Method Article

Подготовка на основе хитозана инъекционные гидрогелей и его применение в культуре клеток 3D

DOI:

10.3791/56253

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1The Key Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Chemistry, Tsinghua University, 2Institute of Chemical Materials, China Academy of Engineering Physics

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем снисходительный подготовка на основе хитозана инъекционные гидрогели, с использованием динамических Имин химии. Представлены методы для регулировки гидрогеля механическую прочность и его применение в 3D клеточной культуры.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол представляет легким, эффективным и универсальным методом подготовить на основе хитозана гидрогели, с использованием динамических Имин химии. Гидрогель готовят путем смешивания растворов гликоля хитозана с gelator полимер синтезированных бензальдегида прекращено, и гидрогели эффективно получены в течение нескольких минут при комнатной температуре. На различные соотношения между гликоль хитозана, полимерные gelator и содержание воды получаются универсальный гидрогели с различными гелеобразования времена и скованность. Когда они повреждены, гидрогеля можно восстановить свои выступления и модуль упругости, благодаря обратимости динамических Имин облигаций как crosslinkages. Это самостоятельно обратимо свойство позволяет гидрогеля быть инъекционные, так как это может быть самостоятельной исцелил от сжал частей к неотъемлемой массовых гидрогеля после процесса впрыска. Гидрогель также мульти реагировать многих био активные стимулы за счет сбалансированности различных статусов динамических Имин облигаций. Этот Гидрогель был подтвержден как био совместимого и L929 клетки фиброцита мыши были встроенные следующие стандартные процедуры и пролиферации клеток легко оценивалась путем процесса выращивания 3D ячейки. Гидрогель может предложить регулируемые платформы для различных исследований, где прибыль физиологических мнемосхемы 3D среды для клеток. Наряду с его свойства мульти реагировать, самостоятельно обратимо и инъекционные гидрогели потенциально может быть применен как несколько перевозчиков наркотиков и клетки в будущем био медицинских приложений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гидрогели, сшитых полимерных материалов с большим количеством воды и мягких механических свойств, и они были использованы в многих био медицинских приложений1,2. Гидрогели может предложить мягкой и влажной среде, которая очень похожа на физиологические окружение для клеток в естественных условиях. Таким образом гидрогели стали одним из самых популярных подмости для 3D клетки культуры3,4. По сравнению с 2D Петри клеточной культуры, 3D клеточной культуры выдвинул быстро предложить что внеклеточного матрикса (ECM) передразнил микроокружения клеток связаться и собрать для пролиферации и дифференцировки цели5. Кроме того гидрогели, содержащие полимеры природные может предложить био совместимых и содействие сред для клетки размножаются и дифференцировать3. Гидрогели на основе синтетических полимеров являются предпочтительными для их простые и ясные компонентов, исключающих комплекса воздействий как белки животного происхождения или вирусов. Среди всех кандидатов Гидрогель для 3D клеточной культуры гидрогели, которые легко приготовить и имеют последовательную свойства всегда являются предпочтительными. Возможность настроить свойства гидрогеля с учетом требований различных исследований имеет важное значение как хорошо6.

Здесь мы представляем снисходительный подготовка гликоль основе хитозана гидрогеля с использованием динамических Имин химии, которая становится универсальным гидрогеля платформой для 3D клетки культуры7. В этом методе известные био совместимого гликоль хитозана, используются для установления кадры гидрогеля сетей. Амино группы являются прореагировало с полиэтиленгликоля бензальдегида прекращено как полимер gelator сформировать динамический Имин облигации как crosslinkages гидрогелей8. Динамических Имин облигации может сформировать и разложить обратимо и ответственно к окружению, наделяя гидрогели с механически регулируемая высокоструктурированные сетей9,10,11. Благодаря своей высокой воды содержание, био совместимых материалов и регулируемые механических сильные гидрогеля успешно применяется в качестве лески для L929 клеток в 3D клетки культуры12,13. Протокол здесь детали процедуры, включая синтеза полимеров gelator, гидрогеля подготовку, клеток внедрение и культивирование 3D клеток.

Гидрогель также показывает ряд других особенностей, из-за его динамичный Имин crosslinkages, включая его мульти реагировать на различные био стимулы (кислоты/рН, витамин B6 производные пиридоксаль, папаин белков и т.д.), указав, что гидрогелевые может быть Индуцированная разложить в физиологических условиях8. Гидрогель также самостоятельно обратимо и инъекционные, что означает гидрогеля может быть управляются через минимально инвазивные инъекционный метод и получить преимущество в14,поставки наркотиков и ячейки15. Путем добавления функциональных добавок или конкретных предустановленных полимера gelators, гидрогеля совместим для получения определенных свойств как магнитные, температуры, рН реагировать, и т.д.16,17, который может выполнить широкий спектр исследовательских потребностей. Эти свойства показывают гидрогеля потенциал быть инъекционные несколько перевозчиков наркотиков и клетки как био медицинские исследования в пробирке и в естественных условиях , так и приложений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

внимание: пожалуйста, проконсультируйтесь с все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Пожалуйста, используйте соответствующие безопасности практики при выполнении химии экспериментов, в том числе использование вытяжного шкафа и средства индивидуальной защиты (защитные очки, защитные перчатки, лабораторный халат и т.д.). Протокол требует от стандартной ячейки обработки методов (стерилизации, восстановление клеток, клеток пассированый, замораживание клеток, окрашивание клеток, и т.д.).

1. Подготовка гидрогели

полимер
    1. , синтез бензальдегида прекращено ди функционализированных полиэтиленгликоля (DF PEG)
      1. , Предварительная сушка PEG весят 4,00 g ПЭГ (4000 МВт, 1.00 ммоль), перевести его в колбу круглым дном (250 мл) и добавить толуола (100 мл).
        Примечание: Другие колышки с различных молекулярных масс может работать для формирования гидрогеля, но приведет к различным жесткость.
      2. Тепло решение тепловой пушки (или плита около 40 ° C) мягко помочь распустить все полимеры. После того, как распустить все полимеры, используйте испарителя для удаления всех растворителей. Повторите этот растворить и сухой процесс два раза чтобы сделать сушеные PEG полимеров.
        Предупреждение: Это должно выполняться в Зонта с крайней осторожностью. Толуол легковоспламеняющиеся.
    2. Бензальдегида прекращение реакции PEG
      1. Добавить магнитную мешалку и тетрагидрофуран (THF, 100 мл) в колбу и распустить КОЛЫШЕК с помощью мешалкой. Добавить 4-carboxybenzaldehyde (0.90 g, 6,0 ммоль) и 4-dimethylaminopyridine (0,07 г, 0,6 ммоль) последовательно решения для полного растворения всех тел.
      2. Добавить N, N '-методы (DCC, 1,25 г, 6,0 ммоль) в решение и добавить сушки трубка, которая заполняется с безводный CaCl 2 в колбу. Держите реакции при помешивании при комнатной температуре (~ 20 ° C) для примерно в 12 ч.
    3. После реакции процесс
      1. Фильтр Белый тел, созданных в решении вакуум после завершения реакции. Залейте раствор в холодной диэтиловым эфиром (500 мл) при помешивании осадок белого вещества. Соберите все белые твердые фильтром и сухого вещества в вытяжной шкаф.
      2. Снова наплыв ТГФ белые твердые, отфильтровать любые нерастворимый белый тел, Залейте раствор в свежей холодной диэтиловом эфире ускорять белые твердые и высушите его. Повторите эту процедуру два или три раза и затем поместите белый тел в вакуумный сушильный шкаф (20 ° С, 0,1 мбар) полностью высохнуть. Собирать белый порошок как конечный продукт: бензальдегида прекращено DF PEG.
  2. Подготовка гидрогели
    1. весят различное количество DF ПЭГ (0,11 g, 0,028 ммоль 0,22 g, 0,055 ммоль; 0,44 g, 0,110 ммоль) в трубку (10 мл), Добавьте деионизированной воды (5,0 мл) и использовать вихревой или магнитной мешалкой, чтобы помочь распустить полимера.
    2. Распустить хитозана (0.495 g, 6.18 x 10 -3 ммоль) гликоля в деионизированной воде (15,0 мл) в трубку (50 мл) и использовать вихрь на несколько минут для однородный раствор хитозана (3 wt %).
    3. Добавить гликоль раствор хитозана (0,2 мл, 3 wt %) и DF PEG решения (0,2 мл) последовательно в трубку (2,0 мл). Используйте вихревой смешать решения однородно формы гидрогели в течение нескольких минут. Следовать за показатели в таблице 1 сделать гидрогели различных механических сильные.
      Примечание: Используйте метод инвертирование трубки для определения ли уже сформировал гидрогеля.
  3. Анализ реология
    1. проводить анализы реология на вращения Реометр с параллельной стальной пластине (диаметр: 20 мм). Для испытания гелеобразования распространение гликоль раствор хитозана (0,2 мл, 3 wt %) на нижней пластине. Затем добавьте DF PEG водные растворы (0,2 мл, 2 wt %) равномерно каплям на поверхность раствор хитозана и смешать с пипеткой быстро. Ниже вниз верхнюю тарелку и начинают test.
    2. Для гидрогелевых ' s жесткости теста, вырезать Гидрогель в круг (диаметр: 20 мм) и измерить модуль хранения (G ') значения по сравнению с частоты анализов на 1% деформации. Типичный G ' значения в 6.3 rad s − 1, перечислены в таблице 1.
      Примечание: Проведение реология анализа гидрогеля 0,5 ч после Гидрогель образования для обеспечения стабилизации динамических Бонд гидрогеля.
    3. Для гидрогелевых ' s самостоятельно обратимо свойства теста, вырезать гидрогеля на куски и собрать куски self-heal неотъемлемой части. Затем вырежьте кусок гидрогеля, чтобы сделать круг (диаметр: 20 мм) и положил его на Реометр осуществлять анализ реологии.

2. 3D культивирования клеток в гидрогели

  1. приготовления растворов гелеобразования Гидрогель
    1. весят DF ПЭГ (0,44 g, 0,11 ммоль) в стерильную пробирку (4,0 мл), добавить в ячейку культуры СМИ (RPMI 1640, 2.0 Мл) и использовать вихревой или мешалкой помочь распустить полимеров для получения раствора полимера (20 wt %). Загрузите решение в шприц (10,0 мл) и затем стерилизовать его, передав его через фильтр бактерий цепкой микрон (0.22 мкм).
    2. Весят гликоль хитозана (0,165 g, 2.06 x 10 -3 ммоль) в стерильную пробирку (15,0 мл), добавить в ячейку культуры средств массовой информации (RPMI 1640, 4,0 мл) и вихрь помочь распустить полимеров для получения хитозана раствор гликоля (4,0 wt %). Загрузите решение в шприц (10,0 мл) и фильтр с помощью фильтра бактерии цепкой 0,22 мкм.
  2. Культивирования клеток в гидрогели
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: выполнить все ячейки, соответствующие процедуры в культуре ткани капюшоном. Ожидается, что базовые знания о стерилизации. Средний
    1. приготовления суспензии клеток
      1. L929 культуры клеток в RPMI 1640 с 10% FBS, 5% пенициллин (10 мл) в Петри блюдо (диаметр 10 см) и инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2. Изменить каждый день перед использованием носителя.
      2. Урожая L929 клеток с PBS, содержащих трипсина (0,025% w/v) и ЭДТА (0.01% w/v), затем центрифуги (70 x g, 5 мин) и вновь приостановить клеток в среде RPMI 1640 (1.0 мл). Выполните подсчет клеток, с использованием стандартной операции крови Счетной комиссии. Вновь приостановить клетки для регулировки концентрации клеток до ~ 3,75 × 10 6 клеток/мл.
    2. Клеток инкапсуляции в гидрогели
      1. Mix L929 клеточных суспензий (0,4 мл, 3,75 х 10 6 клеток мл -1) раствором хитозана гликоль (0,4 мл) в трубку (4,0 мл), вихревой. Пипетка L929/гликоль раствор хитозана (0,8 мл) в центр конфокальный Петри (диаметр 2,0 см). Пипетка DF PEG решения (0,2 мл) в том же блюдо и осторожно Пипетка mix решение и заставить Гидрогель образования.
        Примечание: Оценки формирования гидрогеля, наклоняя Петри.
      2. Для прямой клеточной культуры, добавьте дополнительное количество RPMI 1640 культуры средств массовой информации (1.0 мл) на вершине гидрогеля. Поместить ячейки встроенных гидрогели (1,0 мл, 1.5 wt % гликоля хитозана, 4.0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 6 клеток мл -1) в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2) и измените средство каждый день. Подготовиться к визуализации ячейки на день 1, 3, 5 и 7, после инкапсуляции ячейки.
    3. Для 3D клеток после культуры в гидрогели после инъекции, подготовить клеток загруженных гидрогеля (1,0 мл, шаг 2.2.2) в шприцах (10,0 мл, 48 G иглы). После форм гидрогеля медленно вдохнуть Гидрогель в чашке Петри для конфокальная томография. Добавьте дополнительное количество культуры средств массовой информации (1.0 мл) на вершине гидрогеля и менять его каждый день. Поставьте чашку Петри в инкубаторе (37 ° C, 5% CO 2) и подготовить для визуализации потом.
      Предупреждение: Пожалуйста, проверьте и следовать за безопасность операции протокола шприца.
  3. Анализ жизнеспособности клеток
    1. конфокальная наблюдение
      1. Промыть гидрогели с PBS (1.0 мл) два раза. Пятно гидрогели флуоресцеин диацетат (FDA, 0,5 мл 0,05 мг/мл) и пропидий йодидом (PI, 0.5, 0,08 мг/мл) решения 15 мин. После окрашивания, удалите все растворители.
      2. Наблюдать гидрогели, используя конфокального микроскопа под возбуждения волны 488 нм и 543 Нм для визуализации жить и мертвые клетки, соответственно. Возьмите z стеки через каждые 2 мкм глубина гидрогелей для проверки равномерное распределение клеток на протяжении.
        Примечание: FDA пятна живых клеток, в то время как Пи пятна отмершие клетки.
    2. Ухудшить гидрогеля (1.0 мл) с уксусной кислотой (HAc, 3 v %, 1.0 мл) на 5 мин и пипетки в трубку (4,0 мл). Собирать клетки, центрифуги (70 x g, 5 минут) и заново приостановить клеток в среде культуры клеток RPMI 1640 (1.0 мл). Выполняют клеток подсчета с помощью крови, считая Совет.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое представление настоящего Протокола по подготовке гидрогеля и его использования в качестве 3D клеточной культуры предлагается на рисунке 1. В таблице 1приводится информация содержание и коэффициенты, приготовленные из различных механических сильные гидрогеля. Гидрогель самостоятельно обратимо и реологические свойства представляет гидрогеля жесткость модуль хранения против тест частоты на рисунке 2. Конфокальный изображения клетки и ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гидрогель, представленные в настоящем Протоколе (рис. 1) имеет два основных компонента: Хитозан гликоль природный полимер и синтетических бензальдегида прекращено полимера gelator DF PEG, которые оба биосовместимых материалов. Синтез DF PEG представлены с использованием реакции модификации одношаговый. PEG молекулярной массой 4000 был выбран в этом протоколе проблемы растворимость, эффективность модификации, а также жесткость гидрогеля. Серия гидрогели с различных механических сильные были п...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано национальной науки фонд Китая (21474057 и 21604076).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Гликоль хитозанWako Pure Chemical Industries39280-86-990% степень деацетилирования
4-карбоксибензальдегидShanghai Aladdin  Bio-Chem Technology Co.,LTD619-66-999%
N, N'-дициклогексилкарбодиимидШанхайский Аладдин  Био-Хим Технолоджи Ко., ЛТД538-75-099%
Кальция хлорид безводныйШанхай Аладдин  Bio-Chem Technology Co., LTD10043-52-496%
4-диметиламиоприидинШанхайский Аладдин  Био-Хим Технолоджи Ко., ЛТД1122-5899%
ПолиэтиленгликольХимический реактив Sino-pharm5254-43-799%
ТетрагидрофуранХимический реактив Sino-pharm109-99%
Химический реагент ТолуолSino-pharm108-88-399%
Химический реагент Этиловый эфирSino-pharm60-29-799%
Химический реагент уксусной кислотыSino-pharm64-19-799%
Безводный CaCl2Химический реактив Sino-pharm10043-52-499%
Диацетат флуоресцеинаSigma596-09-899%
Йодид пропидиума Sigma25535-16-494%
RPMI-1640 питательная средаGibco
Фетальная бычья сывороткаGibco
Трипсин-ЭДТАGibco0,25%
PBSSolarbio0,01 М
Пенициллин стрептомицин растворГиклон10 000 Ед/мл
РеометрТА Инструмент
Конфокальный микроскопZeiss710-3channel
L929 CellsATCCNCTC клон 929; L-элемент, L929, производная от штамма L
ИспарительEYELAN-1100
48 калибровочная иглаShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD48-го калибра
МикроскопLeicaDM3000 B
Программное обеспечение для микроскопаImaris
Heat GunConfuKF-5843 
Чашка ПетриNEST
AR-G2

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).
  2. Seliktar, D. Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications. Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), (2016).
  5. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  7. Yang, B., et al. Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier. Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).
  8. Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules. Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).
  9. Cao, L., et al. An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering. J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).
  10. Ding, F., et al. A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability. Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).
  11. Wei, Z., et al. Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications. Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).
  12. Li, Y., et al. Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel. Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).
  13. Tseng, T. C., et al. An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System. Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).
  14. Yu, L., Ding, J. Injectable hydrogels as unique biomedical materials. Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).
  15. Yang, L., et al. Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier. Polym. Chem. , (2017).
  16. Zhang, Y., et al. A magnetic self-healing hydrogel. Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).
  17. Zhang, Y., et al. Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation. Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).
  18. Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).
  19. Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue. Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).
  20. Banerjee, A., et al. The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells. Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).
  21. Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chitosan HydrogelInjectable Hydrogel3D Cell CultureSelf Healing HydrogelDynamic Imine ChemistryConfocal MicroscopyL929 CellsCell ProliferationHydrogel FormationDrug Delivery

Related Articles