Методическая статья

Применение лазерной микро облучения для рассмотрения одного и двойной стренги перерыв ремонт в клетках млекопитающих

DOI:

10.3791/56265

⸱

5 сентября 2017 г.

 ,  , 
1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфокальный флуоресценции микроскопии и лазерной микро облучения предложение инструменты для вызывая повреждение ДНК и контроля ответ ДНК ремонт белков в отдельных югу ядерной областях. Этот метод значительно продвинулась наши знания обнаружения повреждений, сигнализации и вербовки. Эта рукопись демонстрирует эти технологии для изучения одноместные и двухместные стренги перерыв ремонт.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высоко скоординированных ДНК ремонта пути существуют для обнаружения, акцизов и заменить поврежденные оснований ДНК и координировать ремонт разрывы ДНК пряди. В то время как методы молекулярной биологии уточнили структуры, ферментативные функции и кинетика протеинов ремонта, по-прежнему необходимо понять, как ремонт координируется в ядре. Лазер микро облучения предлагает мощный инструмент мониторинга набор протеинов ремонта и вызывая повреждение ДНК. Индукция повреждений ДНК путем лазерной микро облучение может произойти с диапазоном длин волн, и пользователи могут надежно побудить однорядная перерывы, базовый поражений и двойной стренги порывает с диапазоне доз. Здесь лазер микро облучения используется для изучения ремонт сингл и двойной стренги перерывов, вызванных два общих конфокальных лазерных длин волн, 355 Нм и 405 нм. Кроме того, надлежащее характеристика прикладной лазерной дозы для стимулирования конкретных ущерб смеси описано, так что пользователи могут выполнять можно воспроизвести лазерной микро облучения сбора и анализа данных.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Люминесцентная микроскопия стала мощной техникой для визуализации сотовой архитектуры, изучения белков локализации и отслеживания взаимодействий протеин протеина и белка ДНК. С помощью флуоресцентной микроскопии для изучения ДНК повреждения ответы после применения глобальных ДНК повреждающих агентов, таких как ультрафиолетового (УФ) света, ионизирующего излучения, химического окисления или алкилирующих агентов или химиотерапевтические предоставила новое понимание инициирование, сигнализации и набор ДНК ремонт белки сайты ДНК повреждения1,2. Однако ограничивая эти глобальные и асинхронные события ущерб, если подробную информацию о порядке найма, кинетика ассоциации или диссоциации, и отношения между ключевыми ДНК ремонт белки испрашиваются. К счастью достижениями в лазерного сканирования конфокальные микроскопы, более широкой доступности вызывая повреждение лазерных длин волн, и улучшения в флуоресцентных белков за последние 25 лет предоставили исследователей с усовершенствованные инструменты для изучения этих аспекты ДНК ремонт, через целевые индукции повреждения ДНК.

Облучение клеток с лазерной microbeams с целью изучения клеточном и субклеточном функций является хорошо создан инструмент в ячейке и радиационной биологии3. Применение этой методики изучения репарации ДНК возник при использовании Кремер и коллег-целенаправленных УФ (257 Нм) лазерная система Микролучевой вызвать повреждение ДНК через 0,5 мкм, пятно яичника китайского хомяка (Чо) клетки4 и учредил индукции Photolesions ДНК по этой системе5. Хотя предлагает значительные улучшения по УФ Микролучевой методы в то время, принятие этого повреждения системы была ограничена из-за ее специализированных создали и его неспособность создать двойной нити перерывы (DSBs)6. Последующее расследование различных УФ-B (290-320 нм) и УФ-волн (320-400 Нм) ряда групп показали УФ фотопродуктов, окислительного базы поражений, одинарная ломает рабочего тормоза (РСРТ), и DSBs может быть наведено зависит от длины волны лазера и мощность применяется4,,7-8,9,10 (обзор в 3). Кроме того комбинации этих UV-B и UV-A длин волн с информирование агентов, как псорален, Бромдезоксиуридин (BrdU) и красители Hoechst, найдены также вызвать повреждение ДНК зависит от длины волны, мощность и длительность воздействия, хотя власть необходимо вызвать повреждение часто опускается при наличии эти агенты11,12,13,14,15. Эти усовершенствования расширил использование микро облучения, хотя там были еще технические препятствия для более широкого принятия этих методов необходимо уделить.

Кремер и коллег значительно расширенные поля микро облучения фокусируясь именно УФ Микролучевой наносить значительный ущерб энергии очень локализованной области в ячейке. Конфокальные микроскопы и лазерных систем microdissection расширенное, плотно сосредоточены свет был более широко доступными; Однако муфты источников УФ областей и дело с хроматические аберрации, которые они по-прежнему вызванной представлены значительные проблемы для большинства пользователей3,6,16. УФ краски возросла популярность на протяжении 90-х годов, оптика способна сосредоточения и захвата УФ возбужденных флуоресценции стал более широко доступны16, и улучшения в лазерного сканирования предлагает пользователям возможность создания очень сосредоточены УФ возбуждения пятна в пределах клетки6,17. Однако, он не был до начала 2000-х что истинное влияние этой комбинации плотно сосредоточены балок с более высокой интенсивности лазеры чувствовал, когда появились многочисленные сообщения, демонстрируя, что разрывы ДНК пряди могут быть вызваны с и без сенсибилизаторов в UV-A диапазон6,10,18,19,20, 405 нм21,,2223,24, 25,26и даже больше в видимых длинах волн как 488 нм27. Эти усовершенствования позволили для более широкого внедрения метода микро облучения на ряд коммерческих систем. Параллельно с этими событиями два Фотон методы также выяснилось, что позволило точно индукция повреждений ДНК; Хотя эти достижения не будут обсуждаться здесь, есть целый ряд обзорных статей, обсуждая эти методологии9,28,29,30.

С текущей доступности конфокальные микроскопы, способных доставлять узкоспециализированных ультрафиолетового света и широкое наличие флуоресцентных белков, чтобы позволить слежение в реальном времени ремонта белков, ДНК микро облучения методы превратились в мощные инструменты для анализа ДНК повреждения ответ и ремонт пути. Однако пользователи должны знать, что поколение повреждения ДНК сильно зависит волны и мощности, применяется к югу ядерной региона. Использование УФ-C (~ 260 Нм) длинах волн позволяют прямого возбуждения ДНК и высокой селективностью для индукции УФ фотопродуктов7,8. УФ-B и UV-A волны производят смеси повреждения ДНК (базовый поражением рабочего тормоза РСРТ и DSBs), зависит от прикладной питания и сотовые фоновый используются7. Эндогенные фотосенсибилизаторов и анти-оксидантов уровней в целевые клетки могут влиять смеси повреждения ДНК, производимые этими длин волн. Кроме того Использование экзогенных фотосенсибилизаторов (BrdU и т.д.) может помочь в снижении энергии, необходимой для индукции повреждения ДНК. Однако эти агенты могут вызвать повреждение ДНК, сами, и они могут изменить клеточного цикла и структура хроматина, поэтому их использование может производить побочные эффекты, которые должны рассматриваться пользователем. Таким образом перед использованием микро облучения для изучения реакции повреждения ДНК и ремонт, требуется тщательное рассмотрение ДНК ремонт пути интерес, волн, доступных для использования и ДНК повреждения смесь создана.

Здесь, лазер микро облучение проводится на два часто используемых длинах волн, 355 Нм и 405 нм, без сенсибилизаторов продемонстрировать смеси повреждения ДНК под воздействием этих волн и влияний, эти повреждения смеси имеют на изучении ремонтРабочего тормоза РСРТ и DSBs. пользователи должны осознавать, что эти волны не создают один видов нити перерывы или базовый поражения. Для того, чтобы различать ДНК ремонт пути, пользователи должны тщательно контролировать прикладной власть над конкретного региона ядра и характеризуют индуцированных повреждений, используя несколько маркеров перерыв прядь и антител поражения ДНК. Если надлежащим образом применяться и характеризуется, лазер микро облучение может обогатить некоторых видов повреждения ДНК, позволяя пользователям оценить ремонт базовых поражений и рабочего тормоза РСРТ или DSBs, с некоторыми специфичности. Таким образом мы создали метод, позволяя пользователям можно воспроизвести выполнения лазерной микро облучения, характеризуют смеси повреждения ДНК, индуцированных прикладной лазерной дозы и выполнять анализ данных.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток и генерации стабильного клеток

  1. клетки растут Чо-K1 в минимальным необходимым среднего, дополнена плода бычьим сывороточным 10%. Сохранить клетки в увлажненные инкубатор с 5% CO 2 при 37 ° с.
  2. Transfect Чо-K1 клетки с 1 мкг плазмида ДНК, содержащие человека XRCC1 с C-терминала Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) тег с помощью коммерческого трансфекции реагент после производитель ' s инструкции.
  3. Выберите Чо-K1 клетки стабильно выражая человеческие XRCC1-GFP сплавливание с использованием 800 мкг/мл geneticin и обогатить XRCC1-GFP выражая населения, используя помощь флуоресценции клеток сортируя (FACS).
  4. Плита клетки быть микро облученных в культуре судов с coverglass днища, так что они достигают примерно 75% или более confluency на следующий день. Некоторые пространства между ячейками желательно, особенно при использовании регистрации вернуться к той же области изображения (описано в раздел 3.2).

2. Микроскоп set-up

  1. выберите лазерное сканирование Конфокальный микроскоп оснащен подходящим лазеров и оптики и программное обеспечение управления для микро облучения/фотостимуляции. Представлены эксперименты использования лазерного сканирования конфокального микроскопа, что была изменена, чтобы включать 355 Нм лазер, волоконно соединен miniscanner photoactivation гальванометра и контролируется с помощью производитель ' s контроля и анализа программного обеспечения. Эта система может выполнять микро облучение в назначенных пользователем региона интерес (ROI) с помощью photoactivation miniscanner (355 Нм лазер) или стандартный конфокальный гальванометра (405 нм лазер).
  2. Выберите волны, которые будут использоваться для микро облучения, обеспечение того, чтобы все оптические компоненты в микро облучения lightpath подходит для выбранной волны.
    Примечание: Представленные система использует 40 × C-Апохромат (числовая апертура (NA) 1.2) масло погружения цели вместе с УФ фильтром куб для 355 Нм микро облучения и 20 × C-Апохромат (NA 0,75) сухой цели с использованием стандартных конфокальной lightpath для 405 нм микро облучения. 20 × цель, используемый в установке не совместим с 355 Нм волны; Поэтому мы использовали 40 × 355 Нм только. Использование сухой цель для повреждения позволяет протоколы иммунофлуоресценции применяться по течению без очистки от погружения нефти, который является, почему мы используем эту цель, когда это возможно.
    3. Эксперимент
  3. Configure микроскоп для микро облучения. Для обеспечения согласованности между эксперименты, назначить стандартизированной конфигурации Микроскоп компонентов, которые будут использоваться для каждого типа микро-облучения. Сохранить эти настройки как пресет в Микроскоп ' s операционной программного обеспечения, если это возможно.
    Примечание: В системе представлена клетки микро облученных и образы с использованием однонаправленного сканирование, сканирование разрешением 1024 x 1024 пикселей с 1 x зум сканирования, на частоту 8 кадров в секунду (fps) и с отверстием, равным примерно 4 просторных единиц (АС), как определяется для 488 нм лазер (69 мкм). Этот параметр Открыть Пинхол был выбран, чтобы увеличить количество света, захвачен в каждом изображении, позволяя использование нижних изображений лазерной полномочий и сокращения Фотообесцвечивание.

3. Лазерное облучение микро

  1. место, подготовленный культуры блюдо, содержащие клетки интереса, на микроскопа и блокировки надежно на месте.
    1. , Если таковые имеются, камерных слайд в стадии Топ инкубатора и поддерживать при 37 ° C с 5% CO 2 во время индукции ущерб. Этот шаг является наиболее важным для клеток timelapse imaging или долго изображений сессий. В противном случае место клетки микроскопа этап и выполнять облучения при комнатной температуре (~ 25 градусов), а затем быстро вернуться клетки в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO 2.
  2. Зарегистрировать изображение поля Разрешить исследователь вернуться в то же место после выполнения фиксации, пятнать или другие процедуры. Выполнять регистрацию поврежденных полей с помощью закодированных, автоматизированных микроскопа или клетки культуры coverglass судов с травления или помечены сетки точек XY.
    1. , Если с помощью регистрации образа программного обеспечения, выберите узнаваемая особенность культуры судна (т.е., угол coverglass или барьер между скважинами), собирать образ и записать местоположение XY. Это позволит обеспечить выравнивание и регистрации XY расположения выбранных полей после пробоподготовки.
    2. Если используется ручной регистрации, запись сетки или травлению мест для каждого поля вручную, стараясь записать их ориентации и размещение блюдо на сцене.
    3. Если не идентифицирующие функции для судов культуры клеток доступны, определить поврежденные поля путем визуального осмотра морфологии клеток и плотности. Позаботьтесь, чтобы выбрать поля с достаточно отличительные особенности быть узнаваемой во время позднее imaging.
      Примечание: Это может занять много времени для выполнения, если ориентация и области культуры судна жестко ограничен.
  3. Выберите поле для микро облучения и сосредоточены образца. Для ячеек, выражая дневно обозначенные протеины выберите фокальной плоскости с максимальной ядерной сечением флуоресцентные канал интерес. Для ячеек не выражая помечены белков, или для тех, кто без четкой ядерной локализации, Фазовый контраст или дифференциальной помехи изображения контрастность (DIC) может использоваться для поиска правильного фокальной плоскости.
    ​ Примечание: полезная функция фазового контраста и DIC изображений является тот факт, что как фокальной плоскости движется через образец, же функцию могут появляться светлые или темные в зависимости от относительной фокальной плоскости.
    1. Выберите функцию ясно внутри ядра, например ядрышко и переместить фокальной плоскости вверх и вниз при соблюдении этого изменения в внешний вид. Истинный фокальной плоскости будет лежать в пределах переход от света к темному. Чтобы образец, выберите фокальной плоскости, в котором выбранный компонент имеет резкий контраст.
  4. Регистрируют положение области интересов. Создайте 3 x 3 пикселя ROI в Микроскоп программное обеспечение, поместите этот ROI ядро клетки повреждены и установите этот ROI, чтобы быть ущерб ROI.
  5. Собирать образ до повреждения, включая позицию повреждения ROI.
    1. Для экспериментов, которые не используют флуоресцентные белки, получить фазово контрастной или дифференциальное вмешательства контраст (DIC) brightfield изображение выявлять и фиксировать ядер для повреждения.
    2. Для клеток экспериментов с использованием флуоресцентных белков, приобрести изображение, содержащее brightfield и флуоресценции канал для протеина интереса (то есть, лазерной линии 488 нм для возбуждения GFP, лазерные линии 561 Нм для возбуждения ППП). В экспериментах с использованием XRCC1 Чо-K1-GFP, флуоресценции возбужденных по линии 488 нм лазер одновременно была собрана с половым brightfield каналом DIC.
  6. Начало лазерной повреждения.
    1. В системе представлена контроля дозы лазер, общее время провел сканирование ущерб ROI. Потому что гальванометра для 355 Нм лазер работает со скоростью фиксированной сканирования, лазерная доза контролируется время неоднократно Сканирование выбранных ущерб ROI: данные, представленные здесь, микро облучения на 355 Нм осуществляется 2 и 10 секунд.
    2. Наоборот, контролировать 405 нм лазер дозы, модулирует скорость сканирования и выполняют одно сканирование выбранных повреждения ROI. В данных pвозмущался здесь, использовать 8 и 0,5 fps для микро облучения на 405 нм. Скорость сканирования 8 кадров в секунду обеспечивает более низкую дозу лазер, чем 0.5 fps, потому что лазер тратит меньше времени на каждый пиксель во время сканирования. Обе лазеры работают на 100% мощности. В разделе 3.7 инструкции по измерению мощности лазера непосредственно.
      Примечание: Каждая система индивидуальных микроскоп может отличаться в как мощность лазера доставляется к назначенным ROI, аналогично как 355 Нм и 405 нм отличаются в системе представлена. Пользователям нужно будет определить процедуру для их системы микроскопа и эти параметры в пределах их методы секций отчета.
    3. Для живых клеток изображений, выполнять timelapse изображения приобретение brightfield и флуоресценции каналов. Настройте длительность и частота timelapse для оптимизации сбора данных, идеально захват накопление флуоресцентный белок в ущерб ROI и его диссоциации эксперимента в течение времени. Эксперименты с использованием XRCC1-GFP собраны изображения каждые 30 секунд в течение 20 минут.
      ​ Примечание: частота timelapse изображений может быть ограничена Фотообесцвечивание Флюорофор, осложняет анализ накопления и диссоциации. Фотообесцвечивание может оцениваться путем наблюдения неповрежденных клеток во время timelapse и корректировки условий приобретения свести к минимуму потери флуоресцентного сигнала в этих без повреждений клеток. Некоторые Фотообесцвечивание может быть неизбежным, поэтому пользователи могут компенсировать потери сигнала, нормализующее флуоресцентные интенсивности поврежденных клеток тем неповрежденных клеток в каждом кадре timelapse.
      1. После завершения курса время, выберите новое поле клеток для повреждения или исправить поврежденные клетки для дальнейшего анализа, как описано в разделе 4.
      2. Продолжить микро облучения и timelapse изображений, пока не будет достигнуто требуемое количество поврежденных клеток.
        ​ Примечание: Мы рекомендуем, повредив в общей сложности 10-25 клеток на выбранное условие для того, чтобы оценить неоднородность к ячейке в ответ индуцированных повреждений. Хотя большинство конфокальный систем позволит пользователям ущерб более чем одной ячейки во время каждого микро облучения, это вводит шахматном ущерб инициации раз, которые могут усложнить анализ пик набора времени над большое количество клеток или диссоциации время для быстрого событий. В некоторых системах одновременное повреждение индукции над несколькими трансформирования может уменьшить дозы лазер, полученных каждой независимой ROI. Поэтому, если эти сроки/мощности вопросов непосредственно пользователем, рекомендуется индивидуально повреждение клетки.
    4. Для анализа иммунофлюоресценции (КРП), выполняют ущерб и либо немедленно исправить ячеек, как описано в разделе 4, или разрешить клетки для восстановления для выбранных приращения времени (т.е., 1, 5, 10 или 20 мин). После того, как нужное время истекло, исправить и запятнать клетки, как подробно указано в разделе 4.
      1. Для увеличения общего количества клеток для анализа, ущерб дополнительные поля в пределах культуры судна для создания многопрофильный курс ответа после повреждения. Запись XY расположение каждого поля и время возникновения ущерба. После желаемого общего ремонта промежутка времени, исправить и запятнать клетки как подробно указано ниже.
  7. После наблюдения белка вербовки на отдельных доз, мера и доклад лазера мощность уровни после волокна и после цели точно характеризуют и сообщать лазерные доз. Мы используем Компактный цифровой индикатор и две разные фотодиод датчик головы; один соединен напрямую лазер волокна для измерения выпуска после волокна, и другие на микроскопа для измерения post-objective вывода.
    1. Для измерения мощности лазера, поместите датчик в нужной конфигурации (после волокна или post-objective) и выполнять микро облучения, как описано выше, во время записи измерений, сделанных измеритель мощности. Имейте в виду, что дискретизации измеритель мощности не могут быть достаточно быстро, чтобы захватить очень быстрое микро облучения событий, поэтому он может быть необходимо запустить несколько итераций эксперимента, чтобы обеспечить, что индикатор точно обнаруживает прикладной дозы.
      Примечание: Для 355 Нм лазер, мы измерили средний пиковой мощности приблизительно 5 МВт после волокна и примерно 19 мкВт после цели. Для 405 нм лазер, микро облучения была исполнена в петли 30 итераций для преодоления 0.01 s максимальная частота измеритель мощности и средняя пик полномочия 1,5 МВт и 2,4 МВт были измерены с помощью сканирования со скоростью 0,5 и 8 кадров в секунду , соответственно. Каждый ваттметр отличается. Пользователям потребуется определить оперативные длин волн и дискретизации для их индивидуальных ваттметр.

4. Иммунофлюоресценции, окрашивание процедуры

  1. анализ стренги перерыв индукции, если окрашивание.
    1. Исправить клетки с 3,7% формальдегида (осторожно) в фосфат буфер солевой раствор (PBS) для раствора формальдегида 10 мин аспирата и стирка 3 раза с PBS. Протокол может быть остановлен здесь, поместив PBS обратно на клетки и клетки могут храниться на 4 ° c до 1 недели.
      Предупреждение: Формальдегид токсичных и канцерогенных. Износ надлежащего личного защитного оборудования и распоряжаться токсичное вещество как указаниями институциональных экологического здоровья и безопасности процедур.
    2. Разрушения клеток с использованием 0,25% Тритон X-100 в PBS 10 мин при комнатной температуре (RT) и затем вымойте 3 раза с PBS.
    3. Блок - неспецифический антитела связывая путем инкубации на 30 мин в PBS, содержащей 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) на RT.
    4. Инкубировать с первичной monoclonal antibody против γH2AX и первичных Поликлональные антитела против 53BP-1 оба разбавленный жилой в PBS, содержащих BSA 1% за 1 час на RT и затем смывают 3 раза с PBS.
    5. Инкубировать клетки с Alexa 488 коза анти мыши и Alexa 546 коза анти кролика и разводят 1: 2000 в PBS, содержащих BSA 1% за 1 час на RT и затем смывают 3 раза с PBS.
    6. Пятно ядерной ДНК с 10 мг/мл раствора DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, осторожно) разбавленных 1: 5000 в PBS на 5 мин, или использование сопоставимых ядерной красителя, а затем вымойте 3 раза с PBS.
      Предупреждение: DAPI токсичных и мутагенными свойствами. Носите надлежащего личного защитного оборудования и распоряжаться токсичное вещество, по указанию институциональных экологического здоровья и безопасности процедур.
      7. Азид натрия
    7. место PBS или PBS + 0,1% (осторожно) обратно на окрашенных клеток. Протокол может быть остановлен здесь и клетки хранить при 4 ° c на несколько дней, или перейти к захвата изображений в разделе 5.
      ​ ОСТОРОЖНОСТЬЮ: азид натрия является токсичным. Носите надлежащего личного защитного оборудования и распоряжаться токсичных веществ, по указанию институциональных экологического здоровья и безопасности процедур.
  2. Анализ индукции базового поражений или ДНК аддукты, если окрашивание.
    1. Исправить и разрушения клеток в ледяной метанола (осторожно) для 20 мин при -20 ° с.
      Предупреждение: Метанол, токсичными и легковоспламеняющимися. Носите надлежащего личного защитного оборудования и распоряжаться токсичное вещество, по указанию институциональных экологического здоровья и безопасности процедур.
    2. Аспирационная methanol и позволяют образца до полного высыхания 15 мин протокол может быть остановлено здесь и сухие клетки, хранящиеся на уровне-20 ° c до 3 дней.
    3. Увлажняет клетки в PBS на 15 мин
    4. Denature ДНК, используя 2 N HCl (осторожно) 45 мин в RT и стирка 3 раза с PBS.
      Предупреждение: HCl коррозионные. Носите надлежащего личного защитного оборудования и распоряжаться коррозионные вещества, по указанию институциональных экологического здоровья и безопасности процедур.
    5. Нейтрализации рН 8,8 мм 50 Tris-HCl 5 мин следуют 3 стирок с PBS.
    6. Инкубировать клетки в блокирующем буфере сделаны с 5% нормальной козьего сыворотки и 0,1% тритон X-100 в PBS для 1 h на RT.
    7. Инкубировать с первичного антитела для 8-оксо 2´-deoxyguanosine (8-oxodG, 1: 400) или Циклобутан пиримидина димер (ДСП, 1:1, 000) в сыворотке блокирующем буфере козла за 1 час на RT, а затем вымыть 3 раза с PBS.
    8. Инкубации клеток с Alexa 488 коза анти мыши в соотношении 1: 2000 в козьего сыворотки блокирующем буфере 1 h на RT и мыть 3 раза с PBS.
    9. Пятно ядерной ДНК с помощью 1: 5000 DAPI (10 мг/мл) в PBS для 5 минут и 3 раза промойте PBS.
    10. При использовании патрон coverglass, место PBS или PBS + азид натрия 0,1% обратно на окрашенных клеток. Протокол может быть остановлен здесь и клетки хранить при 4 ° c на несколько дней, или перейти к захвата изображений в разделе 5.
    11. В качестве альтернативы, смонтировать клетки в среде предпочтительным монтажа, если дополнительные coverglass могут быть размещены на вершине культуры судна. После отверждения, смонтированные ячейки можно хранить при 4 ° c для длительных периодов времени.

5. Видеосъемка для экспериментов иммунофлюоресценции

  1. чистый coverglass нижней части культуры судна с этанолом и снова поместите ее на конфокального микроскопа. Убедитесь, что ориентация и позиции судна на сцене соответствует ориентации и позиции записаны, когда индуцированных повреждений. Обеспечения культуры судна для обеспечения оптимальной регистрации и обработки изображений.
  2. Найти ранее отображаемого поля с использованием метода регистрации выбран (описано в разделе 3.2).
    1. Для ручной регистрации с помощью coverglass с выгравированным сеткой, привнести сетки в фокус и найти определение знаков. Затем используйте записал XY координаты для поиска поврежденных клеток.
    2. Для автоматической регистрации на основе изображений, найдите функцию структурных, используемый в качестве ссылки на шаге 3.2.1 и затем выровнять текущее представление живой Микроскоп так близко к записанные изображения как можно скорее. После выравнивания, измерить текущее местоположение Этап микроскопа XY и сравнить его с XY местоположение исходного образа. Линейное расстояние между двумя точками определяет смещения X и Y. Применить это смещение каждого записанного место XY для идентификации поля изображения, содержащие облученных клеток. Эта функция СМЕЩ может быть автоматизированы в программном обеспечении управления микроскопом или выполняются вручную.
    3. Если не соответствующих регистрационных пунктов может быть идентифицирован, вручную найти клетки путем сканирования слайдов и фиксирующими элементами ранее определенных клеток.
  3. Получить изображения с использованием параметров соответствующих микроскоп для сбора всех окрашенных целей, включая образ brightfield (в разделе 2.3 и фокусировка в разделе 3.3). В представленных экспериментов, многоканальные изображения были собраны с использованием следующих лазерные линии возбуждения и флуорофоров: 405 нм (DAPI), 488 нм (Alexa 488 и передаваемых DIC brightfield) и 561 Нм (Alexa 546). Все лазеры проходят через один Акусто оптический перестраиваемый фильтр контроля передачи длина волны лазера и мощность.

6. Живой клетки анализа изображений набор флуоресцентных белков микро облученных сайты

  1. Открыть полученные изображения в приложении анализа изображения (то есть, элементы NIS или ImageJ). При необходимости, объединять изображения предварительного облучения с timelapse изображений для создания последовательности одного изображения до и после повреждения индукции. Пользователи могут показывать вербовки путем измерения изменений в интенсивности флуоресценции над районом облученного относительной интенсивности флуоресценции, измеряется через весь ядро (см. Результаты представитель Рисунок 1 B. ).
  2. Для каждой ячейки быть измерены, сначала сгенерировать ссылку ROI, который представляет ядро. Использовать алгоритм Бинаризация на флуоресцентные сигнал, содержащий пикселей, составляющих ядро, а затем преобразовать этот район в ROI. При необходимости, ROI можно вручную извлечь в использовании brightfield в качестве ссылки. Отрегулируйте ROI для обеспечения ядерной области покрыта точно ROI в течение времени и доклад среднее флуоресценции интенсивностью флуоресцентного сигнала в пределах этой ROI для каждого кадра.
  3. Для каждой ячейки быть измерены создать 6 x 6 пикселей ROI и поместите его повреждения рентабельность инвестиций для каждого кадра время курса. Это больше ROI в настоящее время ущерб ROI для анализа. Доклад средней интенсивности флуоресценции ROI для каждого кадра.
    Примечание: Большинство коммерческих программное обеспечение анализа изображений содержит модули для 2D объекта отслеживания, и существует ряд разработан пользователем макросов для ImageJ или Фиджи, которые облегчают процесс быстрее и более высокая пропускная способность (см. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Нормализовать интенсивности флуоресценции ROI Среднее повреждение к соответствующей ссылки ROI в каждом кадре timelapse. Здесь, интенсивность средняя ядерной флуоресценции используется в качестве ссылки ROI (см. Результаты представитель, рис. 1). Нормализация может выполняться путем вычитания средней ссылка интенсивности флуоресценции ROI от среднего повреждение интенсивности флуоресценции ROI, или путем деления средней ущерб ROI интенсивности флуоресценции ссылкой на средней интенсивности флуоресценции ROI.
    Примечание: Нормализация Отделом может привести к непредсказуемым результатам, если используется в ситуациях с очень низкого эталонными значениями интенсивности.
  5. Повторить для всех поврежденных клеток, а также по крайней мере два элемента управления, неповрежденных клеток. Управления ячейки результаты могут использоваться для дальнейшей нормализации, если требуется.
  6. Графа нормализованные значения интенсивности во времени, чтобы показать изменения в динамике набора как функция экспериментального лечения.

7. Изображение анализ набора белков, обнаруженных иммунофлюоресценции

  1. открыть до и после повреждения изображения в приложении анализа изображения. Доаварийной образы содержат того ущерба, который ROI(s) используется для микро облучения. Скопируйте ROI(s) и вставьте после повреждения изображений для выявления целевых ячеек.
  2. Генерировать 6 x 6 пикселей ROI для анализа белка вербовки и место этого ROI в месте повреждения ROI. Это больше ROI в настоящее время ущерб ROI для анализа. Доклад означает ущерб интенсивности флуоресценции ROI.
  3. Нормализовать интенсивности флуоресценции ROI Среднее повреждение к соответствующей ссылки ROI. Здесь, интенсивность средняя ядерной флуоресценции поврежденные клетки используется в качестве ссылки ROI (см. Результаты представитель, рис. 1). Создать ссылку ROI с помощью алгоритма Бинаризация DAPI сигнала для определения ядро и затем преобразовать этот район в ROI. О справочнике средней интенсивности флуоресценции ROI. Нормализация может выполняться путем вычитания средней ссылка интенсивности флуоресценции ROI от повреждений средней интенсивности флуоресценции ROI, или путем деления средней ущерб интенсивности флуоресценции ROI ссылкой на средней интенсивности флуоресценции ROI.
    Примечание: Нормализация Отделом может привести к непредсказуемым результатам, если используется в ситуациях с очень низкого эталонными значениями интенсивности.
  4. Повторить для всех поврежденных клеток и выполнять тот же анализ на клетки по крайней мере два элемента управления, как описано выше.
  5. Графа нормализованные значения интенсивности для каждое измеренное событие микро облучения на время, чтобы показать изменения в набор белков или типа повреждения ДНК как функция экспериментального лечения.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика индуцированных повреждений ДНК
Индукции базового поражений и Стрэнд перерывов зависит от дозы лазер применяется к выбранной ядерной области и клеточных микроокружения клеток модели используется7. Флуоресцентные белки плавленого для ремонта белков, таких как XRCC1, 53BP1, Ku70 или Rad51, обеспечивают полезную сингл и двойной нити перерыв маркеры для установления минимальной энергии, необходимой для видеть накопление флуоресцентный белок в ущерб ROI выше фон флуоресценции9,19,31. После того, как будут найдены условия, которые вызывают ответ, важно охарактеризовать смесь повреждения, вызванного этой определенной длины волны и дозы. Затухания дозы и длительности на длине волны используется может позволить пользователю свести к минимуму образование смесей сложных ущерб. Низкая лазерной доз в диапазоне UV-A были продемонстрированы производить преимущественно рабочего тормоза РСРТ и небольшое количество базовых поражений, подходящим для изучения SSBR и BER пути10,28. Увеличение дозы создает более сложные базовые поражений, окислительного и УФ-индуцированной и вызывает более значительное число DSBs7,10. Хотя индукции одного вида повреждений ДНК является желательным для рассмотрения конкретных путей восстановления ДНК, это более вероятно, что пользователи вызывающие смесь повреждений ДНК, с конкретным поражением как рабочего тормоза РСРТ, будучи гораздо чаще, чем базовый поражений или DSBs. Это похоже на смеси повреждения ДНК под воздействием химических веществ как перекись водорода (H2O2) или метил Метансульфонат (MMS)32. Пользователи должны знать, когда они сообщают результаты, которые повреждают смеси может произойти, и тщательного характеристика дозы и поражений на сайте индуцированных повреждений необходимо обеспечить воспроизводимость и сопоставимости их результатов.

В исследованиях микро облучения XRCC1-GFP часто используется как маркер для индукции базового поражений и рабочего тормоза РСРТ9,28. XRCC1 это эшафот белок, который играет важную роль в SSB ремонта (SSBR) и базовый иссечение ремонт (BER), а также участвует в других ремонт пути, как нуклеотида иссечение ремонт (NER)33,34,35 . Она играет важную координирующую роль в репарации ДНК, взаимодействующих с рядом ключевых белков, включая poly(ADP-ribose) полимеразы 1 (ПАРП-1), ДНК полимеразы β (Pol β) и ДНК лигаза III. Мы использовали XRCC1-GFP стабильно выражена в клетках Чо-K1 для определения лазер доз, необходимых для создания рабочего тормоза РСРТ и DSBs. Мы сначала определили минимальной дозы, необходимо побудить наблюдаемый набор XRCC1-GFP для каждой длины волны (рис. 1). Для волны 355 Нм 2 время выдержки s определенный ущерб ROI генерируется увеличение флуоресцентного сигнала в пределах этого ROI, указывающее индукции повреждения ДНК, что было обнаружено над фона (рис. 1А). Для 405 нм, 8 fps скорость сканирования необходимо сформировать наблюдаемый набор ущерб ROI (рис. 1А). Затем был увеличен дозы (10 s 355 Нм и 0,5 fps для 405 нм) для создания более интенсивным ущерб ROI (рис. 1А).

Набора и удержания XRCC1-GFP на сайте индуцированных повреждений был затем контролируется timelapse изображений. Удержание белка в месте повреждения ДНК может свидетельствовать о репарации ДНК продолжается, хотя диссоциация белка с сайта индуцированного повреждения часто считается маркера для завершения BER или SSBR. Однако там было без четких доказательств, связывающих диссоциации XRCC1 с лазерно индуцированным сайтов повреждения ДНК с завершением ремонта. Набор белков на сайт повреждения измеряется отчетности средней интенсивности флуоресцентного сигнала в пределах поврежденных ROI среднее флуоресцентные сигнал измеряется для всего ядро (рис. 1Б). Этот тип нормализации помогает колебания интенсивности адрес ядерной сигнал, хотя другие методы нормализации могут использоваться в зависимости от сотовой распределение протеина интереса. Здесь XRCC1 локализуется в отсеке ядерной, поэтому нормализации в ядерной области мер перераспределения сигнал повреждения ROI. Средней интенсивности флуоресценции Руа затем записывается для каждого изображения в timelapse, включая изображения до повреждения и графике как функцию времени (рис. 1C).

Затем мы далее охарактеризовал повреждений, вызванных двух отдельных лазерных доз для изучения формирования базы поражения ДНК. Во-первых формирование ДСП, громоздкие УФ индуцированные поражения, был исследован, иммунофлюоресценции как маркер для NER тип поражения (рисA). Затем окислительно индуцированных база lesion8-oxodG был исследован как маркер для BER тип поражения (рис. 2B). Никакого существенного увеличения в ДСП поражения были замечены на низкие дозы облучения для обеих длин волн (2 s 355 Нм и 8 fps для 405 нм), в то время как высокие дозы лечение в обоих диапазонах (10 s 355 Нм и 0,5 fps для 405 нм) показали значительное увеличение в люминесцентных сигнал, наблюдаемыми в ущерб ROI (рисA). Точечная CPD Руа означают интенсивности для каждого поврежденные клетки показывает неоднородность в ущерб образованию и обнаружения на длинах волн и дозах, указывающее, что низкий уровень поражения ДСП могут присутствовать в меньших дозах, но нагрузка не может быть значительно обнаружено до тех пор, пока применяется более высокие дозы. Рассеяния также свидетельствует о том, что неэффективность в обнаружения антител, которые могут ограничить точная количественная оценка ущерба смесей.

Это далее подтверждается в обнаружении окислительно индуцированных повреждений ДНК маркер 8-oxodG. Не ясно, увеличение флуоресцентного сигнала в ущерб ROI было отмечено для 8-oxodG длина волны лазера или дозы, используемой (рис. 2B). Антитела, используемая для этой работы в соответствии с предыдущей публикации9,10,36; следует, однако, отметить, что могут существовать ограничения в наблюдении за формирование 8-oxodG с антителами37,38. Второй маркер, как набор 8-Oxoguanine ДНК Glycosylase (OGG1), фермент, ответственный за удаление 8-oxodG с ДНК10рекомендуется также подтверждение отсутствия окислительно индуцированных повреждений. Мы не наблюдали OGG1 набора наших сайтов повреждения ДНК; Однако формирование низким уровнем окислительно индуцированных повреждений ДНК нельзя исключать полностью.

Наконец мы рассмотрели образование DSBs с использованием двух маркеров, γH2AX и 53BP-1, в selected лазерный доз иммунофлюоресценции (рис. 3 & 4). ΓH2AX обычно используется как метку разрыва нити, но его специфичности для DSBs была поставлена под сомнение в ряде докладов39,,40. Кроме того это событие фосфорилирование, которое распространяет от сайта перерыва Стрэнд, поэтому локализации сигнала разрыв нити может быть ограничен из-за этого распространения сигнала. Таким образом сочетание γH2AX с 53BP-1 позволяет для более точной оценки формирования ДГЖД в ущерб ROI.

Ответ γH2AX и 53BP-1 микро облучения является длина волны и зависит от дозы. Низкая доза (2 s) стимуляции на 355 Нм вызывает не ответ на 5 и 20 мин и слабых и переменной ответ облучения пост 10 мин (рис. 3А) для обоих маркеров. Высокие дозы (10 s) 355 Нм микро-облучения индуцирует увеличение флуоресцентного сигнала в ущерб ROI на 5, 10 и 20 мин пост облучения, уменьшается на 40 мин (рис. 3B). Эти результаты показывают, что тщательное титрования дозы 355 Нм необходима для сведения к минимуму кросс стимуляции ремонта путей, как продемонстрировано снижение обнаружение двойной нити перерыв маркер γH2AX раннего момента времени (< 20 мин) при низкой дозе применяется.

Подобные эксперименты были проведены с использованием как низкая (8 fps), так и высокие дозы (0,5 fps) 405 нм лазерной стимуляции (рис. 4). На этой длине волны значительные накопления интенсивности флуоресценции в ущерб ROI было отмечено для 53BP-1 и γH2AX независимо от прикладной дозы, указав, что эти дозы генерировать сложную смесь одноместные и двухместные стренги разрывов почти немедленно после индукции повреждения ДНК (рис. 4). Кроме того высокие дозы 405 нм показывают увеличение Пан ядерных γH2AX окрашивание в течение 10 мин ущерб индукции (Рисунок 4B, внизу), затрудняет обнаружение повреждения Руа доклада, хотя накопление 53BP-1 больше содержащиеся в ущерб ROI.

Эти результаты ясно продемонстрировать, что 405 нм микро облучения не подходит для наблюдения за SSBR или BER, и что несколько маркеров ДНК аддукты и прядь перерывы должны использоваться для полностью характеризуют индуцированных повреждений и ДНК ремонт ответы.

Доза зависит от изменения набора и удержания XRCC1-GFP
После того, как была охарактеризована индуцированных повреждений ДНК, лазер микро облучения может быть идеальной платформой для изучения динамики протеинов ремонта ДНК. Удержание и диссоциации кинетика XRCC1-GFP показывает зависимость от дозы (рис. 1), который не является неожиданным индукции различных повреждений смеси определяется каждой длины волны. Высокие дозы облучения (10 s и 0,5 fps) показывают выше интенсивность набора XRCC1-GFP относительно более низких доз и больше удержания XRCC1-ГФП в месте повреждения течение времени 20 мин (рис. 1C). Это означает, что повреждения ДНК, созданный в более высоких дозах для 355 и 405 нм, скорее всего не решены в ходе эксперимента, который согласуется с внешний вид и удержания DSB маркеров, γH2AX и 53BP-1 (3 цифры & 4 ).

Интересно, что более низкие дозы повреждения (2 s и 8 fps) показывают быстрого набора XRCC1-ГФП в места повреждения и диссоциация XRCC1-ГФП в течение экспериментального время предварительного облучения уровней (рис. 1C). Без полной характеристики ущерб смесь это может привести к выводу, что рабочего тормоза РСРТ и базовый поражения полностью решены с помощью этих вредных условий. Однако наличие γH2AX и 53BP-1 в 40 мин для 355 Нм и в 5 мин для 405 нм может привести к различным толкованиям. Для 355 Нм 2 s дозы, ущерб может быть сочетание преимущественно рабочего тормоза РСРТ, поэтому внешний вид меток ДГЖД в 40 мин может указывать, что некоторые неустраненный поражения может приводит к DSBs или отремонтированы DSBs порожденных этой энергии в масштабе больше времени. Время шкала различия между SSBR и DSB ремонт были ранее сообщалось28,,4142. Аналогичным образом, 405 Нм при низкой дозе (8 fps) диссоциации может указывать на низкий уровень рабочего тормоза РСРТ или кластеризации рабочего тормоза РСРТ, которые быстро преобразуются в DSBs, которая была отмечена высокой ущерба микро облучения и других ДНК, повреждающих агентов ранее43, 44 , 45.

Вместе эти результаты подчеркивают важность характеризующие индуцированных повреждений смеси и использованием нескольких ДНК ремонт белков и маркеры для интерпретации набора и удержания ДНК ремонт белков на участках индуцированных повреждений.

figure-results-1
Рисунок 1 . Лазер микро облучение вызывает набор XRCC1-GFP. 
(A) Чо-K1 клетки стабильно выражения XRCC1-ГФП были облученных и образы до и сразу же после повреждения индукции. Стрелки указывают расположение дозы микро облучения и шкалы бар-10 мкм. (B) набора измеряется путем определения средней интенсивности флуоресценции в ущерб ROI и нормализации в средней интенсивности флуоресценции всего ядра. (C) динамики найма могут быть измерены для каждого timelapse изображения. Графики являются представитель двух независимых экспериментов с погрешностей, представляющие SEM (n = 24). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2 . Лазер микро облучения индуцирует повреждение нуклеотидов. 
Чо-K1 клетки подвергаются лазерной микро облучения и фиксированной сразу после повреждения индукции. Иммунофлюоресценции была выполнена для обнаружения ДСП и аддукты 8-oxodG. (A) top, точечная ROI среднее флуоресценции, интенсивности наблюдается в поврежденных клеток после окрашивания ДСП. Внизу, представитель изображения ДСП окрашивания. Стрелки указывают местоположение микро-облучения и линейки шкалы — 10 мкм (n = 12). (B) представитель изображений для 8-oxodG окраски. Стрелкиуказать расположение микро-облучения и линейки шкалы-10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3 . Маркеры разрыв двойной нити ДНК реагировать 355 Нм микро облучения доза зависимым образом. 
Чо-K1 клетки были подвергнуты микро облучения и фиксируется на время указано после стимуляции точек. Иммунофлюоресценции для DSB маркеры γH2AX и 53BP-1 была выполнена. (A) точечная нормализованных повреждения ROI означает интенсивностью флюоресценции измеряется для неповрежденных и поврежденных клеток. Планки погрешностей, представитель SEM (n = 12). (B) представитель изображений для γH2AX и 53BP-1 пятнать. Стрелки указывают местоположение микро-облучения и линейки шкалы — 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4. Маркеры разрыв двойной нити ДНК энергично реагировать на 405 нм микро облучение.
Чо-K1 клетки были подвергнуты микро облучения и фиксируется на время стимуляции точки указанной должности. Иммунофлюоресценции для DSB маркеры γH2AX и 53BP-1. (A) точечная нормализованных повреждения ROI означает интенсивностью флюоресценции измеряется для неповрежденных и поврежденных клеток. Планки погрешностей, представитель SEM (n = 12). (B) представитель изображений для γH2AX и 53BP-1 пятнать. Стрелки указывают местоположение микро-облучения и линейки шкалы — 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование условий, описанных здесь, любой Конфокальный микроскоп с UV-A или 405 нм лазер, интегрированные изготовителем или добавлены конечным пользователем, могут вызвать повреждения ДНК в ядре клетки и позволяют набор ДНК ремонт белков на сайт индуцированных повреждений ДНК контролироваться. Однако, как отмечено в протоколе и представитель результаты, выбор длины волны, применяется сила, и квалификация ущерба все важные вопросы, которые должны быть решены прежде пользователем с целью изучения конкретных ДНК ремонт пути. Кроме того существуют другие соображения в экспериментальный дизайн, который также должен быть рассмотрен пользователей.

Для того, чтобы контролировать поведение белка в живые клетки пост микро облучения, дневно обозначенные белков должен быть создан. Наличие широкого круга флуоресцентных белков, которые могут быть разделены спектрально предлагает инструменты для создания протеин сплавливания, которые могут быть использованы для характеризующие клеточных реакций к индукции повреждения ДНК. Переходных трансфекции флуоресцентных белков интерес позволяет для быстрого скрининга пагубных условий, мутации или даже ингибиторов, в то время как стабильно transfected клеток предлагают больший контроль над уровни выражения и позволяют для других биохимических составы должны быть выполнены, проверка результатов микро облучения. Спектрально собственный флуоресцентные белки также могут быть использованы в той же ячейке для отслеживания взаимодействия белков внутри же пути или в разных пути. Флуоресцентные белки также устранить необходимость для специфических антител для каждого протеина интереса и позволяют живой клетки мониторинг поведения белок для длительных периодов времени после индукции повреждения.

Однако использование флуоресцентных белков также имеет недостатки. Без генетических особенностей несовершенными в белки интерес эндогенного белки будут конкурировать с дневно тегами белков. Спряжение флуоресцентные тега N или C конечной белка может изменять сворачивание белков, препятствуют ключевой белок белковых взаимодействий или блокировать транслокации сигналов; изменение функции и потенциально влияющих на динамику найма. Эти эффекты были продемонстрированы в ряде докладов, где immunofluorescent окрашивание продемонстрировали резко различных набора и удержания раза эндогенного белка в ущерб сайт28. Использование переходных трансфекции или стабильной клонов может также изменить ответ, наблюдается, обычно через изменения в уровнях выражения протеина. Кроме того использование нескольких флуоресцентных белков в одном эксперименте также может изменить динамику найма, если не являются хорошо достижение равновесного уровня уровни белка или найма большего дневно тегами белка блокирует вербовки других белков . Наконец флуоресцентные белки могут выступать в качестве слабой информированности агентов, увеличивая формирования реактивнооксигенных видов и потенциально изменяя ДНК повреждения смеси индуцированных46,47. Несмотря на эти недостатки флуоресцентные белки предлагают целый ряд отличительных преимуществ в изучении ДНК ремонт с микро облучения, и если пользователи включать соответствующие элементы управления, такие как характеристика повреждений, описанных здесь, они могут обеспечить новое понимание в ущерб ответ и белок белковых взаимодействий3.

Если не требуется живых клеток, иммунофлюоресценции может использоваться для наблюдения за ответ индуцированных повреждений. Фиксируя клетки в определенное время после повреждения индукции и окрашивание с антител специфических для белков и поражения интерес, статические снимки повреждения индукции и набора и удержания ремонта, что белки могут быть построены. Антител может использоваться для наблюдения за набор нескольких протеинов интереса и/или столб-поступательные изменения, вызванные ответ повреждения ДНК. Использование иммунофлюоресценции устраняет необходимость для флуоресцентных белков и позволяет эндогенного белка поведение, чтобы быть изучены. Однако этот метод тоже имеет свои недостатки. Весьма специфические антитела являются необходимыми, и permeabilization и блокировки процедуры должны быть оптимизированы, чтобы разрешить для обнаружения набора с достаточной интенсивностью сигнала. Фиксирующие процедуры не мгновенно, а это физическое ограничение ограничивает временное разрешение этого подхода. Отображение на сайте повреждения индукции поэтому клетки могут быть повторно расположен после окрашивания также может представлять серьезные проблемы. Конфокальный микроскоп, используемые в этой работе позволяет для регистрации на основе образа, как описано выше, поэтому поврежденные клетки могут быть перемещены с высокой точностью. Если этап регистрации или травления coverglass не доступен, время инвестиций, занимающихся перемещения клетки без стадии регистрации, в сочетании с присущие задержка между ущерб индукции и фотосъемка вербовки, может сделать иммунофлуоресценции непривлекательным для некоторых пользователей. Однако наиболее точных и полных микро облучения экспериментальные проекты будут включать эти виды подходов параллельно с использованием флуоресцентных белков, как описано в представленных протокол.

Здесь как живых клеток, так и иммунофлюоресценции используется для демонстрации полезности лазерной микро облучения. Immunofluorescent окрашивание позволяет нам точно проанализировать смесь создан повреждения ДНК и набор белков, вызванных каждой мощности лазера, которые позволяют нам лучше интерпретировать наблюдаемые изменения в набор и удержание XRCC1-GFP. На основе этих результатов, использование 405 нм лазеры должно быть ограничено для изучения белков Бер и SSBR. Кроме того оптимальный экспериментальный дизайн будет включать измерения мощности после цели, полный урон смесь характеристик для каждой ячейки строки используется и проверки набора и удержания, наблюдается в дневно отмеченных белки с иммунофлюоресценции. Очевидно оборудование, время и стоимость соображений может сделать эти оптимальные экспериментальные проекты невозможным для некоторых пользователей. Однако это демонстрирует важность каждого из этих элементов, а пользователи должны иметь эти соображения в виду при начале экспериментов микро облучения.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Samuel H. Wilson в Национальный институт окружающей среды медицинских наук для клеточных линий, используемых в этой работе.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Nikon A1rsiNikon
NIS Elements ЛазерNikon
355 нм ИсточникPicoQuant VisUVИсточник излучения
Гальванометр фотоактивация минисканерBruker
Микроскоп слайдовый фотодиодный датчик мощностиTHORLabsS170C
Волоконный фотодиодный датчик мощностиTHORLabsS150C
Цифровой портативный измеритель оптической мощности и энергииTHORLabsPM100D
CHO-K1От доктора Сэмюэля Х. Уилсона, NIEHS
Минимальные необходимые средыГиклонSH3026501
Фетальная бычья сывороткаAtlanta biologicalsS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus трансфекция11407
GeneticinThermoFisher10131035
4-х камерное покровное стеклоThermoFisher155382
8-камерное покровное стеклоThermoFisher155409
Anti 53BP-1NovusNB100304
Антифосфо-гистон H2AX Millipore05-636-I
Антициклобутан пиримидинаCosmo Bio клонCAC-NM-DND-001
Анти 8-оксо-2&aute;-дезоксигуанозин Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 козий анти-мышьThermoFisherA11029
Alexa 546 козий анти-кроликThermoFisherA11010
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)ThermoFisherR37606Осторожно, токсичный!
Фосфатно-солевой буферThermoFisher0780
Нормальная козья сывороткаThermoFisher31873
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Jackson Immuno Research001-000-162
37% ФормальдегидThermoFisher9311Осторожно, токсичный!
ЭтанолDecon Labs2716
МетанолVWRBDH1135Осторожно, токсичен!
HClFisherSA49
Азид натрияSigma-AldrichS2002Осторожно, токсичен!
Трис гидрохлоридAmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Программное обеспечение излучения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luijsterburg, M. S., et al. Stochastic and reversible assembly of a multiprotein DNA repair complex ensures accurate target site recognition and efficient repair. J Cell Biol. 189 (3), 445-463 (2010).
  2. Vermeulen, W. Dynamics of mammalian NER proteins. DNA Repair (Amst). 10 (7), 760-771 (2011).
  3. Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
  4. Cremer, C., Cremer, T., Zorn, C., Schoeller, L. Effects of laser uv-microirradiation (lambda = 2573 A) on proliferation of Chinese hamster cells. Radiat Res. 66 (1), 106-121 (1976).
  5. Cremer, C., Cremer, T., Fukuda, M., Nakanishi, K. Detection of laser--UV microirradiation-induced DNA photolesions by immunofluorescent staining. Hum Genet. 54 (1), 107-110 (1980).
  6. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J Microsc. 209, (Pt 2) 71-75 (2003).
  7. Kielbassa, C., Roza, L., Epe, B. Wavelength dependence of oxidative DNA damage induced by UV and visible light. Carcinogenesis. 18 (4), 811-816 (1997).
  8. Kielbassa, C., Epe, B. DNA damage induced by ultraviolet and visible light and its wavelength dependence. Methods Enzymol. 319, 436-445 (2000).
  9. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), 68(2009).
  10. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  11. Krasin, F., Hutchinson, F. Strand breaks and alkali-labile bonds induced by ultraviolet light in DNA with 5-bromouracil in vivo. Biophys J. 24 (3), 657-664 (1978).
  12. Krasin, F., Hutchinson, F. Double-strand breaks from single photochemical events in DNA containing 5-bromouracil. Biophys J. 24 (3), 645-656 (1978).
  13. Rosenstein, B. S., Setlow, R. B., Ahmed, F. E. Use of the dye Hoechst 33258 in a modification of the bromodeoxyuridine photolysis technique for the analysis of DNA repair. Photochem Photobiol. 31 (3), 215-222 (1980).
  14. Cremer, T., Peterson, S. P., Cremer, C., Berns, M. W. Laser microirradiation of Chinese hamster cells at wavelength 365 nm: effects of psoralen and caffeine. Radiat Res. 85 (3), 529-543 (1981).
  15. Limoli, C. L., Ward, J. F. A new method for introducing double-strand breaks into cellular DNA. Radiat Res. 134 (2), 160-169 (1993).
  16. Carlsson, K., Mossberg, K., Helm, P. J., Philip, J. Use of UV excitation in confocal laser scanning fluorescence microscopy. Micron and Microscopica Acta. 23 (4), 413-428 (1992).
  17. Stelzer, E. H. K., Haar, F. -M. Confocal Microscopy: Recent Developments. Advances in Imaging and Electron Physics. 106, 293-345 (1999).
  18. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol. 146 (5), 905-916 (1999).
  19. Tashiro, S., Walter, J., Shinohara, A., Kamada, N., Cremer, T. Rad51 accumulation at sites of DNA damage and in postreplicative chromatin. J Cell Biol. 150 (2), 283-291 (2000).
  20. Gassman, N. R., Stefanick, D. F., Kedar, P. S., Horton, J. K., Wilson, S. H. Hyperactivation of PARP triggers nonhomologous end-joining in repair-deficient mouse fibroblasts. PLoS One. 7 (11), 49301(2012).
  21. Bolin, C., et al. The impact of cyclin-dependent kinase 5 depletion on poly(ADP-ribose) polymerase activity and responses to radiation. Cell Mol Life Sci. 69 (6), 951-962 (2012).
  22. Godon, C., et al. PARP inhibition versus PARP-1 silencing: different outcomes in terms of single-strand break repair and radiation susceptibility. Nucleic Acids Res. 36 (13), 4454-4464 (2008).
  23. Hanssen-Bauer, A., et al. XRCC1 coordinates disparate responses and multiprotein repair complexes depending on the nature and context of the DNA damage. Environ Mol Mutagen. 52 (8), 623-635 (2011).
  24. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Res. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  25. Mortusewicz, O., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Spatiotemporal dynamics of regulatory protein recruitment at DNA damage sites. J Cell Biochem. 104 (5), 1562-1569 (2008).
  26. Mortusewicz, O., Rothbauer, U., Cardoso, M. C., Leonhardt, H. Differential recruitment of DNA Ligase I and III to DNA repair sites. Nucleic Acids Res. 34 (12), 3523-3532 (2006).
  27. Solarczyk, K. J., Zarębski, M., Dobrucki, J. W. Inducing local DNA damage by visible light to study chromatin repair. DNA Repair (Amst). 11 (12), 996-1002 (2012).
  28. Gassman, N. R., Wilson, S. H. Micro-irradiation tools to visualize base excision repair and single-strand break repair. DNA Repair (Amst). 31, 52-63 (2015).
  29. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O'Neill, P. Use of near infrared femtosecond lasers as sub-micron radiation microbeam for cell DNA damage and repair studies. Mutat Res. 704 (1-3), 38-44 (2010).
  30. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135(2013).
  31. Lan, L., et al. Accumulation of Werner protein at DNA double-strand breaks in human cells. J Cell Sci. 118, Pt 18 4153-4162 (2005).
  32. Salmon, T. B., Evert, B. A., Song, B., Doetsch, P. W. Biological consequences of oxidative stress-induced DNA damage in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 32 (12), 3712-3723 (2004).
  33. Caldecott, K. W. DNA single-strand break repair. Exp Cell Res. 329 (1), 2-8 (2014).
  34. London, R. E. The structural basis of XRCC1-mediated DNA repair. DNA Repair (Amst). 30, 90-103 (2015).
  35. Moser, J., et al. Sealing of chromosomal DNA nicks during nucleotide excision repair requires XRCC1 and DNA ligase III alpha in a cell-cycle-specific manner. Mol Cell. 27 (2), 311-323 (2007).
  36. Campalans, A., et al. Distinct spatiotemporal patterns and PARP dependence of XRCC1 recruitment to single-strand break and base excision repair. Nucleic Acids Res. 41 (5), 3115-3129 (2013).
  37. Cooke, M. S., Lunec, J. Immunochemical detection of oxidative DNA damage. Vol. I. , World Scientific. 275-293 (2003).
  38. Rossner, P., Sram, R. J. Immunochemical detection of oxidatively damaged DNA. Free Radic Res. 46 (4), 492-522 (2012).
  39. Cleaver, J. E., Feeney, L., Revet, I. Phosphorylated H2Ax is not an unambiguous marker for DNA double-strand breaks. Cell Cycle. 10 (19), 3223-3224 (2011).
  40. Rybak, P., et al. Low level phosphorylation of histone H2AX on serine 139 (γH2AX) is not associated with DNA double-strand breaks. Oncotarget. 7 (31), 49574-49587 (2016).
  41. Haince, J. F., et al. PARP1-dependent kinetics of recruitment of MRE11 and NBS1 proteins to multiple DNA damage sites. J Biol Chem. 283 (2), 1197-1208 (2008).
  42. Caldecott, K. W. Single-strand break repair and genetic disease. Nat Rev Genet. 9 (8), 619-631 (2008).
  43. Lomax, M. E., Gulston, M. K., O'Neill, P. Chemical aspects of clustered DNA damage induction by ionising radiation. Radiat Prot Dosimetry. 99 (1-4), 63-68 (2002).
  44. Ma, W., Westmoreland, J. W., Gordenin, D. A., Resnick, M. A. Alkylation base damage is converted into repairable double-strand breaks and complex intermediates in G2 cells lacking AP endonuclease. PLoS Genet. 7 (4), 1002059(2011).
  45. Siddiqi, M. A., Bothe, E. Single- and double-strand break formation in DNA irradiated in aqueous solution: dependence on dose and OH radical scavenger concentration. Radiat Res. 112 (3), 449-463 (1987).
  46. Sano, Y., Watanabe, W., Matsunaga, S. Chromophore-assisted laser inactivation--towards a spatiotemporal-functional analysis of proteins, and the ablation of chromatin, organelle and cell function. J Cell Sci. 127, (Pt 8) 1621-1629 (2014).
  47. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biol. 2, 368-376 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

XRCC1 GFP355405

Похожие статьи