Определите, сканировать ли весь ризобокс или только его часть. В данном случае визуализируются ризобоксы целиком. Затем запустите сканирование.
      2. Обработайте изображение с помощью скрипта Matlab. Операции, выполняемые скриптом, описаны ниже.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Скрипты в настоящее время представлены в недокументированной версии и могут быть получены у автора-корреспондента. После надлежащего документирования они будут доступны для скачивания на веб-сайте учреждения автора-корреспондента (www.dnw.boku.ac.at/pb/).
        1. Сформируйте полный проход изображения из центра ризобокса (содержащего корни), объединив четыре части прохода.
          ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не требуется и не рекомендуется использовать спектральный образ всего ризобокса (т. е. всех 9 проходов), так как размер файла сделает каждый этап вычислений в Matlab очень трудоемким по времени, а информации, содержащейся в одном центральном проходе, достаточно для первых этапов анализа изображения.
        2. Нормализуйте изображение, используя полученные эталоны темного и белого и учитывая различные времена интеграции для эталона белого и сканирования ризобокса, которые автоматически сохраняются в файл во время сканирования.
        3. При необходимости примените фильтр сглаживания для удаления шума с изображения. Скрипт в настоящее время предлагает медианную фильтрацию с ядром 3x3 и коррекцию многократного рассеяния. Для представленной здесь оценки изображения фильтры не применялись.
        4. Выведите изображение на всех записанных спектральных полосах для первичного ознакомления и выберите длину волны для отображения с целью выделения областей интереса (см. сегментация изображения).
      3. Выполните сегментацию корней и почвенного фона в отдельном скрипте, следуя этим шагам:
        1. Выберите области интереса (ROI) для корня и почвы, чтобы найти спектральные признаки для сегментации. Используйте инструмент свободного выделения, чтобы отметить ROI на изображении, отображаемом на длине волны, которая ранее была определена как обеспечивающая хороший контраст между корнями и почвой. В данном случае используйте три ROI на корне (старые и молодые боковые корни, стержневой корень) и два ROI в почве (сухая и влажная области).
        2. Отобразите прямоугольник с выбранными ROI, а остальную часть в виде черной маски, и визуализируйте изображение выбранных ROI на всех длинах волн.
        3. Удалите из матрицы изображения все строки, содержащие пиксели со спектральной интенсивностью = 0 (черные пиксели).
        4. Объедините ROI корня и почвы в одну матрицу переднего плана (корень) и одну матрицу фона (почва) для сегментации.
        5. Найдите спектральные полосы (интенсивность отдельных спектров или спектральные отношения), обеспечивающие наилучшее разделение между передним планом корня и фоном почвы27. Количественно оцените различие между полученными гистограммами пикселей для корня и почвы, используя расстояние Бхаттачария28.
        6. Выберите пороговое значение интенсивности, разделяющее гистограммы.
        7. Создайте бинарное изображение, применив выбранный порог к исходному изображению. Это устанавливает все пиксели с интенсивностью ниже порога в ноль, а с интенсивностью выше порога — в единицу (выполняется скриптом автоматически).
        8. Сохраните бинарное изображение в виде tiff-файла.
      4. Откройте бинарное изображение и проанализируйте признаки корней. В меню Root & Background Distinction выберите (i) Based on grey levels и (ii) Pale Root on Black Background, а также используйте global intensity threshold (изображение уже бинаризировано).
      5. Для картирования содержания воды на основе гиперспектральных данных получите калибровочный набор данных и примените калибровочное уравнение к изображению ризобокса.
        1. Разделите ризобокс на отсеки по 5 cm с помощью полистирольных листов, чтобы заполнить их почвой (тот же субстрат и db, что и в эксперименте) с различным содержанием воды (Рисунок 8).
        2. Рассчитайте соответствующие количества воды для смешивания с почвой и заполните отсеки (та же процедура, что описана в пункте 1.3 для всего ризобокса).
        3. Просканируйте калибровочный ризобокс с теми же настройками, которые использовались для засаженных ризобоксов.
        4. Выполните следующие шаги с помощью скрипта:
          1. Объедините четыре части прохода из калибровочного бокса с водой в один проход и нормализуйте его с помощью эталонов темного и белого.
          2. Выделите прямоугольные области в каждом отсеке с разным содержанием воды и сохраните их в структурном массиве.
          3. Определите спектральный признак, который наилучшим образом разделяет отсеки с разным содержанием воды. Это делается с помощью алгоритма поиска глобального максимума разностей интенсивностей между средними спектрами соседних уровней содержания воды.
          4. Рассчитайте среднее значение спектральной интенсивности для этого признака для каждого отсека с содержанием воды в калибровочном ризобоксе.
          5. Постройте уравнение регрессии между непосредственно измеренным содержанием воды и соответствующим спектральным квантификатором.
          6. Примените уравнение регрессии к каждому пикселю на изображении ризобокса, не классифицированному как корень, для спектрального признака (полосы), определенного выше как наиболее точно связанный с содержанием воды.

Схема спектрографа для оптического анализа; галогенное освещение, ризобокс, блок управления питанием и перемещением.
Рисунок 5: Гиперспектральный сканер корней.
Указаны основные компоненты сканера. На малом изображении показана камера во время съемки ризобокса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Схема гиперспектрального анализа изображений: установка для получения данных, сегментация, картирование воды, хемометрический анализ.
Рисунок 6: Этапы гиперспектральной визуализации корней.
Гиперспектральная визуализация корней состоит из трех основных этапов: (i) получение изображений, (ii) сегментация изображений и (iii) анализ спектральных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эксперимент по прорастанию семян; градиенты влажности на полистироле и бумаге для проращивания.
Рисунок 7: Ризобокс для калибровки воды.
Ризобокс содержит отсеки с субстратом с разным содержанием воды, разделенные листами полистирола. Бумага для проращивания в сухих отсеках предотвращает вымывание частиц почвы в соседние отсеки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Примеры применения

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественные данные о корнях применяются в контексте фенотипирования растений (сравнения сортов) и для физиологических исследований растений. Ниже приведены данные о надземной части растений для иллюстрации этих случаев.

  1. Площадь листьев: Измеряйте площадь листьев неразрушающим методом на выбранных стадиях эксперимента, используя длину и ширину листьев в качестве косвенных показателей. В качестве альтернативы можно использовать изображения растительного покрова29.
    1. В конце эксперимента измерьте длину и ширину листьев, а также площадь срезанных листьев с помощью измерителя площади листьев. Калибруйте неразрушающий метод, применяя уравнение регрессии к полученным парам данных.
  2. Сухое вещество: В конце эксперимента измерьте массу надземного сухого вещества, срезав растения ножницами и высушив их в сушильном шкафу при 105 °C в течение 24 часов.
  3. Устьичная проводимость: Измеряйте устьичную проводимость с помощью листового порометра. Перед измерением выдержите прибор в климатической камере не менее одного часа, чтобы датчики уравновесились с условиями окружающей среды, и калибруйте прибор при каждом изменении параметров в климатической камере. Выполняйте измерения как минимум на трех листьях каждого растения.

Результаты

Представлены примеры результатов сегментации корней на основе RGB- и HS-визуализации. Для спектральной визуализации приведен пример картирования воды с высоким разрешением. В завершение показаны результаты, демонстрирующие научный контекст применения данных о корнях, полученных с помощью анализа изображений.

Измерение корней на основе RGB-изображений

Рисунок 8 представляет собой временную серию RGB-изображений корня сахарной свеклы сорта Ferrara. На изображениях видны артефакты, вызванные неоднородным освещением ризобоксов: более светлые области вдоль левой стороны и разная яркость в зоне перекрытия верхнего и нижнего изображений.

Исследование роста корней с помощью RGB-визуализации, сахарная свекла 'Ferrara', дни 20–35, таймлапс-анализ, диаграмма роста.
Рисунок 8: Временные ряды роста корней, полученные с помощью RGB-визуализации.
На снимках представлена сахарная свекла сорта Ferrara в разные дни после посева (DAS). На изображениях видны некоторые артефакты, вызванные неоднородным освещением в левой части снимка, а также между верхним и нижним изображениями. Масштабные отрезки — 2 cm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Рисунок 9 содержит подробную информацию о сегментации корней на основе цветового порога для сорта Ferrara на 35-й день после посева (DAS). В качестве эталона (Рисунок 9A) используется бинарное изображение, на котором все корни были отслежены вручную с помощью графического планшета. Время, затраченное на ручное отслеживание всей полностью развитой густой корневой системы сахарной свеклы, составило около четырех часов. На Рисунке 9B представлен детальный вид выбранного участка в верхней части изображения, где присутствуют старые боковые корни. Здесь несколько осевых корней не классифицированы с помощью цветового порога. Напротив, в нижней части (Рисунок 9C), где преобладают белые молодые корни, сегментация по цвету правильно классифицирует все осевые корни. Бинаризированная корневая система (Рисунок 9D) имеет черную область с левой стороны из-за артефакта освещения, которая была определена как область исключения перед проведением количественного анализа. На Рисунке 9E показаны соответствующие пиксельные гистограммы выбранных признаков (корни против почвы) для красного канала RGB-изображения сорта Ferrara на 35-й DAS. Пиксели корней (синий цвет) четко демонстрируют три пика, соответствующих светлым молодым боковым корням, темным старым боковым корням и стержневому корню. Перекрытие между старыми боковыми корнями и фоном почвы очень сильное, что приводит к появлению неклассифицированных осевых корней (ср. Рисунок 9B).

Схема сегментации корней на основе RGB-цвета с гистограммным анализом типов корней и дифференциацией почвы.
Рисунок 9: Сегментация корней с использованием цветового порога.
(A) Корневая система, сегментированная вручную с помощью графического планшета; (B) область с плохо сегментированными старыми осями корня в верхней части изображения и (C) правильно сегментированные молодые оси в нижней части изображения; (D) бинарное изображение, полученное путем пороговой обработки по цвету. (E) Гистограммы пикселей для выбранных признаков RGB-изображения. Корни представлены синими столбцами с указанием различных типов корней; почва представлена красными столбцами. Масштабные отрезки на A и D — 2 cm; масштабные отрезки на B и C — 1 cm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Итоговая общая длина видимых корней, определенная для эталонного изображения при ручной сегментации, составляет 1534.1 cm, тогда как автоматизированная сегментация по цвету дает общую длину корней 1427.6 cm.

Изображения в градациях серого, полученные при УФ-освещении, не дали преимущества в данном случае и показали худшие результаты по сравнению с цветовым пороговым анализом (длина корня: 1679,7 cm). Старые корни не удалось сегментировать, а на изображении наблюдалось больше шума, что, вероятно, связано с более низкой интенсивностью света УФ-ламп. Тем не менее, в случае молодых корней с высокой автофлуоресценцией и светлым фоном субстрата УФ-освещение все еще может быть подходящим вариантом, что демонстрирует изображение из другого эксперимента, где в качестве фонового субстрата использовался песок (Рисунок 10).

Флуоресцентная микроскопия; структура корня; слева: конфокальное изображение в синих тонах, справа: изображение в светлом поле.
Рисунок 10: УФ-освещение для визуализации корней на светлом фоне.
Пример корневой системы твердой пшеницы, растущей в ризобоксе, заполненном кварцевым песком. Ризобокс сфотографирован при освещении (A) УФ-светом и (B) флуоресцентным (дневным) светом. Масштабные отрезки — 2 cm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Измерения корней на основе HSI

Рисунок 11 представляет средние спектры для трех областей интереса (ROI) корня (старый и молодой боковой корень, стержневой корень) и двух областей интереса почвы (верх и низ ризобокса).

График спектрального анализа корня, нормализованная отражательная способность в зависимости от длины волны, сравнение почвы и корня.
Рисунок 11: Средние спектры корня и почвы.
Спектры из областей интереса (ROI) на корне (три типа корней) и в почве (верхняя и нижняя части ризобокса). Области ROI выбраны для определения оптимального критерия сегментации между корнем и почвой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Очевидно, что главный и молодые боковые корни существенно отличаются от фона по интенсивности большинства спектральных зон. Для старых боковых корней разница в интенсивности гораздо ниже. Характерной особенностью, которую можно определить визуально, является различный наклон спектра в области поглощения воды (1450 nm). Здесь наклон спектров корня выше по сравнению со спектрами почвы. Кроме того, в области около 1100 nm можно обнаружить изменение спектров главного и молодых боковых корней, которое отсутствует у старых боковых корней.

Рисунок 12A демонстрирует результат работы алгоритма поиска, определяющего спектральное отношение с наиболее сильным контрастом между объектом и фоном. Отношение спектров на 1476 nm к 1076 nm обеспечивает наилучшее разделение корней и почвы. Результирующая гистограмма пикселей переднего плана (корней) и фона (почвы) представлена на Рисунке 12B>. Несмотря на некоторое перекрытие, большинство пикселей четко отделены от почвенного фона. При аппроксимации гистограммы бимодальной кривой Гаусса и использовании расстояния Бхаттачарйи для количественной оценки получено значение 7,80. Значение выше 3,0 указывает на сильный контраст изображения, что позволяет проводить надежное разделение28.

Спектральная тепловая карта и гистограмма для анализа интенсивности длин волн; анализ данных оптического излучения.
Рисунок 12: Разница в отражательной способности между передним планом (корнями) и фоном (почвой) для различных соотношений спектральных зон и гистограмма пикселей при спектральном соотношении, используемом для сегментации.
(A) Яркие цвета (желтый) указывают на высокий контраст между передним планом и фоном, темные цвета (синий) — на низкий контраст. Первые 15 зон были удалены из-за шума. Красные линии обозначают соотношение зон с наивысшим контрастом. (B) Гистограмма пикселей корней (синий) и почвы (красный) при спектральном соотношении сегментации. Синие столбцы представляют корни, красные — почву. Значение интенсивности соответствует отношению спектральной зоны 160 к спектральной зоне 49. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Бинарное изображение (Рисунок 13) создается путем применения глобального порога интенсивности определенного спектрального отношения со значением 1.008, рассчитанным на основе расстояния по гистограмме27. Анализ длины корня на этом изображении дает общую длину 1557.3 cm, что соответствует погрешности всего 1.5% по сравнению с эталонным изображением, обработанным вручную.

Схема структуры нейронной сети; дендритное дерево; микроскопическое изображение; визуализация связей нейронов.
Рисунок 13: Бинарное изображение корневой системы сахарной свеклы сорта Ferrara.
Изображение получено путем применения глобального спектрального порога. Масштабная линейка (нижний левый угол), 2 cm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Хотя сегментация корней при использовании спектральной информации улучшилась по сравнению с использованием цветовой информации, основной целью гиперспектральной (HS) визуализации является анализ хемометрических свойств изображения. Это продемонстрировано на примере картирования содержания воды на изображении ризобокса.

Рисунок 14A демонстрирует средние спектры отсеков в калибровочном ризобоксе (см. Рисунок 7), заполненном почвой с различным содержанием воды. Форма спектров в разных отсеках схожа, то есть в данном случае спектральное отношение не обязательно обеспечивает более стабильный критерий классификации. Таким образом, в качестве наилучшего разделяющего критерия определена интенсивность на одной спектральной полосе (1680 nm), где средняя разница между соседними значениями содержания воды максимальна. Полученные гистограммы пикселей для данной длины волны показаны на Рисунке 14B.

Графики спектрального анализа; (A) спектры поглощения, (B) распределение интенсивности для влажных и сухих состояний.
Рисунок 14: Спектральные характеристики для калибровки содержания воды.
(A) Средние спектры девяти водных отсеков из калибровочного ризобокса с разным содержанием воды; (B) Пиксельные гистограммы для водных отсеков на полосе 216, где среднее расстояние между соседними отсеками максимально. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Зависимость средней интенсивности пикселей на длине волны 1680 nm от измеренного содержания воды показана на рисунке 15.

График влажности почвы; экспоненциальная и линейная аппроксимации. Содержание воды в зависимости от коэффициента отражения; полевая влагоемкость, точка увядания.
Рисунок 15: Зависимость спектрального коэффициента отражения от объемного содержания воды.
На рисунке представлены пары данных измеренного содержания воды и спектрального коэффициента отражения с эмпирическими кривыми (линейной и экспоненциальной), построенными по данным за исключением значений наибольшего содержания воды (красные треугольники). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот рисунок в большем размере.

Дифференциация более высокого содержания воды по спектральной интенсивности становится затруднительной. Значимая регрессия (линейная или экспоненциальная) с высоким R2 может быть аппроксимирована для содержания воды примерно до 0.30 cm3 cm-3. Более влажные условия почвы не могут быть надежно предсказаны по значению интенсивности. Аналогичное поведение экспоненциальной зависимости между отражательной способностью и содержанием воды с уменьшением отклика при содержании воды выше 0.30 cm3 cm-3 также было обнаружено в других исследованиях30.

Изображение ризобокса с детальным картированием содержания воды показано на рисунке 16. Следует отметить четыре аспекта. Во-первых, в укорененных частях ризобокса видна область с более низким содержанием воды. Во-вторых, наиболее сильное истощение сосредоточено вблизи отдельных осей корней. В-третьих, зоны истощения также наблюдаются там, где оси корней не видны на поверхности, что указывает на области, где корни скрыты в почве. В-четвертых, картирование воды без дополнительной обработки изображений приводит к пятнистому виду из-за агрегатов почвы. Это может указывать как на неоднородное распределение содержания воды на уровне агрегатов, так и на влияние морфологии поверхности на качество изображения. Хемометрические методы обработки изображений позволяют преодолеть такие морфологические эффекты в спектральных изображениях31, однако они пока не реализованы в используемых здесь скриптах Matlab.

Схема структуры нейрона; детали дендритных ветвей при анализе нейронной сети.
Рисунок 16: Карта содержания воды в ризобоксе.
Темно-синий цвет соответствует областям с высоким содержанием воды, области от зеленого до красного цвета показывают регионы с низким содержанием воды. Корень растения наложен на изображение черным цветом. Масштабная линейка (в нижнем левом углу) — 2 cm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Примеры применения

Рисунок 17 сопоставляет количественные признаки корней, полученные в результате анализа изображений, с наземными измерениями.

Анализ данных роста растений; графики длины корня, соотношения площади поверхности, сухого вещества и устьичной проводимости.
Рисунок 17: Типичные примеры применения данных о корневой системе.
(A) и (B) демонстрируют информацию о корнях, используемую для характеризации надземных и подземных частей растения в контексте фенотипирования. (A) представляет рост корней сорта сахарной свеклы Ferrara, (B) сравнивает шесть сортов сахарной свеклы, выращенных в ризобоксах, с использованием соотношения площади поверхности листьев и корней (данные одного повтора). (C) и (D) представляют функциональные зависимости между признаками, выявленные в ходе физиологических исследований растений. (C) показывает влияние соотношения площади поверхности листьев и корней на производство сухого вещества, а (D) — зависимость площади поверхности корня от устьичной проводимости. Щелкните здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 17A и 17B относятся к фенотипированию, направленному на комплексную характеристику надземной и подземной частей растений. На рисунке 17A показан рост корней сахарной свеклы сорта Ferrara (см. рисунок 8 для просмотра изображений). Расширение корневой системы указывает на способность сорта осваивать объем почвы за определенный промежуток времени вегетационного периода. На рисунке 17B показано соотношение площади поверхности листьев к площади поверхности корней у шести сортов сахарной свеклы, что служит дескриптором баланса между обеспечением растения (корень) и его потребностями (лист).

Рисунки 17C и 17D приводят примеры функциональных зависимостей, представляющих интерес в физиологических исследованиях. На рисунке 17C отношение площади поверхности листьев к площади поверхности корней соотносится с количеством сухого вещества, образовавшегося в ходе эксперимента, что указывает на определяющую роль ассимиляционной поверхности как лимитирующего фактора накопления сухого вещества. Отсутствие статистической значимости, несмотря на сравнительно высокий R2, связано с малым количеством парных данных (n=6), использованных в данном случае. Рисунок 17D показывает, что сорта с большей площадью поверхности корней (улучшенным поглощением) имеют в среднем более высокую устьичную проводимость на протяжении всего эксперимента. Большая площадь корней, по всей видимости, поддерживает экстракцию воды, тем самым продлевая открытие устьиц.

Обсуждение

Протоколы обеспечивают два взаимодополняющих подхода для почвы, рост корневой системы визуализации. Важным шагом для надежных экспериментальных результатов заполнение rhizoboxes, который должен обеспечить даже и однородной подложки слоем на передние стекла обеспечивают контакт туго корень почвы в окне наблюдения и избежать воздушные зазоры. Это основная причина для использования сравнительно хорошо просеянные почвы < 2 мм: крупных агрегатов привести к выше поверхности морфологии в окне наблюдения с пустоты между агрегатами. Кроме того, более высокий риск обезвоживания кончика корня это также требует более сложных методов обработки изображений для воды сопоставления31.

Поэтому изменения протокола сосредоточиться на улучшение и быстрого заполнения rhizoboxes. В настоящее время время наполнения составляет около 30 минут в коробке. Кроме того использование rhizoboxes с двумя стеклами для изображений с обеих сторон, так и изменения для оптимизации однородности освещения для лучшего изображения RGB тестируются. Дальнейшие расширения оборудования могли бы также рассмотреть интеграции плоские optodes32 , а также емкости изображений33 в rhizobox систему. Однако это выходит за рамки текущей модернизации деятельности.

Модификаций программного обеспечения сосредоточиться на автоматической регистрации предохранитель верхней и нижней RBG фото34. Для использования гиперспектральных изображений продвинутая особенность неконтролируемой добычи подходы28 , а также более чувствительные методы обнаружения под контролем целевого такие как Марковским35 тестируются. Таким образом гиперспектральных данных потенциально позволяют для оценки нескольких почвы, ризосфере и корень свойства36. Кроме того, он призван разработать (полу) автоматизированного программного обеспечения для rhizobox корень изображений на основе модифицированной версией37 корневой системы анализатора для количественного определения морфологической (длина, диаметр, поверхность) а также архитектурные черты (ветвления частоты, ветвление углы).

Основное ограничение протокола, по сравнению с 3D визуализации подходов является ограничение на поверхности видны корня и ризосфере свойств. Однако было продемонстрировано, что видимые корень черты являются надежным прокси для всей корневой системы21. Rhizobox техника легко сочетается с традиционными разрушительной выборки (стирка) в конце динамичного роста изображений с целью проверки связи видимыми против всего корневой системы черты. Как это отношение может варьироваться среди видов21, разрушительные выборки рекомендуется для обеспечения надежного вывода из видимых признаков для любой новой серии фенотипа с видами различных культур.

Ключевым преимуществом протокола, представленные здесь является сочетание реалистичные условий выращивания (почвы), относительно высокой потенциальной пропускной способности для временно решена RGB изображения и вывод на корень функциональность (например, поглощение воды) через chemometric корня и ризосфере данным гиперспектральных изображений. Тем самым методы преодолевает ограничения вывода в Рассада высокой пропускной способности и не почвы корень изображений методы14, хотя это частично позволяет глубоко фенотипирование понимание функциональных процессов с менее экспериментальной сложности и высокую пропускную способность по сравнению с передовых 3D методы15.

В предстоящих экспериментов для изучения эффекта микориза на развитие корневой системы и функциональность бобовых, а также что касается фенотипирование корень характеристики видов покрытия сельскохозяйственных культур в отношении структуры почвы, азота и углерода будет использоваться протокол Велоспорт.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы признают, финансирование от австрийской FWF фонд науки через проект номер P 25190-B16 (корни засухоустойчивость). Создание инфраструктуры гиперспектральных изображений было при финансовой поддержке федерального правительства Нижняя Австрия (Земля Niederösterreich) через проект K3-F-282/001-2012. Дополнительное финансирование для сахарной свеклы эксперимент был получен от Аграна исследований & GmbH центр инноваций (АРИК). Авторы благодарят Крейг Джексон за техническую поддержку в ходе эксперимента и английский коррекции рукописи. Мы также признаем Маркус Freudhofmaier, кто способствовал созданию RGB изображения установки и Йозеф Schodl для строительства rhizobox монтажа.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RhizoboxTechnisches Bü ro fü r BodenkulturЭкспериментальный строитель
Светодиодные лампы ATUM HORTI 600KlutronicAHI10600F
Люминесцентная лампа HiLite T5 DayJuwel Aquarium86324
УФ-лампа Eurolite 45 см тонкий 15 ВтConrad593384 - 62
Canon EOS 6DCanon Austria GmbH8035B024
Adobe Photoshop CS5 Расширенная версия 12.0 x 32Adobe Systems Software Ireland Ltd.
WinRhizo Pro v. 2013Regent Instruments Inc.
Xeva-1.7-320 SWIR камераXenicsXEN-000105
Спектрограф Имспектор N25EОбразец
Гиперспектральный сканер изображенийCarinthian Tech Research AGЭкспериментальный строительПроектирование и сборка гиперспектрального сканера и программного обеспечения
Matlab R2106aMathworksВ том числе наборы инструментов для обработки изображений, обработки сигналов и статистики и машинного обучения
AP4 PoromoeterDelta-T-Devices
LI-3100C Измеритель площадиLI-COR
BASF Styradur листы полистиролаObi Baumarkt9706318Различные типы листов полистирола или другого материала для разделения по-разному увлажненного грунта

Ссылки

  1. Kutschera, L. Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).
  2. Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. The origin and early evolution of roots. Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).
  3. Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. Global change and terrestrial plant community dynamics. PNAS. 113, 3725-3734 (2016).
  4. MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands. PNAS. 108, 3086-3091 (2011).
  5. Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. Global water resources: vulnerability from climate change and population growth. Science. 289, 284(2000).
  6. Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes. Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).
  7. Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat. Agron. J. 93, 290-298 (2001).
  8. Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. 50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland. Environ. Res. Lett. 9 (10), 105011(2014).
  9. Lynch, J. P. Roots of the second green revolution. Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).
  10. Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front. Plant Sci. 4, 442(2013).
  11. Metcalfe, D. B., et al. A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy. New Phytol. 174, 697-703 (2007).
  12. Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues. , DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).
  13. Gioia, T., et al. GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply. Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).
  14. Watt, M., et al. A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites. Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).
  15. Fiorani, F., Schurr, U. Future scenarios for plant phenotyping. Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).
  16. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  17. Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography. Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).
  18. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 1(2015).
  19. Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis. Plant Methods. 10, 1(2014).
  20. Bengough, A. G., et al. Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings. Plant Soil. 262, 63-70 (2004).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).
  22. Price, A. H., et al. Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status. Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).
  23. Vadez, V. Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation. Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).
  24. Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods. Dane, J. H., Topp, G. C. , SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).
  25. Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics. J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).
  26. Passioura, J. B. The perils of pot experiments. Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).
  27. Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. Tutorial: Time series hyperspectral image analysis. J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).
  28. Kim, D. M., et al. Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis. Scie rep. 5, (2015).
  29. Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review. Plant Methods. 11, 29(2015).
  30. Lobell, D. B., Asner, G. P. Moisture effects on soil reflectance. Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).
  31. Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments. Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).
  32. Williams, P. N., et al. Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice. Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).
  33. Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize. Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).
  34. Brown, M., Lowe, D. G. Automatic panoramic image stitching using invariant features. Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).
  35. Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging. Scientific Reports. 6, 35679(2016).
  36. Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).
  37. Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine. Plant Physiol. 164 (1), 24-35 (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

RGB
RGB и спектральные корень изображений для растений фенотипа и физиологических исследований: экспериментальная установка и визуализации протоколы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.