Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны

8.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/56273

⸱

8 октября 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает эффективный способ контроля за сохранение клеток и накопление жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) far-red флуоресценции маркировки в мышиной модели коленного остеоартрита (КОА) через Внутрисуставных инъекций (IA).

Аннотация

Чтобы поддерживать клиническое применение жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSC) терапии для коленного остеоартрита (КОА), мы изучили эффективность клеток сохранение и накопление haMSCs в животных моделях. Мы продемонстрировали метод для обозначения клеточной мембраны haMSCs с липофильных флуоресцентных красителей. Впоследствии Внутрисуставных инъекций помечены клетки крыс с хирургическим индуцированных KOA контролируется динамически в vivo imaging системы. Мы заняты липофильных carbocyanines сделал (ДППК18 (5)), far-red флуоресцентные аналоговый Dil (диалкилкарбоцианины), которые использовали красный лазер, чтобы избежать возбуждения естественный зеленый аутофлюоресценция от окружающих тканей. Кроме того красный смещается выбросов спектры допустимое глубокие ткани изображений в живых животных и маркировки процедура вызвала не цитотоксических эффектов или функциональные повреждения haMSCs. Такой подход было показано, быть методом эффективного отслеживания для haMSCs в мышиной модели KOA. Применение этого метода может также использоваться для определения оптимального управления маршрут и дозировка MSCs из других источников в доклинических исследований.

Введение

Коленного остеоартрита (КОА) является результатом потери суставного хряща и прогрессирующим воспалением, который стал основным хронических заболеваний у пожилых людей во всем мире1дегенеративные расстройства. Однако текущий терапии с использованием противовоспалительных препаратов, физической добавки и хирургических процедур может обеспечить лишь временное облегчение для симптоматического боли2.

Жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) стали многообещающим регенеративной средство для коленного остеоартрита, ввиду их Multipotent с дифференциации, потенциал для регенерации хряща и иммуномодулирующие свойства3, 4. По сравнению с фармакологическими маршрутов для изучения механизмов действий в естественных условиях, отслеживание жить haMSCs в небольших животных моделях KOA поучительно в настоящее время установить обоснование и целесообразности haMSC терапии до клинического применения. Для доклинических испытаний, медиальной meniscectomy (мм) дестабилизирует механической нагрузки совместной побудить KOA в крыс, которая обеспечивает относительно осуществимости модель с последовательной воспроизводимость5. Начала KOA индуцированных мм раньше чем передней крестообразной связки перерезка отдельно или в сочетании с частичным медиальный meniscectomy6. Таким образом долгосрочного взаимодействия между вводят haMSCs с патологическим микроокружения KOA часто оцениваются в крыс, вызванных мм7,8.

Хотя Терапевтическая эффективность haMSCs был широко сообщалось, соответствующие знания на сохранение в vivo имплантированных haMSCs через Внутрисуставных инъекций (IA) является дефицитных9,10. Таким образом были разработаны различные методы клеточной маркировки, включая immunohistology11, Люцифераза12, Зеленый флуоресцирующий белок13 трансфекции, оксид железа, маркировки для магнитно-резонансная томография (МРТ)14 и многочисленные люминесцентные клеток красители8,,1516. По сравнению с трудоемкой гистология анализы, в естественных условиях неинвазивной визуализации использует оптические устройства для обнаружения реального времени распределение и динамика клеток, помечены флуоресцентные сигналов10,17. Для функциональной живой клетки изображений, cytocompatible люминесцентные маркировки — сложные отслеживания радиоактивных бесплатно техника раскрыть клеточной деятельности после трансплантации стволовых клеток18. Кроме того многоцветный липофильных флуоресцентных красителей обладают преимуществами над амино реактивной гидрофильные красителей или флуоресцентных белков, включая их Улучшенная ячейка проницаемость и расширенной флуоресценции квантовой урожайности19.

Таким образом, здесь включены протоколы используют красный лазер для возбуждения клеток, помечены липофильных carbocyanines сделал (ДППК18(5)), который является far-red флуоресцентные Дил (диалкилкарбоцианины) аналоговый20. Красный смещается возбуждения и выбросов спектры избегает вмешательства autofluorescent и позволяет глубоко ткани изображений в течение длительного периода времени в живых животных8. Этот метод отслеживания-клеток в vivo помечены сделал действителен для мониторинга пересаженные стволовые клетки, такие как haMSCs, в моделях животных, которая необходима для понимания и улучшения текущей восстановительной терапии стволовой клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

процедур с участием животных темы были утверждены местных институциональных животное уход и Комитет по этике с целью свести к минимуму страдания животных. Следующий протокол был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в девятой Шанхая ’ больница связанных Шанхай JiaoTong University School of Medicine с протоколом s номер [2017] 063.

1. Создание модели артроз колена крыса Surgically-Induced

  1. для этой хирургической процедуры, использовать 8-12 недельных самцов крыс Sprague-Dawley (SD) с весом тела между 250 и 300 г.
  2. Анестезировать животных с tiletamine 40 мг/кг и zolazepam 40 мг/кг через внутримышечного.
  3. Место животного в левой боковой позиции на сцене с подогревом. Бритье тщательно правого колена с бритвой. Дезинфекция хирургические области с 10% providone йод раствор, затем на 70% этиловом спирте, повторить еще два раза и затем краски с 10% раствор providone йода и охватывают области нехирургических с хирургической pad.
  4. С помощью хирургического скальпеля, сделать 2 см разрез сбоку вдоль коленного сухожилия подвергать jointcapsules.
  5. Использовать хирургический скальпель трансектных медиальной коллатеральной связки. Отражать мениска к бедренной кости.
  6. Капельно стерильного 0,9% раствора хлорида натрия на поверхности суставного хряща в ходе операции для предотвращения высыхания хряща.
  7. Захватить медиального мениска с щипцами и прорезать мениска в самом узком месте от голени вложение с помощью скальпеля ( рис. 1A). Избегайте, ранив хряща.
  8. Закройте суставной капсулы с рассасывающиеся шовные 4-0.
  9. Мониторинг хирургические крысы до тех пор, пока они восстановить сознание.
  10. 20 мг/кг гентамицина для предотвращения инфекции и бупренорфина 0,05 мг/кг через внутримышечный путь для облегчения боли после операции вставки.
  11. Поддерживать крыс в контролируемой температурой животных фонда под свет/темно цикл 12 h 3-8 недель до начала KOA. Животных по-прежнему получать боль лекарства, включая но не ограничиваясь бупренорфин (0,05 мг/кг, и.м.) и гентамицин (20 мг/кг, и.м.), если боль симптомы сохраняются.

2. Гистология оценки крыса KOA модель

  1. жертву крыс с чрезмерным CO 2 ингаляции (добавить скорость заполнения около 30% от объема камеры в минуту с двуокиси углерода в существующих воздух в камере, чтобы сделать животных бессознательного в течение 2-3 мин поток поддерживать CO2 менее 1 мин после дыхание перестает.) в указано время точек (представитель результаты показываются в 8 недель KOA индукции от 3 до 8 недель) после хирургии.
  2. рассечения кожи и мышц вокруг коленных суставов и отрезали коленных суставов с помощью скальпеля.
  3. Исправить коленных суставов в параформальдегида 4% (PFA) для 3 дней при комнатной температуре. После этого, известь образцы в 20% Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) около 4 недель при температуре 4 ° C и измените ЭДТА каждые 3 дня.
    Предупреждение: Параформальдегида токсичных, носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), таких как перчатки и очки.
  4. Дигидрат образцы с использованием автоматического ткани процессора. Установите в меню, чтобы начать флеш цикла следующим образом: 70% этиловом спирте в течение 1 ч; затем 80% этанола и этанола 95% за 1 ч соответственно; последовали 2 циклов 100% этанола за 1 ч; Впоследствии, ксилол дважды за 1 час каждый раз и парафиновые 3 раза на 58 ° C за 1 час каждый раз.
    Предупреждение: Ксилол токсичных, так что носить соответствующие средства индивидуальной защиты, как перчатки и очки.
    Примечание: При необходимости, использовать Coplin банок для ручной обезвоживания с же настройки как процессор автоматического ткани.
  5. Место медиальной аспект нетронутыми совместных лицом вниз и вставлять его в блоке парафина с ткани, встроенных в центр.
    Примечание: При необходимости, использовать щипцы для внедрения образцы в парафин блок вручную.
  6. Начинают сократить 5 мкм сагиттальной секций от медиального края шва для 30 мкм интервалов с 2 последовательных секций микротом роторный.
  7. Монтировать разделы на стеклянных вставках и deparaffinize слайды в ксилоле. Между 2 последовательных секций, пятно один слайд с применением окрасок гематоксилин & эозином (H & E) пятная: 0.1% гематоксилином 15 мин, 1% раствор уксусной кислоты для 10 s и 0,5% эозина за 10 мин. И пятно другой слайд с Safranin O/Fast зеленой окраски: 0.1% гематоксилином 15 мин, 0,02% быстро зеленый 3 мин, 1% раствор уксусной кислоты для 10 s и 0,1% Safranin O на 3 мин
    Предупреждение: Ксилол токсичных, носить соответствующие средства индивидуальной защиты, например, перчатки, очки.
  8. Оценка окрашенных слайды с помощью системы оценки гистопатология международного общества артроз исследований (OARSI) в крыс 6.

3. Маркировки человека мезенхимальных стволовых клеток с флуоресцентных красителей сделал

  1. подготовить сделал клеток маркировки решение в 100% этанола в концентрации 1 мм. Защиты клетки маркировки решение от света и хранить его при комнатной температуре в течение 6 месяцев.
  2. Растут haMSCs со стандартной ячейки культуры процедурами в Дульбекко ' s изменение орел ' s среднего (DMEM) дополнены 1% пенициллина и стрептомицина и 10% плода телячьей сыворотки (FCS) в чашку Петри 10 см.
  3. Отсоединение haMSCs трипсином 2 мл 0,25% с 1 мм слияния до примерно 80% ЭДТА.
  4. Нейтрализовать трипсина с 4 мл питательной среды и спина клетки на 800 g x 3 мин при комнатной температуре.
  5. Приостановить клетки на плотность составляет 1 x 10 6 клеток/мл в 5 мл сыворотки свободной культуры среднего.
  6. Этикетка клетки, добавляя 50 мкл сделал клеток маркировки решение в 5 мл сыворотки свободной культуры среднего при 37 ° C 50 мин
  7. Спиновые помечены клетки на 800 x g на 3 мин
  8. Мыть клетки, два раза с 5 мл буфера фосфатный (PBS) на 800 x г за 3 мин.
  9. Проверить помечены haMSCs, используя флуоресцентный микроскоп с набором фильтров Cy5.
  10. Подсчитать ячейки с Трипановый синий окрашивание и получить 2,5 х 10 6 жизнеспособных клеток в 100 мкл PBS для инъекций.

4. В естественных условиях Флуоресцентный Imaging на трек haMSCs

  1. через восемь недель после операции (шаг 1), анестезировать KOA крыс внутримышечно по 25 мг/кг tiletamine и 25 мг/кг zolazepam.
  2. Бритья правого колена тщательно с бритвой подвергать общей зоне. Лечить области совместного с 70% этанол.
  3. С помощью иглы шприца 26 G, придать 2,5 х 10 6 помечены клетки, приостановлено в 100 мкл PBS в центре области треугольник, образованный стороне медиальной связки надколенника, медиального мыщелка бедренной кости и медиального мыщелка большеберцовой кости ( Рисунок 1B).
  4. Открыть изображений программное обеспечение и инициализировать биолюминесценции в vivo изображений системы.
  5. Позиция крыс в Супин позиции в Центральной сцене тепловизионные системы и закрыть дверь камеры.
  6. Проверить " флуоресцентный " флажок и выберите флуоресцентный фильтр задает 640 Нм для возбуждения и 680 нм для выбросов ( рис. 2A).
  7. Выберите поле зрения D. набор пикселей биннинга средний (8), F/Stop 2 и воздействия времени для авто. Поддержание оптимального время экспозиции, последовательно получить сопоставимые результаты через всего исследования ( рис. 2A).
  8. Удаление животное от стадии и монитор для восстановления от анестезии.
    Примечание: Место животных на грелку покрыты 2-3 слоя полотенца.
  9. Выбор единиц лучистого эффективности для измерения флуоресценции ( рис. 2B). Выберите регионы интереса (ROI) для анализа и количественной оценки флуоресцентные сигналы от каждого изображения ( рис. 2 c).
  10. Повторить процедуру в vivo изображений для каждого крыса последовательно учиться haMSCs продольной удержания в совместном.
    Примечание: Мы предлагаем изображений животных ' флуоресцентные сигналы в естественных условиях тепловизионной системой каждые два дня в течение первой недели после инъекции и один раз каждую неделю до тех пор, пока сигнал не может быть обнаружен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Чтобы побудить KOA модель, мм была исполнена в правом коленном суставе SD крыс (рис. 3). Восемь недель после хирургической операции, крысы были принесены в жертву и последовательный разделы коленных суставов были оценены с обеих H & Е и Safranin O/Fast зеленой окраски (рис. 4). Для H & E окрашивание, поверхность суставного хряща выставлены грубее границы в хирургии коленях чем нормальный совместное без хирургического вмеш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Прежде чем мы можем принести регенеративной стволовых клеток лечение для Коа из скамейке в постели срочно необходимы стандарты безопасности и накопление исследования стволовых клеток. Однако среды патологических заболеваний играет важную роль в сохранение и накопление пересаженных haMSCs10. Недавно наша группа продемонстрировала, что внутрисуставные инъекции haMSCs дольше сохраняются в среде патологических KOA чем сделали инъекции при нормальных условиях8. Вполне возможно, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Meng Li, Минь Хао и Вэнь Ван являются нынешние работники и держатели опционов группы клеточной биологии (Nasdaq: CBMG). Другие авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Настоящее исследование было поддержано Шанхай инновационного финансирования (1402H 294300) при поддержке науки и технологии Комиссии из Шанхая муниципалитета (CN) для Вэнь Вана. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Гуандун Чжоу (национальные ткани инженерных центр Китая) за его техническую помощь и научные рекомендации для этой рукописи. Мы также хотели бы поблагодарить г-н Huitang ся (девятого Шанхая больница) за его помощь в животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Matrx VMR система для анестезии животныхMidmarkVIP3000
шов 4-0Shanghai JinhuanKC439
RazorPritechLD-9987
GentamicinZhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd.Нет
0,9% раствор хлорида натрияHunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
PenicillinShanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd.Нет
БупренорфинТяньцзиньский фармацевтический научно-исследовательский институт Pharmaceutical Co., Ltd.Нет
параформальдегидаSigma-Aldrich16005Развести до конечной концентрации 10% в PBS
EDTASigma-AldrichE9884Развести до конечной концентрации 20% в PBS
0,1% раствор гематоксилина, Mayer' sSigma-AldrichMHS16
0,5% раствор эозина Y, спиртовойSigma-AldrichHT110116
Safranin OSigma-AldrichS8884
Fast GreenSigma-AldrichF7258
Shandon Excelsior ESTM Тканевый процессорThermo FisherA78400006
Shandon Histocentre™ 3 Встраивание тканей CenterThermo FisherB64100010
полностью автоматизированный ротационный микротомLeicaRM2255
DiDмолекулярные зонды, Life
Technologies		V-22887
D-MEM Высокий уровень глюкозыSigma-AldrichD5648
PBSGIBCO, Life Technologies14190-144
0,25% трипсин-ЭДТАинвитроген25200-114
10 см Чашка ПетриЦентрифуга Corning
BeckmanOptima MAX-TL
Флуоресцентный микроскопOlympusBX53
0,4% Трипановый синий растворSigma-Aldrich93595
TitetammeVirbac (Zoletil 50)1000000188
ЗолазепамVirbac (Zoletil 50)1000000188
Стерильный гипосермический шприц для одноразового использования 26GShanghai Misawa Medical IndustryNone
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkinElmer124262
Living Imaging 4.0 программное обеспечениеPerkinElmerNone
H43020455 V118877

Ссылки

  1. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  2. Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
  3. Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
  4. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27(2016).
  5. Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
  6. Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
  7. Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
  8. Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160(2016).
  9. Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
  10. Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22(2013).
  11. Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
  12. Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
  13. Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
  14. Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
  15. Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
  16. Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
  17. Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
  18. Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50(2015).
  19. Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005(2009).
  20. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
  21. Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
  22. Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
  23. Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
  24. Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
  25. Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4(2011).
  26. Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
  27. Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Флуоресцентная визуализация in vivoмечение клеток красителем DiDвнутрисуставная инъекциябиораспределение и персистенция клетокхирургическое индуцирование остеоартрита коленного суставаокрашивание гематоксилином и эозином и сафранином Осистема биолюминесцентной визуализациифлуоресцентный мембранный краситель
В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.